李 雙, 王周平＊

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

上轉換Na YF4:Yb3+Er3+發(fā)光納米粒子制備及其生物功能化

李 雙1,2, 王周平＊1,2

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

采用水熱法制備了上轉換發(fā)光納米材料,并對其表面采用改良的 St?ber法包覆二氧化硅,進一步采用硅烷化試劑進行氨基化修飾,最后通過戊二醛交聯(lián)將親和素成功偶聯(lián)到納米粒子表面,制備了親和素生物功能化上轉化發(fā)光納米粒子。對制備的納米粒子及其表面功能化處理過程進行了熒光光譜、TEM,XRD,FT-IR表征。結果表明,功能化后的上轉換發(fā)光納米粒子與親和素成功結合,并保持了良好的上轉換發(fā)光特性,可應用于生物標記。

上轉換發(fā)光;納米粒子;生物功能化

生物分子中某些成分核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、氨基酸、蛋白質等含量的測定在科學研究中尤其重要,但其可供分析的信號較弱,要獲得高靈敏度的檢測,常常需借助外來的標記物獲得可測量的信號分析,這樣使生物標記已成為現(xiàn)代化學和生命科學的研究熱點之一。其中熒光分析方法由于靈敏度高,選擇性好,受外界因素影響較小,因此近年來從事熒光分析方法的研究較為深入。熒光分析法利用各種熒光探針與待測組分相連,以增大熒光量子產率,提高檢測的靈敏度。由于生物體系的特殊性和復雜性,為了能測定更多的生物活性物質,對選擇生物熒光探針上有較高的要求[1-2]。首先,熒光探針應當具有較好的光穩(wěn)定性,不易被光解或漂白,光譜特征突出,有良好的激發(fā)和熒光效率。其次,對待測生物體本身功能的影響要小,對所測量的生物活性反應敏感且無毒副作用。常用的熒光探針有熒光染料,量子點,稀土摻雜納米晶等等。

稀土摻雜的無機納米材料能夠通過多光子機制把長波輻射(近紅外光)轉換成短波輻射,發(fā)射出比激發(fā)光波長短的上轉換熒光。上轉換熒光材料具有高穩(wěn)定性,高靈敏性,無自身熒光,弱的激發(fā)散射光和等優(yōu)點,應用生物標記中,可以大大提高檢測靈敏度和線性范圍[3-5]。

作者以簡單的化學試劑通過水熱法在195℃的反應條件下制備45～55 nm粒徑的 NaYF4:Yb3+Er3+納米晶,然后采用 St?ber法修飾納米晶表面,使其包覆硅和氨基,并進一步通過戊二醛法與親和素交聯(lián),實現(xiàn)所制備上轉化發(fā)光納米粒子的表面生物功能化,更利于其在生物標記及分析檢測中的應用。

1 材料與方法

1.1 儀器

DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器:河南鞏義市予華儀器廠產品,用于納米粒子合成;KJ-300超聲波發(fā)生器:無錫市科潔電子設備有限公司產品,用于納米材料的制備和分散處理;5804R高速離心機:上海安亭科學儀器廠產品,用于納米粒子及生物功能化納米粒子離心分離;JEM 2100透射電鏡(TEM):日本JEOL公司產品,用于合成的納米粒子的形貌表征;D8 Advance型X-射線衍射儀:德國Bruker公司產品,用于熒光納米粒子的形貌表征;UV-2012 PCS型紫外可見分光光度計:尤尼科(上海)有限公司產品,用于測定納米粒子吸收光譜;F-7000熒光分光光度計(關閉內置光源,通過光纖外接一980 nm激光光源),日本 Hitachi公司產品,用于發(fā)光納米粒子的熒光光譜測定;Nicolet Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀,美國 Thermo Electron Co.產品,用于納米材料表面功能化基團的表征。

1.2 試劑

氧化釔,氧化鐿,氧化鉺(99.99%):均購自國藥集團化學試劑有限公司;硝酸,乙二胺四乙酸(EDTA),氫氧化鈉,氫氟酸,乙二醇,十六烷基三甲基溴化胺(CTAB),磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,異丙醇,氨水,正硅酸四乙酯(TEOS),無水乙醇,戊二醛,己二胺,無水醋酸鈉,氯化高鐵:分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),親和素:購自sigma公司;雙蒸水為實驗室自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 NaYF4:Yb3+Er3+納米晶的制備 參照文獻[7]并稍作修改。

1)取0.5 g Y2O3,0.035 g Yb2O3,0.085 g Er2O3置于燒杯中,加入5～7 m L濃硝酸加熱蒸干多余水份,加入1.36 g EDTA,5 m L超純水攪拌溶解,然后加入約0.5 g NaOH至溶液澄清,調節(jié) PH值至8.5,加水定容至8 mL備用。

2)上述儲備液在攪拌條件下加入 0.4 g CTAB,25 m L乙二醇,再逐滴加入3.0 m LHF,得到白色乳狀膠體。最后再加入5.5 m L濃硝酸,攪拌均勻后,轉移到50 mL帶聚四氟乙烯內襯的反應釜中,195℃反應24 h。

3)反應結束后,讓其在空氣中自然冷卻至室溫,棄上層液體,釜底的固體用熱水沖洗到燒杯中,超聲5 m in,然后靜置數(shù)分鐘,待固體沉淀至底部后,將上層液體倒掉,再加熱水超聲,重復3次。然后加乙醇超聲分散,并以4 800 r/min的轉速離心2 min,所得固體置于70℃烘箱干燥10 h,固體粉末即為NaYF4:Yb3+Er3+納米晶。

1.3.2 NaYF4:Yb3+Er3+表面功能化 采用改良的 St?ber法[8-9]:20 m g NaYF4:Yb3+Er3+納米晶在60 m L的異丙醇中超聲30 min,完全分散后在35℃攪拌條件下加入2.5 m L氨水和20 m L水。將25 uL TEOS溶于20 m L異丙醇中,逐滴加入上述溶液,攪拌4 h。再將200 uL APTES溶于30 m L異丙醇中,逐滴加入,攪拌1 h。離心分離沉淀,用無水乙醇清洗3次,在50℃烘箱內干燥12 h。

1.3.3 納米粒子和親和素的結合 利用戊二醛做為交聯(lián)劑將氨基化的納米粒子與親和素進行結合,制備了親和素修飾的上轉換發(fā)光納米粒子[10,11]。具體方法如下:

1)2 m g NaYF4:Yb3+Er3+納米晶超聲分散在體積分數(shù)5%戊二醛的PBS溶液中,至于搖床上室溫反應4 h;

2)用PBS(10 mmol/L,PH 7.4)離心分離清洗3次,洗去多余戊二醛;

3)再將納米晶分散在 PBS中,加入親和素(親和素與原納米晶之比為0.15 mg/m g),反應12 h;

4)用PBS清洗3次洗去未反應的親和素,沉淀的納米晶分散在1 mL PBS中。

1.3.4 納米粒子的表征 采用透射電鏡(TEM)對合成的NaYF4:Yb3+Er3+納米晶及二氧化硅包覆的NaYF4:Yb3+Er3+納米晶的形貌和大小進行表征;采用D8 A dvance型 X-射線衍射儀對所制備上轉換發(fā)光納米晶的組成及晶相進行表征;采用F-7000熒光分光光度計對所制備上轉換發(fā)光納米晶的熒光光譜進行測定;采用UV-2012 PCS型紫外可見分光光度計測定所制備納米粒子吸收光譜;采用紅外光譜對所制備氨基化的二氧化硅包覆上轉換發(fā)光納米晶構成進行表征;采用Nicolet Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀對所制備納米材料表面功能化基團進行表征。

2 結果與討論

2.1 NaYF4:Yb3+Er3+納米晶的表征

圖1為所制備 Na YF4:Yb3+Er3+納米晶的TEM圖,顯示利用水熱法制備的 Na YF4:Yb3+Er3+納米晶呈球形,粒徑約為(40±5)nm。水熱法制備的納米晶形態(tài)一致,大小較為均勻,具有良好的分散性。

圖1 NaYF4:Yb3+Er3+r納米晶的TEM圖Fig.1 TEM image of the prepared NaYF4:Yb3+Er3+upconversion nanocrystals

圖2(a)為所制備NaYF4:Yb3+Er3+納米晶的XRD圖譜,結果顯示所制備納米晶中既有立方相結構(α型,JCPDS卡號:77-2042)也有六方相結構(β型,JCPDS卡號:16-0334),是兩種形態(tài)混合的納米晶。

由圖2(b)可以看出,所制備上轉化 NaYF4:Yb3+Er3+發(fā)射了特征的可見綠色上轉換熒光。3個特征發(fā)射峰分別位于528、544和657 nm處,分別對應 Er3+離子的2H11/2→4I15/2(528 nm)、4S3/2→4I15/2(544 nm)和4F9/2→4I15/2(657 nm)躍遷[12]。

圖2 上轉換 NaYF4:Yb3+Er3+納米晶的 XRD圖及α-NaYF4,β-NaYF4標準卡(a)和發(fā)光光譜(b)Fig.2 XRD patterns of the NaYF4:Yb3+Er3+upconversion nanocrystalsand the standard data forα-NaYF4,β-NaYF4 asa reference(a),and the lum inescence spectra of NaYF4:Yb3+Er3+upconversion nanocrystals(b)

2.2 表面功能化 NaYF4:Yb,Er的表征

盡管乙二醇體系中所合成的納米晶具有親水性表面,但由于表面沒有可同生物識別物質(如氨基酸、多肽、抗原、抗體、核酸等)鍵合的活性官能團,生物分子將不能被偶聯(lián)到納米晶的表面,因而不能用于生物熒光標記,因此,必須對其表面進行功能化修飾。圖3是用St?ber法修飾后 SiO2包覆的納米晶,可以看到硅層厚度約為10 nm左右,納米粒子大小為(50±5)nm,證實SiO2已經均勻地包覆在納米粒子外層。包覆后的納米顆粒具有更好的水溶性,在水溶液中分散良好。

圖3 表面氨基化SiO2包覆的 NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶TEM圖Fig.3 TEM image of SiO2 capped NaYF4:Yb3+Er3+upconversion nanocrystals functionalized with-NH2 group

圖 4(a)是表面氨基功能化的 SiO2包覆NaYF4:Yb3+Er3+的紅外圖譜。結果顯示,在1 045 cm-1出現(xiàn)的強吸收譜帶屬于Si-O-Si的反對稱伸縮振動吸收,781 cm-1也是SiO2的特征峰。3 415 cm-1和1 660 cm-1的吸收峰是氨基中N-H鍵的伸縮振動和彎曲振動,2 933 cm-1是APTES中的亞甲基的伸縮振動。證實了納米晶在包覆SiO2時同時也連接了氨基。

實驗進一步對氨基化SiO2包覆Na YF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶的發(fā)光光譜進行了考察。(圖4(b))顯示,相對于NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶而言,氨基化SiO2包覆NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶的特征上轉化發(fā)光特性未發(fā)生改變,其3個特征發(fā)射峰仍分別位于528、544和657 nm處,表現(xiàn)為綠色熒光。

圖4 表面氨基功能化的SiO2包覆 NaYF4:Yb3+Er3+納米晶的紅外圖譜(a)和發(fā)光光譜(b)Fig.4 FT-IR spectra(a)and luminescence spectrum of SiO2 capped NaYF4:Yb3+Er3+ upconversion nanocrystals functionalized with-NH2 group

2.3 NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶與親和素的偶聯(lián)

氨基化SiO2包覆Na YF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶與親和素的偶聯(lián)是其進一步與生物素或生物素化生物分子結合的一個必要條件。按照實驗部分所述步驟將親和素與氨基化 SiO2包覆NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米晶表面的-NH2進行偶聯(lián),由于親和素在280 nm有吸收,而上轉換納米晶在紫外光區(qū)無特征吸收,所以可以用紫外分光光度法對上轉換納米晶與親和素結合情況進行表征。如圖5所示,圖5中a為親和素原液的紫外吸收譜圖,b為上轉換納米晶與親和素反應完成離心后的上清液?？梢钥吹?上轉換納米晶的上清液中親和素的量顯著減少,表明親和素與上轉換納米晶表面的-NH2連接成功。

圖5 親和素原液(a)以及親和素和氨基化的 NaYF4:Yb3+Er3+結合后離心所得上清液(b)的紫外可見吸收圖譜Fig.5 Absorption spectra of initial avidin solution(a)and supernatant after avidin conjugated amino-functionalized NaYF4:Yb3+Er3+nanoparticles(b)

3 結 語

采用水熱溶劑法,制備了NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米材料,隨后通過St?ber法表面SiO2包覆、氨基修飾,使其通過戊二醛交聯(lián)與親和素分子結合,實現(xiàn)了所制備NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米材料的表面生物功能化。TEM、XRD、熒光光譜、FT-IR、UV-vis圖譜表征結果顯示 NaYF4:Yb3+Er3+上轉換發(fā)光納米材料及其表面生物功能化均告成功,為其后續(xù)應用于生物標記和分析檢測奠定了基礎。

（References）：

[1]Bruchez M,Mo ronne M,Gin P,et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biologicallabels[J].Science,1998,281,2013-2016.

[2]Chan WCW,Nie SM.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science,1998,281,2016-2018.

[3]Vetrone F,Boyer JC,Capobianco JA,et al.Concentration-dependent near-infrared to visible upconversion in nanocrystalline and bulk Y2O3:Er3+[J].Chem Mat,2003,15,2737-2743.

[4]Yan RX,Li YD.Dow n/Up conversion in Ln(3+)-doped YF3nanocrystals[J].Adv Funct Mater,2005,15,763-770.

[5]楊奉真,衣光舜,陳德樸.納米NaYF4:Yb,Ho上轉換熒光粉的合成及其性質研究[J].高等學?；瘜W學報.2004,9(25),1589-1592.

YANG Feng-zhan,YI Guang-shun,CHEN De-pu.Synthesis and up-conversion luminescence properties of nanocrystal Yb,Ho Co-doped sodium yttrium fluo ride[J].Chem JChin Un iv,2004,9(25),1589-1592.(in Chinese)

[6]Gu H W,Zheng R K,Zhang X X,et al.Facileone-pot synthesis of bifunctional heterodimers of nanoparticles:A conjugate of quantum do t and magnetic nanoparticles[J].J Am Chem Soc,2004,126,5664-5665.

[7]Wang L,Li Y.Green upconversion nanocrystals for DNA detection[J].Chem Commun,2006,2557-2559.

[8]Mader HS,Link M,Achatz DE,et al.Surface-modified upconverting microparticles and nanoparticles for use in click chemistries[J].Chem Eur J,2010,16,5416-5424.

[9]Wang M,Hou W,M i C C,et al.Immunoassay of Goat Antihuman Immunoglobulin G Antibody Based on Luminescence Resonance Energy Transfer between Near-Infrared Responsive NaYF4:Yb,Er Upconversion Fluorescent Nanoparticles and Gold Nanoparticles[J].Anal.Chem,2009,81,8783-8789.

[10]Kong D,Quan Z,Yang J,et al.Avidin conjugation to up-conversion phosphor NaYF4:Yb3+Er3+by the oxidation of the oligosaccharide chains[J].J Nanopart Res,2009,11,821-829.

[11]Lu H,Yi G,Zhao S,et al.Synthesis and characterization of multi-functional nanoparticles possessing magnetic,up-conversion fluorescence and bio-affinity properties[J].JMater Chem,2004,14,1336-1341.

[12]Wang M,M i C C,Wang W X,et al.Immunolabeling and N IR-Excited Fluo rescent Imaging of HeLa Cells by Using NaYF4:Yb,Er Upconversion Nanoparticle[J].ACS Nano,2009,3(6),1580-1586.

Preparation and Biofunctionalization of NaYF4:Yb3+Er3+Upconversion Luminescent Nanoparticles

L IShuang1,2, WANG Zhou-ping＊1,2

(1.State Key Labo ratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Upconversion nanophosphors were prepared by a solvothermal method.Then the surface of the upconversion nanophosphors was capped with silica by a modified St?ber method.It was further treated with silane coup ling agent to modify amino groups onto the surface of the nanophospho rs.Finally,avidin was coup led onto the surface of the nanophosphors using glutaraldehyde as cross-linker.So,a avidin-functionalized upconversion nanophosphors was successfully prepared. The nanophosphors together with its functionalized process were characterized by transmission electron microscopy(TEM),X-ray diffraction(XRD),fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy,respectively. The results suggested that the functionalized nanophosphors have successfully conjugated with avidin and still keep its upconversion luminescence property.

upconversion luminescence,nanoparticles,biofunctionalization

＊

王周平(1974-),男,陜西寶雞人,教授,博士研究生導師,主要從事食品營養(yǎng)與安全研究。Email:wangzp@jiangnan.edu.cn

TL 271.5

A

1673-1689(2011)04-0506-05

2010-06-28

國家863計劃項目(2008AA 10Z419),教育部博士點基金新教師項目(20070295014),江蘇省自然科學基金項目(BK20081603)。