亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        天冬氨酸酶的催化特性及應(yīng)用進(jìn)展

        2023-08-29 13:10:04賈振華黃媛媛
        河北省科學(xué)院學(xué)報 2023年4期
        關(guān)鍵詞:脫羧酶激活劑丙氨酸

        李 冉,賈振華,宋 聰,張 翔,黃媛媛

        (河北省科學(xué)院生物研究所,河北 石家莊 050051)

        天冬氨酸酶(aspartase,Asp),也稱天冬氨酸氨裂合酶(E.C.4.3.1.1),廣泛存在于大腸桿菌(Escherichiacoli)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、芽孢桿菌YM55-1(Bacillussp.YM55-1)等細(xì)菌中,在微生物氮代謝中發(fā)揮著重要作用[1-8]。天冬氨酸酶也是一種重要的生物催化劑,可用于L-天冬氨酸、β-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸衍生物的合成[9-11]。本文將圍繞天冬氨酸酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、催化機(jī)理及其在生物催化中的應(yīng)用綜述其研究進(jìn)展。

        1 天冬氨酸酶的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

        1.1 天冬氨酸酶的結(jié)構(gòu)

        天冬氨酸酶最早被發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中,大腸桿菌天冬氨酸酶(AspA)蛋白大小約200 kDa,以同源四聚體形式存在,由4個51 kDa的相同亞基組成,每個亞基包含3個結(jié)構(gòu)域,其C-末端由2個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋模體(helix-turn-helix motif)組成,模體的相對方向約為90°;中心結(jié)構(gòu)域由5個長的α-螺旋組成,占亞單位總殘基的一半以上;N-末端結(jié)構(gòu)域由1個短的雙鏈反平行β折疊和5個α-螺旋組成[12,13]。

        AspA與芽孢桿菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)、延胡索酸酶C(fumarase C,FumC)、腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADL)、精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ARL)屬于天冬氨酸酶/富馬酸酶超家族,均含有三段高度保守的氨基酸序列(XXSXNDXXXT、GXTXXQXAXP、GSSXXPXKXN)(圖1),其中一段保守序列(GSSXXPXKXN)所構(gòu)成的一個特殊的環(huán)(SS環(huán)),被證明是與底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)和活性中心[14-19]。

        圖1 天冬氨酸酶/富馬酸酶超家族保守氨基酸序列比對

        1.2 天冬氨酸酶的理化性質(zhì)

        大腸桿菌AspA對L-天冬氨酸有很強(qiáng)的底物專一性,需要Mg2+、Mn2+等金屬離子作為激活劑,在堿性條件下具有催化活性,在55 ℃和pH8.0條件下酶活性最強(qiáng),但熱穩(wěn)定性差,在55 ℃條件下30 min會失去酶活性[6,20,21]。中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)AspA的最適pH為8.0~8.5,最適溫暖為35 ℃,在45 ℃以下酶活性穩(wěn)定,需要Mg2+離子作為激活劑[22]。AspA是細(xì)菌在復(fù)雜培養(yǎng)基中以及厭氧、酸性和缺鐵離子條件下生長所必需的[23]。腸道細(xì)菌假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)的蛋白質(zhì)組學(xué)和 lacz 融合分析表明,在酸性條件下,其AspA表達(dá)量增加,添加天冬氨酸可以提高野生型菌株在酸性環(huán)境的存活率,但不能提高敲除AspA 基因的突變體菌株的存活率,表明天冬氨酸酶能夠催化天冬氨酸產(chǎn)生氨,來增加菌株在酸性環(huán)境中的存活率[24]。

        芽孢桿菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有熱穩(wěn)定性的天冬氨酸酶[4]。AspB在鹽酸胍存在下,有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,在65 ℃和pH8.0的條件下酶活性最強(qiáng)[4]。與大腸桿菌AspA相比,AspB有較高的對映體選擇性、廣泛的底物特異性,在堿性環(huán)境中不需要底物變構(gòu)和金屬離子的激活就具有催化活性,因此,AspB作為氨基酸合成的生物催化劑而備受關(guān)注。

        2 天冬氨酸酶的催化機(jī)理

        天冬氨酸酶的催化反應(yīng)遵循酸堿反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。酶活性位點(diǎn)的堿性離子首先從底物的C3原子中提取氫離子,形成的碳負(fù)離子穩(wěn)定的中間體,然后中間體崩解后底物的C—N鍵或C—O鍵斷裂,產(chǎn)生富馬酸鹽和相應(yīng)的次級產(chǎn)物。C—N鍵或C—O鍵斷裂是反應(yīng)的限速步驟,由酸促進(jìn),為離去基團(tuán)(NH3)提供質(zhì)子以形成銨離子[25-30]。

        圖2 天冬氨酸酶的催化反應(yīng)機(jī)制[28]

        動力學(xué)研究表明,AspA在堿性pH條件下的脫胺反應(yīng)表現(xiàn)出非米氏動力學(xué),在反應(yīng)達(dá)到動力學(xué)穩(wěn)態(tài)之前有一個停滯期,由此能夠推出AspA受到變構(gòu)活化。在催化反應(yīng)時,L-天冬氨酸和Mg2+會首先結(jié)合到不同于活性位點(diǎn)的單獨(dú)激活劑結(jié)合位點(diǎn),因此,L-天冬氨酸既作為底物,又作為AspA的激活劑[28]。許多研究涉及定點(diǎn)突變、化學(xué)修飾和基于機(jī)理的失活來鑒定AspA的重要催化殘基,有研究者推測第一個激活劑結(jié)合位點(diǎn)位于Cys430附近[16],也有研究者通過比較AspA和富馬酸酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu),推測第二個激活劑結(jié)合位點(diǎn)可能是位于短螺旋段的Gln129和Asn138[29],但是,至今沒有AspA與底物或產(chǎn)物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)被解析,以確定激活劑結(jié)合位點(diǎn)的位置。

        AspB酶的催化活性不需要受到變構(gòu)作用激活,Fibriansah等人[31]成功地解析了AspB與L-天冬氨酸復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),提供了天冬氨酸酶的底物結(jié)合活性位點(diǎn)的第一個詳細(xì)視圖。結(jié)果表明,AspB蛋白的Thr101、Ser140、Thr141和Ser319殘基與底物的β-羧酸基團(tuán)之間形成氫鍵,使底物形成高烯醇化物樣(aci-羧酸鹽樣)構(gòu)象。同時,SS環(huán)的構(gòu)象也發(fā)生變化,由開放構(gòu)象變?yōu)殚]合構(gòu)象,這種構(gòu)象變化提供了額外的底物結(jié)合,并在催化過程中保護(hù)底物不受溶劑的影響。SS環(huán)的閉合將Ser318靠近C3質(zhì)子的位置以實(shí)現(xiàn)質(zhì)子提取,將SS環(huán)的Ser318突變?yōu)锳la318會導(dǎo)致AspB活性完全喪失,表明Ser318對AspB的酶活性至關(guān)重要[31]。

        3 天冬氨酸酶在生物催化中的應(yīng)用

        3.1 天冬氨酸酶用于合成L-天冬氨酸

        L-天冬氨酸是合成人工甜味劑阿斯巴甜的重要起始化合物,也可作為氨解毒劑、肝機(jī)能促進(jìn)劑、疲勞恢復(fù)劑等醫(yī)藥品和添加劑用于各種清涼飲料的生產(chǎn),在醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前已發(fā)現(xiàn)多種具有天冬氨酸催化活性的菌株。Yukawa等人[32]在從短桿菌(Brevibacteriumgenus)中篩選到具有天冬氨酸酶活性的突變株,天冬氨酸酶的最適pH和最適溫度分別為9.3和54℃,需要Ca2+作為激活劑,在氨水堿性條件下能將10%的富馬酸轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。Suzuki等人[33]從土壤中分離出一株具有高天冬氨酸酶活性的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus),在65 ℃、pH9.5時能將800 mM富馬酸和氨離子轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸,轉(zhuǎn)化效率為85%。Patel等人[34]發(fā)現(xiàn)銅綠色假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中的AspA可將1 M富馬酸轉(zhuǎn)化生成0.39 mM L-天冬氨酸。Takahisa等人[35]在嗜冷性希瓦氏藻(Shewanellalivingstonensis)中表達(dá)大腸桿菌天冬氨酸酶AspA,在50 ℃處理后可使富馬酸轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸而不形成 L-蘋果酸,解決了在大腸桿菌中合成L-天冬氨酸會產(chǎn)生副產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸的問題。Liu等人[36]構(gòu)建了含順反式異構(gòu)酶(MaiA)和天冬氨酸酶(AspA)的雙酶系統(tǒng)的大腸桿菌工程菌,以順丁烯二酸為原料合成 L-天冬氨酸的方法,得到 L-天冬氨酸產(chǎn)量為419.8 g/L,轉(zhuǎn)化率為98.4%。

        固定化天冬氨酸酶能夠提高酶的溫度穩(wěn)定性,具有便于回收、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn),能夠有效降低生產(chǎn)成本。1973年,Chibata等人[37]利用聚丙烯酰胺、角叉菜膠將AspA及含有AspA的大腸桿菌菌體制成固定化酶和固定化細(xì)胞,提高了連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸的能力。Sato等人[38]用交叉菜膠固定含AspA的大腸桿菌細(xì)胞,與可溶性天冬氨酸酶相比,酶促反應(yīng)的Km值提高了5倍,最適pH由9.5降為8.5,最適溫度提高了5~10 ℃,具有更高的熱穩(wěn)定性。Cárdenas-Fernández等人[39]利用不同材料固定化芽孢桿菌AspB,可重復(fù)利用5次,酶活性及轉(zhuǎn)化效率均在90%以上。Ram等人[40]將中間氣單胞菌(A.mediaNFB-5)中的AspA在大腸桿菌中過表達(dá),結(jié)果表明均質(zhì)化固定化滲透性重組細(xì)胞(566 mg/g 濕細(xì)胞)比滲透性重組細(xì)胞(154 mg/g 濕細(xì)胞)產(chǎn)生更多的 L-天冬氨酸。Takahisa等人[35]利用海藻酸鈉固定化嗜冷性希瓦氏藻(S.livingstonensis)可重復(fù)使用9次,并且天冬氨酸產(chǎn)率高。

        3.2 天冬氨酸酶合成L-天冬氨酸衍生物

        L-天冬氨酸衍生物可作為手性中間體用于藥物的合成,利用天冬氨酸酶合成L-天冬氨酸衍生物是重要途徑,但因天冬氨酸酶有很強(qiáng)底物特異性,對廣譜化合物沒有活性,因此,通過定向改造天冬氨酸酶擴(kuò)大其底物催化范圍,從而獲得種類豐富的天冬氨酸衍生物成為研究的方向。Yumoto等人[41]對AspA進(jìn)行定點(diǎn)突變,將Lys327突變?yōu)锳sn327,使AspA能夠催化L-天冬氨酸-α-酰胺(β-天冬酰胺)的脫氨基反應(yīng),但反應(yīng)效率很低。Asano等人[42]篩選到一株AspA兩位點(diǎn)突變(C462T、A981T)菌株能夠催化富馬酸單酰胺和氨合成L-天冬氨酸-α-半醛。LI等人[43]利用生物信息學(xué)手段將AspB的活性位點(diǎn)突變?yōu)镃ys187、Ile321、Leu324、Ala326,突變后的菌株能夠催化300g/L 巴豆酸完全轉(zhuǎn)化為R-3-氨基丁酸。

        在天冬氨酸酶反應(yīng)中加入親核試劑也是一種降低其底物特異性,擴(kuò)大底物催化范圍的方法,Emery[44]發(fā)現(xiàn)羥胺可以作為一種替代親核試劑促進(jìn)AspA的催化反應(yīng)。Weiner等人[45]在 AspB的催化反應(yīng)中以羥胺作為親核試劑,再向富馬酸鹽中分別加入甲氧基胺、聯(lián)氨和甲胺,能夠分別產(chǎn)生L-羥基天冬氨酸、L-N-甲氧基天冬氨酸、L-2-肼基琥珀酸和L-N-甲基天冬氨酸。在這幾種衍生物中,L-羥基天冬氨酸由于穩(wěn)定性較差不易被分離,L-N-甲氧基天冬氨酸、L-2-肼基琥珀酸和L-N-甲基天冬氨酸均很穩(wěn)定且易于分離[45]。

        3.3 天冬氨酸酶合成β-丙氨酸

        β-丙氨酸是一種重要的中間體,在食品、飼料添加劑、醫(yī)藥、高分子材料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,以L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸脫羧酶為關(guān)鍵酶合成β-丙氨酸的研究較多。高宇等人[46]利用大腸桿菌AspA和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)α-脫羧酶panD,以富馬酸和氨水為底物合成β-丙氨酸(9.8 g/L)。Qian等人[47]將L-天冬氨酸脫羧酶(panD)的位點(diǎn)突變體后提高了催化穩(wěn)定性,與 L-天冬氨酸酶(AspA)偶聯(lián),以富馬酸為底物合成β-丙氨酸,產(chǎn)率為118.6 g/L,轉(zhuǎn)化率大于99%。Wang等人[48]采用三酶級聯(lián)法,將大腸桿菌AspA、枯草桿菌(B.subtilis)L-天冬氨酸脫羧酶基因BSADC和赤擬谷盜蟲(Triboliumcastaneum)L-天冬氨酸脫羧酶基因TCADC共表達(dá),實(shí)現(xiàn)了從富馬酸到β-丙氨酸的一鍋合成法,能夠得到200.3 g/L的β-丙氨酸,轉(zhuǎn)化率為90.0%。Ko等人[49]利用組成型啟動子表達(dá)AspA和panD強(qiáng)化了β-丙氨酸合成途徑,并利用該途徑實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中由葡萄糖合成丙烯酸的新生物合成途徑。α-丙氨酸是β-丙氨酸的同分異構(gòu)體,Liu等人[50]克隆了抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)的天冬氨酸-4-脫羧酶基因ArASD,其突變體(N35D)具有更高的催化效率和穩(wěn)定性,與大腸桿菌AspA構(gòu)建雙酶體系催化富馬酸合成α-丙氨酸,轉(zhuǎn)化率達(dá)97.1%。

        4 結(jié)論與展望

        對天冬氨酸酶的研究已有幾十年,關(guān)于它的酶學(xué)特性有了充分的研究,其催化機(jī)理也已被闡明。從嗜熱微生物中分離和鑒定出的天冬氨酸酶為工業(yè)化應(yīng)用提供了可能,但因其底物特異性,限制了可催化底物的范圍。因此,利用定點(diǎn)突變等方法對酶基因進(jìn)行改造來獲得更廣泛的可催化底物范圍、更穩(wěn)定的酶活和更高產(chǎn)的菌種成為研究的方向。天冬氨酸酶用于合成L-天冬氨酸及其衍生物、β-丙氨酸、L-精氨酸等已有較多研究,但還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),相信隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,以及市場需求的不斷增加,天冬氨酸酶的規(guī)?;瘧?yīng)用將會實(shí)現(xiàn)。

        猜你喜歡
        脫羧酶激活劑丙氨酸
        葡萄糖激酶激活劑治療2型糖尿病研究進(jìn)展
        無償獻(xiàn)血采血點(diǎn)初篩丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高的預(yù)防及糾正措施研究
        替羅非班與纖溶酶原激活劑治療PCI合并慢血流急性STEMI的臨床療效
        尤瑞克林與組織型纖維蛋白酶原激活劑治療急性腦梗死的療效評價
        丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶快速檢測在血站血液采集前應(yīng)用的意義研究
        沒食子酸脫羧酶及酶法制備焦性沒食子酸研究進(jìn)展
        右旋糖酐對草酸脫羧酶的修飾研究
        二水合丙氨酸復(fù)合體內(nèi)的質(zhì)子遷移和氫鍵遷移
        聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測酒酒球菌氨基酸脫羧酶基因
        相分離法在丙氨酸分離中的應(yīng)用
        日本午夜精品理论片A级APP发布| 久久久久人妻精品一区二区三区| 久久婷婷五月国产色综合| 亚洲日韩v无码中文字幕| 久久精品国产亚洲AV高清特级| 日本一级淫片免费啪啪| 日本刺激视频一区二区| 日本岛国视频在线观看一区二区| 精品一区二区三区婷婷| 久久精品国产亚洲av麻豆色欲| 日出水了特别黄的视频| 久久久亚洲欧洲日产国产成人无码| 日韩精品一区二区三区中文9| 粉嫩人妻91精品视色在线看| 美女内射毛片在线看免费人动物| 午夜男女爽爽爽在线视频| 亚州AV无码乱码精品国产| 91成人自拍视频网站| 日出白浆视频在线播放| 亚洲爆乳精品无码一区二区| 伊人久久综在合线亚洲不卡| 免费在线观看视频专区| 喷水白浆视频在线观看| 成人精品视频一区二区三区尤物 | 欧美情侣性视频| 素人激情福利视频| 国产的自拍av免费的在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久中文字幕 | 国产私人尤物无码不卡| 国产精品jizz视频| 日韩欧美在线播放视频| 国产精品第一区亚洲精品| 曰韩无码av一区二区免费| 亚洲日韩精品欧美一区二区 | 中文人妻AV高清一区二区| 国产福利一区二区三区在线观看 | 国产午夜亚洲精品国产成人av| 国产激情久久久久影院老熟女免费| 久久国产国内精品对话对白| 你懂的视频网站亚洲视频| 国产成人a在线观看视频免费|