邱 斌, 劉 蓉, 鄧澤元＊, 范亞葦, 李 靜, 胡蔣寧, 黎 玉

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué),江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌 330047)

反式脂肪酸 Trans C18∶1誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的研究

邱 斌1, 劉 蓉1, 鄧澤元＊1, 范亞葦1, 李 靜1, 胡蔣寧1, 黎 玉2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué),江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌 330047)

通過檢測相關(guān)細胞凋亡指標,探討trans C18:1誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡機制。采用體外細胞培養(yǎng)方法將不同濃度trans C18∶1與內(nèi)皮細胞共同孵育后,通過吉姆薩染色,觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)變化;采用流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡變化;通過試劑盒檢測觀察trans C18:1對凋亡酶Caspase活力的影響;最后考察Caspase抑制劑z-VAD-fm k,對trans C18∶1對內(nèi)皮細胞存活率的影響。吉姆薩染色后,細胞呈典型的凋亡形態(tài);流失細胞儀檢測內(nèi)皮凋亡細胞的數(shù)量明顯增加;同時發(fā)現(xiàn)trans C18∶1引起內(nèi)皮細胞的凋亡可能與Caspase-3酶激活有關(guān),因為Caspase抑制劑又能提高trans C18∶1處理的內(nèi)皮細胞存活率。

反式脂肪酸;trans C18∶1;內(nèi)皮細胞;凋亡

反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA)是油脂或含有油脂的食品中常見的一個組成成分[1]。由于TFA會加速動脈粥樣硬化,容易誘發(fā)心血管和老年癡呆等疾病。因此,食品中的 TFA的形成已成為當前國際上的研究熱點[2]。人攝入 TFA后,會引發(fā)系統(tǒng)炎癥和內(nèi)皮功能改變,并進一步誘發(fā)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,但具體的機制目前仍不清楚。

研究表明,內(nèi)皮凋亡是血管損傷的重要作用機制,許多外界刺激均可誘導(dǎo)內(nèi)皮凋亡,并進一步導(dǎo)致血管滲漏,炎癥和血液凝固[3]。作者已發(fā)現(xiàn)transC18∶1會造成內(nèi)皮細胞損傷[4],現(xiàn)探討transC18∶1對內(nèi)皮細胞凋亡的影響,希望為研究 TFA引起的動脈粥樣硬化的發(fā)生機制提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株:南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供;trans C18∶1(反式-9-十八碳烯酸)、DM EM、胰蛋白酶M TT:Sigma公司產(chǎn)品;吉姆薩試劑盒:南京建成公司產(chǎn)品,酶標儀M K3:Thermo公司產(chǎn)品,Caspase-3試劑盒、Caspase廣譜抑制劑 z-VAD-fmk:Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒:南京凱基生物公司產(chǎn)品;流式細胞儀COUL TER EPICS XL:BECKM AN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng):取人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞細胞株復(fù)蘇,接種于50 m L培養(yǎng)瓶內(nèi),待生長鋪滿后,經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代,置于37℃、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換培養(yǎng)液,培養(yǎng)第3天分組。

1.2.2 吉姆薩染色 待細胞鋪滿90%以上時,棄去培養(yǎng)皿內(nèi)原培養(yǎng)液,用PBS沖洗3次后加吉姆薩染色液Ⅰ染液3～5滴,使其迅速蓋滿皿底,大約1 min后滴加試劑Ⅱ緩沖液5～10滴,輕輕搖動平皿,使染液充分混合均勻,5～10 min后用超純水迅速沖去多余染液,晾干后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 A nnexin V-FITC雙染法檢測細胞凋亡transC18∶1處理過的內(nèi)皮細胞用不含EDTA的胰酶消化,然后用PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/m in離心5 min)收集1-5×105細胞,加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞,加入5μL AnnexinV-FITC混勻后,再加入5μL Propidium Iodide混勻,室溫、避光、反應(yīng)5～15 min,在1 h內(nèi)進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.2.4 Caspase-3活性的檢測 按試劑盒說明操

作,胰酶消化收集trans C18∶1處理過的內(nèi)皮細胞并重懸于 Lysis Buffer(裂解液)中,冰上孵育 10 min,離心并收集上清液(胞漿提取液),加入含DDT的Reaction Buffer,再加5μL蛋白酶底物多肽37℃孵育4 h,在酶標儀405 nm處檢測光密度值。結(jié)果以檢測的A值表示。

1.2.5 Caspase抑制劑對內(nèi)皮細胞存活率的影響

將細胞以1×105/m L接種于96孔板中,每孔加入細胞懸液100μL,待細胞長到融合。分別設(shè)立空白對照組,trans C18∶1(200μmol/L)組,Caspase抑制劑 1.25、2.5、5μmol/L Caspase抑制劑組中都同時添加trans C18∶1(200μmol/L),10μmol/L Caspase抑制劑組不添加trans18∶1,每個濃度6個復(fù)孔。37℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24或48 h后,去除培養(yǎng)液,每孔加入0.5 mg/m L的M TT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去上清液,每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),震蕩使藍紫色結(jié)晶充分溶解,用酶標儀測定A490nm值。計算各濃度Caspase抑制劑對細胞存活率的影響。

1.3 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS for window s軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 trans C18∶1誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示,經(jīng)吉姆薩染料著色后的細胞核呈紫紅色,而細胞漿著色不明顯,呈淡紅色。對照組細胞輪廓清晰,呈多角形“鋪路石樣”排列;核居中,為圓形或橢圓形。經(jīng)200μmol/L trans C18∶1作用24 h后,胞質(zhì)明顯回縮,細胞間連接消失,胞體呈圓形;胞核濃縮深染,偏于一側(cè),部分核已破裂,呈現(xiàn)出凋亡細胞典型的形態(tài)學(xué)特征。

圖1 吉姆薩染色顯示內(nèi)皮細胞形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes shown by Gimersa staining

2.2 Annexin V-FITC法檢測trans C18∶1誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡

在細胞凋亡早期,位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酞絲氨酸(PS)遷移至細胞膜外側(cè)。Annexin V是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,與PS具有高度的結(jié)合力。因此,AnnexinV可以作為探針檢測暴露在細胞外側(cè)的PS。將AnnexinV標記上綠色熒光蛋白FITC,同時結(jié)合核酸染料 PI(活細胞未染)進行細胞雙染,可區(qū)分活細胞、凋亡及死亡細胞。圖2顯示,對照組出現(xiàn)少量凋亡細胞(圖 2(a));trans C18∶1組,早期凋亡率為16.73%(圖2(b)),比對照組有明顯增加。

圖2 trans C18∶1對內(nèi)皮細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of trans C18∶1 on apoptosis rate

2.3 trans C18∶1對Caspase-3活性的影響

Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,在細胞凋亡中起著不可替代的作用[5]。如圖3所示,Caspase-3活性可被 trans C18∶1激活,trans C18∶1(200μmol/L)與對照組相比Caspase-3活力有顯著升高(p<0.001)。

圖3 trans C18∶1對內(nèi)皮細胞Caspase-3活性的影響Fig.3 Effect of trans C18∶1 on the activity of Caspase-3

2.4 Caspase抑制劑對trans C18∶1處理的內(nèi)皮細胞存活率的影響

Caspase抑制劑對trans C18∶1處理的內(nèi)皮細胞存活率的影響結(jié)果見圖4。將Caspase抑制劑z-VAD-fm k加入培養(yǎng)基中,trans C18∶1作用24～48 h后,發(fā)現(xiàn)Caspase抑制劑預(yù)處理組的內(nèi)皮細胞存活率比僅trans C18∶1處理組明顯升高(p<0.001),且與對照組和單獨添加Caspase抑制劑相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖4 Caspase抑制劑對細胞存活率的影響Fig.4 Effect of Caspase inhibitor on cell viability

3 結(jié) 語

眾多研究表明[6-7],在細胞凋亡的過程中,Caspase家族在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中起著非常重要的作用,其中Caspase-3(胱氨酸蛋白酶-3)為關(guān)鍵的信息分子[8]。正常情況下,胞質(zhì)中Caspase-3(胱氨酸蛋白酶-3)以無活性、相對分子質(zhì)量約為32 000的前Caspase-3的形式存在。當細胞凋亡過程被啟動,凋亡信號傳導(dǎo)至Caspases時,可引起各種Caspases的“瀑布式”層層激活的蛋白酶級聯(lián)切割的過程,不同的蛋白酶分別切割 Caspase-3酶原,從而激活Caspase-3,活化的Caspase-3進一步又切割不同的底物,導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大,最終引起細胞凋亡[9]。而在此蛋白酶級聯(lián)切割過程中,Caspase-3處于核心位置,發(fā)揮重要的作用,因此被稱為死亡蛋白酶。

作者發(fā)現(xiàn),在反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮凋亡的過程中,Caspase-3活性顯著升高,表明 Caspase-3參與了內(nèi)皮細胞的凋亡。Caspase抑制劑可通過提高trans C18∶1處理的內(nèi)皮細胞存活率抑制內(nèi)皮的細胞凋亡。Michaela Artwohl發(fā)現(xiàn)硬脂酸通過激活Caspase誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡,并且 Caspase抑制劑可以完全抑制硬脂酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡[10],其結(jié)果和作者的研究結(jié)果一致。Yumi Kondoh發(fā)現(xiàn)transC18:1能夠激活 Caspase-3且部分激活Caspase-8,-9,誘導(dǎo)人肝癌細胞株(Hep G2)凋亡[11],說明死亡受體通路和線粒體通路均部分參與了transC18∶1誘導(dǎo)的 Hep G2細胞凋亡過程。TFA通過什么通路引起血管內(nèi)皮細胞的凋亡,需要進一步深入研究。

（References）：

[1]鄧澤元,周瀟奇,黃玉華,等.中國居民20年間食物脂肪酸攝入量調(diào)查分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008,27:7-19.

DENG Ze-yuan,ZHOU Xiao-qi,HUANG Yu-hua,et al.Investigation of dietary fatty acids intakes of Chinese people during twtenty years[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2008,27:7-19.(in Chinese)

[2]陳宜,張青齡,林叢,等.食品中反式脂肪酸的研究進展[J].食品科技,2009,16(5):25-28.

CHEN Yi,ZHANGQing-ling,L IN Cong,et al.Research progresson trans fatty acids in food[J].Cerealand food industry,2009,16(5):25-28.(in Chinese)

[3]Winn RK,Harlan JM.The role of endothelial cell apoptosis in in?ammatory and immune diseases[J].Thromb Haemost,2005,3:1815-24.

[4]邱斌,劉蓉,鄧澤元,等.反式C18:1對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報,2010,32:328-335.

Q IU Bin,L IU Rong,DENG Ze-yuan,et al.Effects of trans C18∶1 on endothelial injury[J].Acta Nutrimenta Sinica,2010,32:328-335.(in Chinese)

[5]Ostergard T,Hansen TK,Nyholm B,et al.Circulating ghrelin concentrations are reduced in healthy offsp ring of type 2 diabetic subjects and are inereased in Women independent of a family history of type 2 diabetes[J].Diabetologia,2003,46(1):134-136.

[6]Du HJ,Hui YN,Wang YS,et al.Caspase-3 activity during dauno rubicin induced human retinal pigment epithelineum cell apoptosis[J].Disi Junyi Daxue Xuebao,2001,22(7):609-611.

[7]Evan G,Littlewood T.A matter of life and cell death[J].Science,1998,281(5381):1317-1322.

[8]Duan H,Chinnaiyan AM,Hudson PL,et al.ICE-LAP3,a novelmammalian homologue of the caenorhabditis elegants cell death protein Ced-3 is activiated during Fas-and tumor necrosis factor-induced apoptosis[J].Biol Chem,1996,271(3):1621-1625.

[9]Enari M,Sakahira H,Yokoyama H,et al.A caspase-activated Dnase that degraded DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD[J].Nature,1998,391:43-50.

[10]A rtwohl M.,Lindenmair A,et al.Different mechanisms of saturated versus polyunsaturated FFA-induced apoptosis in human endothelial cells[J].J Lipid Res,2008,49(12):2627-2640.

[11]Yumi Kondoh,Teruo Kawada,Reiko Urade.Activation of caspase 3 in Hep G2 cells by elaidic acid(t18∶1)[J].Biochimica et Biophysica Acta,2007,17(71):500-505.

Apoptosis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by Trans C18∶1

QIU Bin1, LIU Rong1, DENG Ze-yuan＊1, FAN Ya-wei1,LI Jing1, HU Jiang-ning1, LI Yu2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The target of this study is to exoplore the apoptotic mechanism of endothelial cells through detecting relevanting apoptosis index.For this,EC were cultured with trans C18∶1 at different concentrations,then the morphological changes of endothelial cells were observed through giemsa staining.The apoptotic cells were detected by flow cytometry.The activity of caspase-3 was detected by spectrophotography after endothelial cells treated with trans C18∶1.The cell viability was measured by MTT after endothelial cells cultured with trans C18∶1 and caspase inhibitor for 24～48 h.Results:The number of apoptotic cells raised and endothelial cells displayed classical apoptotic morphology after endothelial cells cultured with trans C18∶1.The activity of caspase-3 ascended and the caspase inhibitor could protect endothelial cells from trans C18∶1.

trans fatty acids,trans C18∶1,endothelial cell,apoptosis

＊通信作者：鄧澤元(1963-),男,江西瑞金人,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事脂肪酸研究。Email:dengzy28@yahoo.com.cn

R 151.41

A

1673-1689(2011)04-0588-04

2010-08-26

國家自然科學(xué)基金項目(30972482),江西省學(xué)術(shù)帶頭人計劃項目(2008DD00900),教育部博士點基金項目(20070403002),江西省自然科學(xué)基金項目(2008GQY0023)。

邱斌(1982-),男,山東肥城人,食品科學(xué)與工程博士研究生,主要從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。Email:422083898@qq.com