袁丹丹, 張偉國

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

L-纈氨酸產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體融合及抗高糖融合株的篩選

袁丹丹, 張偉國＊

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出一株抗高糖的融合株。以黃色短桿菌(B revibacterium flavum)NV 128和黃色短桿菌(B.f lavum)JV 16(Leu-Ile-M et-)為親本菌株,通過單滅活原生質(zhì)體融合、高糖梯度平板篩選及進一步的硫酸二乙酯(DES)誘變,獲得了一株L-纈氨酸高產(chǎn)菌NJ-237。同時研究了影響原生質(zhì)體形成、再生的3種重要條件(青霉素、酶和滲透壓穩(wěn)定劑),并確定了其最佳處理濃度和時間。該融合株經(jīng)7 L發(fā)酵罐培養(yǎng)72 h L-纈氨酸達到46.8 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為27.7%,比兩親株都有顯著提高。

L-纈氨酸;原生質(zhì)體融合;高糖抗性

支鏈氨基酸包括L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸,都屬于人體必需氨基酸,因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能在人類生命代謝中占有非常重要的地位。L-纈氨酸應(yīng)用范圍廣闊,在醫(yī)藥、食品和飼料等方面有著其它營養(yǎng)物質(zhì)不可替代的作用,尤其是在醫(yī)藥方面,如配制氨基酸輸液和其它治療藥物,近年來研究發(fā)現(xiàn),L-纈氨酸是一種治療高血壓特效藥——纈沙坦的原料,其需求量猛增[1]。

原生質(zhì)體融合(p rotop last fusion)是一種重要的基因組重組方法[2]。黃色短桿菌NV 128,α-氨基丁酸(α-AB)和γ-氨基丁酸 (γ-AB)抗性 ,培養(yǎng)條件粗放,可積累一定量的 L-纈氨酸;黃色短桿菌JV 16,培養(yǎng)條件較苛刻,但纈氨酸產(chǎn)量比NV 128要高。通過原生質(zhì)體融合可能達到優(yōu)勢互補,篩選到培養(yǎng)條件粗放但產(chǎn)酸水平又高的理想融合子,為纈氨酸產(chǎn)生菌育種開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 黃色短桿菌(B revibacterium f lavum)NV 128,作者所在實驗室篩選;黃色短桿菌(B revibacterium flavum)JV 16(Leu-Ile-M et-),作者所在實驗室保藏。

1.1.2 完全培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖5,牛肉膏 10,蛋白胨 10,NaCl 5,瓊脂 20。

1.1.3 基本培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖 20,(N H4)2SO41.5,KH2PO41,K2HPO4·3H2O 3,M gSO4·7H2O 0.1,M nSO4·4H2O 0.01,FeSO4·7H2O 0.01,VH 30μg/L,VB1100μg/L,尿素1.5,瓊脂 20。

1.1.4 種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖 25,(NH4)2SO45,KH2PO41,M gSO4·7H2O 0.5,玉米漿35,CaCO310。

1.1.5 NV 128發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖 125,(NH4)2SO440,KH2PO41,M gSO4·7H2O 0.5,玉米漿 12,V H 50μg/L,VB1100μg/L,CaCO330。1.1.6 JV 16發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖 125,(N H4)2SO440,KH2PO41,M gSO4·7H2O 0.5,玉米漿12,L-Ile 0.2,L-Leu 0.2,L-M et 0.2,V H 50 μg/L,VB1100μg/L,CaCO330。

1.1.7 高糖平板 基本培養(yǎng)基中加入適量葡萄糖。1.1.8 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基(mol/L) 完全培養(yǎng)基中加入NaCl 0.6,M gCl20.02,p H 7.0。

1.1.9 原生質(zhì)體再生液體培養(yǎng)基 不加瓊脂的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基。

1.1.10 高滲液(mol/L) NaCl 0.55,丁二酸鈉0.2,M gCl20.02,p H 7.0。

1.1.11 PEG溶液 PEG-6000質(zhì)量分數(shù) 35%,NaCl 0.3 mol/L,M gCl20.02 mol/L,p H 7.0。

1.1.12 蛋清溶菌酶溶液 高滲液配制的10 g/L的蛋清溶菌酶,用0.22μm細菌過濾器過濾除菌,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.13 青霉素溶液 將青霉素鈉(160萬單位)用生理鹽水配成50 U/m L備用,現(xiàn)配現(xiàn)用。完全、基礎(chǔ)和種子培養(yǎng)基均以質(zhì)量分數(shù)20%NaOH調(diào)p H至7.2,0.1 M Pa壓力下滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基以質(zhì)量分數(shù)20%NaOH調(diào)至p H7.2,0.07 M Pa壓力下滅菌8 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗結(jié)構(gòu)類似物融合親株NV 128的篩選將黃色短桿菌NV 12經(jīng)紫外線和DES逐級誘變,篩選出抗α-AB和γ-AB的融合親株NV 128。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備與再生 參考文獻[3]進行。

1.2.3 原生質(zhì)體的滅活 將上述NV 128原生質(zhì)體懸浮液放入60 ℃水浴鍋中維持 5、10、15、20、25、30 m in,分別取0.1 m L經(jīng)過適當稀釋后涂布于再生完全培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng)2～3 d,觀察原生質(zhì)體滅活效果[4]。

1.2.4 原生質(zhì)體融合 取兩親株原生質(zhì)體懸浮液各2 m L加入10 mL離心管中,離心洗滌兩次,加入4 m L質(zhì)量分數(shù)35%PEG溶液,再加入一定量CaCl2溶液使其終濃度達到0.01 mol/L,水浴保溫10 min,離心洗滌兩次棄上清,用等體積的高滲液懸浮,即為原生質(zhì)體融合細胞懸浮液。

1.2.5 融合株高糖梯度平板的篩選[5]取1 m L原生質(zhì)體融合細胞懸浮液加入到20 m L液體再生完全培養(yǎng)基中,32℃搖瓶培養(yǎng)6 h,取菌液經(jīng)適當稀釋涂布在高糖梯度平板上,培養(yǎng)2～5 d,觀察菌體生長情況,挑取在菌落稀少及幾乎空白區(qū)域所長出的少數(shù)菌落,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,選出高產(chǎn)融合株。然后再對融合株進行DES誘變,高糖梯度平板篩選,挑出高產(chǎn)株。

1.3 分析方法

1.3.1 p H的測定 采用精密p H試紙以及 PHS-3C精密p H計測定。

1.3.2 菌體生長 吸取菌液0.2 m L到5 mL濃度為0.25 mol/L HCl中,搖勻后測定A562nm值。

1.3.3 葡萄糖 采用SBA-40C多功能谷氨酸—葡萄糖生物傳感分析儀測定。

1.3.4 L-纈氨酸 紙上層析法、比色定量法[6]和氨基酸分析儀測定。

2 結(jié)果與討論

原生質(zhì)體的制備和再生受很多因素的影響,如菌體生理狀態(tài)、酶解前的預(yù)處理、酶的濃度與處理時間、滲透壓、酶解溫度、p H和再生培養(yǎng)基成分等,首先在實驗前測定細胞的再生率,否則就很難確定不能融合或融合率低是由于雙親原生質(zhì)體本來就無活性,還是由于融合條件不適合所致[7]。

2.1 青霉素處理濃度和時間的確定

2.1.1 青霉素處理濃度的確定 在溶菌酶處理前,加入一定量的青霉素進行前處理,青霉素能干擾細菌細胞壁的合成,致使細胞壁疏松,便于溶菌酶處理,從而縮短酶解時間,提高原生質(zhì)體的存活率[8]。圖1為青霉素濃度與親株對溶菌酶敏感性的關(guān)系,作用時間為2 h。

圖1 青霉素濃度與親株對溶菌酶敏感性的關(guān)系Fig.1 Effect of penicillin concentration on the sensitivity of parent strains to lysozyme

實驗結(jié)果表明,隨著青霉素濃度的增加,兩親株對溶菌酶的敏感性逐漸提高。經(jīng)過青霉素處理后的NV 128吸光度變化大,說明對溶菌酶敏感性比JV 16較高。對于菌體NV 128和JV 16,當青霉素濃度分別在0.5、1.0 U/m L時,對菌體生長沒有抑制作用且能提高菌體對溶菌酶的敏感性。

2.1.2 青霉素處理時間的確定 在確定青霉素濃度的條件下,測定了其處理時間與親株對溶菌酶的敏感性,由圖2可以看出,隨著青霉素處理時間的延長,親株NV 128從1.5 h開始吸光度無明顯變化,JV 16從2h開始吸光度也無明顯變化,說明其在1.5和2.0 h時兩親株對溶菌酶的敏感性已達最大,所以分別選取1.5、2.0 h為 NV 128和JV 16的最佳處理時間。

2.2 溶菌酶濃度和時間對原生質(zhì)體形成和再生的影響

2.2.1 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成與再生的影響

溶菌酶的用量關(guān)系到原生質(zhì)體的形成率與再生率,低質(zhì)量濃度的溶菌酶不利于原生質(zhì)體的形成,而高濃度的原生質(zhì)體會使細胞壁破壞太徹底,不利于原生質(zhì)體的再生,更高的質(zhì)量濃度還會使細胞膜系統(tǒng)受到破壞,細胞徹底溶解,適量的溶菌酶濃度對后續(xù)工作非常重要[9]。溶菌酶質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體形成率與再生率的關(guān)系如圖3所示。

圖2 青霉素處理時間與親株對溶菌酶敏感性的關(guān)系Fig.2 Effect of penicillin treatment time on the sensitivity of parent strains to lysozyme

圖3 溶菌酶質(zhì)量濃度與原生質(zhì)體形成率和再生率的關(guān)系Fig.3 Effect of lysozyme concentration on the rate of protoplast formation and regeneration

由圖3可知,隨著蛋清溶菌酶量的增加,原生質(zhì)體的形成率逐漸提高,繼續(xù)增加蛋清溶菌酶,原生質(zhì)體增加不明顯。在溶菌酶質(zhì)量濃度低時,原生質(zhì)體的形成率不足再生率較低;而在原生質(zhì)體增加不明顯時再生率達到最大。NV 128和JV 16溶菌酶處理最適濃度分別為1 g/L和2 g/L時,原生質(zhì)體再生率達到最大。

2.2.2 溶菌酶處理時間對原生質(zhì)體再生的影響確定適當?shù)拿附鈺r間,有利于原生質(zhì)體的再生。當形成的原生質(zhì)體到一定數(shù)量時,沒必要再增加時間,時間的延長會降低原生質(zhì)體的活性,再生率下降。實驗結(jié)果(圖4)表明,NV 128和JV 16酶解時間分別為6 h和8 h時,原生質(zhì)體再生率達到最大。

圖4 酶解時間與原生質(zhì)體再生率的關(guān)系Fig.4 Effect of enzymolysis time on the protoplast regeneration rate

2.3 原生質(zhì)體再生完全培養(yǎng)基中滲透壓穩(wěn)定劑NaCl濃度的確定

由于去除細胞壁的原生質(zhì)體對滲透壓非常敏感,只有處于高滲環(huán)境中才能避免吸水膨脹而破碎,所以整個操作過程都要保持高滲環(huán)境,而滲透壓過高也會使原生質(zhì)體收縮,使其活性降低。滲透壓穩(wěn)定劑NaCl濃度的確定也為再生液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)提供了條件。以NV 128為例,確定了再生完全培養(yǎng)基中NaCl的濃度,如圖5所示,當 NaCl濃度為0.6 mol/L時,原生質(zhì)體再生率最高。

圖5 滲透壓穩(wěn)定劑濃度與原生質(zhì)體再生率的關(guān)系Fig.5 Effect of osmotic stabilizer concentration on the protoplast regeneration rate

2.4 原生質(zhì)體滅活時間的確定

按1.2.3的方法滅活NV 128原生質(zhì)體,涂布平板。當水浴處理10 m in時,原生質(zhì)體恰好徹底滅活,所以選取10 min為最佳滅活時間。

2.5 抗高糖菌株的檢出

2.5.1 兩親株葡萄糖抗性臨界濃度的確定 融合子檢出前,首先對兩親株的葡萄糖抗性臨界濃度進行了測定。按葡萄糖濃度梯度制備一系列平板,從活化平板上刮取一環(huán)菌于生理鹽水中,制成菌懸液,涂布在高糖平板上,顯示NV 128和JV 16的糖抗性臨界濃度分別為200 g/L和180 g/L。

2.5.2 抗高糖融合子的檢出 按照1.2.5的方法首先挑取經(jīng)過原生質(zhì)體融合后在高糖梯度平板上長出的融合子,經(jīng)過初篩、復(fù)篩,篩選出一株纈氨酸高產(chǎn)融合株NJ-2;以此融合株為出發(fā)菌株經(jīng)過DES誘變篩選,篩選出一株纈氨酸高產(chǎn)菌NJ-237,葡萄糖抗性臨界濃度提高到240 g/L,其搖瓶產(chǎn)酸達到45.6 g/L。篩選結(jié)果如表1所示。

表1 融合株NJ-2經(jīng)DES誘變后融合株搖瓶產(chǎn)酸結(jié)果Tab.1 The yields of L-valine of several fusants derived from NJ-2 by DES treatment

2.5.3 親株及融合株7L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗 采用初糖125 g/L和硫酸銨12 g/L,連續(xù)流加葡萄糖的方式對兩親株及融合株進行7 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗。在發(fā)酵過程中,根據(jù)殘?zhí)菨舛?補加濃葡萄糖溶液,維持殘?zhí)?5～30 g/L;根據(jù)溶氧(DO)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速,以滿足菌體在各個階段的溶氧需求;自動流加濃氨水,使p H在發(fā)酵前期維持在6.8～7.0,中后期維持在7.1～7.2。兩親株和融合株所產(chǎn)總酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表2,菌體生長與纈氨酸產(chǎn)酸水平見圖6。

表2 7 L發(fā)酵罐親株及融合株L-纈氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化情況Tab.2 Glucose/valine conversion efficiency of parent strains and fusant in 7L fermenter

從表4和圖6的發(fā)酵結(jié)果可知,親株NV 128、JV 16和融合株NJ-237的產(chǎn)酸水平分別為34.2g/L、36.2 g/L和46.8 g/L;其糖酸轉(zhuǎn)化率分別為17.2%、20.7%和27.7%,融合株NJ-237的產(chǎn)酸水平和糖酸轉(zhuǎn)化率與親株相比均有較大幅度的提高,這說明本試驗所進行的原生質(zhì)融合育種是成功的。

圖6 親株及融合株的7 L罐發(fā)酵過程曲線Fig.6 Fermentation time courses of parent strains and fusant in 7 L fermenter

3 結(jié) 語

實驗中滲透壓穩(wěn)定劑沒有采用傳統(tǒng)的蔗糖和丁二酸鈉等有機物而采用NaCl,主要是因為有機物粘度大,不利于收集原生質(zhì)體,且較高濃度的有機物容易抑制菌體的生長。

通過實驗發(fā)現(xiàn)青霉素的前處理明顯縮短了酶處理的時間,再生培養(yǎng)基中M g2+的加入促進了菌落的生長速度,但沒有明顯增加再生率,其對再生率的影響需要進一步驗證。

單滅活原生質(zhì)體融合的頻率較高,介于雙滅活與全活之間[10]。融合株集中了兩親株的優(yōu)良性狀,具有α-AB和γ-AB高抗性而不帶缺陷型標記,產(chǎn)酸水平和糖酸轉(zhuǎn)化率有了明顯提高而培養(yǎng)條件粗放。

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Protoplast Fusion of L-Valine Producer and Screening of Fusants by Improving High-Glucose Tolerance

YUAN Dan-dan, ZHANG Wei-guo＊
(Key Lab of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A fusant which could be resistant to high concentration of glucose was screened by fusing protoplasts in this study. The L-valine overproducing fusant was derived from B revibacterium flavum NV 128 and JV 16(Leu-Ile-M et-),and was screened on high-glucose gradient plates by means of fusing the single inactivated protoplasts and diethylsulfate(DES)treatment.A t the same time,three different conditions(penicillin,lysozyme and osmotic stabilizer)affecting the formation and regeneration of protoplasts were studied and the optimum conditions were determined.Under the optimum conditions,the titer of L-valine achieved at 46.8g/L after 72h culture,and the yield of L-valine on glucose was 27.7%.

L-valine,protoplasm fusion,imp roving high-glucose tolerance

TQ 922

A

1673-1689(2011)04-0597-05

2010-06-30

國家863計劃項目(2008AA 02Z212)。

＊

張偉國 (1963-),男,江蘇張家港人,工學博士,教授,博士研究生導師,主要從事氨基酸生產(chǎn)菌種選育與發(fā)酵工藝研究。Email:zhangw g@126.com