程曉霞　朱小麗　王　劭　陳仕龍　林鋒強(qiáng)　李兆龍　陳少鶯

摘要 從臨床表現(xiàn)呼吸困難并伴有啰音、肺部和支氣管黃色干酪樣栓塞為特征的病雞肝脾肺混合勻漿中分離到1株病毒(YD株),該病毒能凝集雞紅細(xì)胞并能被AIV H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制,對(duì)熱不穩(wěn)定且對(duì)熱敏感;對(duì)雞胚和番鴨胚的最小致死量分別為10-7和10-6,其MDT分別為78h和70h;雞胚尿囊液毒的HA效價(jià)和EID50明顯高于番鴨胚尿囊液毒;能擴(kuò)增出大小約為1 027bp的特異性目的片段。結(jié)果表明,該分離毒為H9亞型禽流感病毒。

關(guān)鍵詞 H9亞型禽流感病毒;分離;鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739(2009)13-0303-03

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)屬正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒。禽流感又稱(chēng)真性雞瘟或歐洲雞瘟,被國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)列為A類(lèi)傳染病。AIV H9亞型為低致病性禽流感病毒,主要引起禽類(lèi)產(chǎn)蛋量下降,肉雞和蛋雞的復(fù)合型呼吸道疾病乃至死亡,可使養(yǎng)禽業(yè)產(chǎn)生重大損失。

2007年11月,福建省某雞場(chǎng)發(fā)現(xiàn)80～90日齡的大雞出現(xiàn)精神萎頓、羽毛松亂、食欲減退、呼吸困難并伴有啰音為特征的病例,并很快地傳染給小雞,2 000羽雞1周內(nèi)連續(xù)死亡200羽。死亡雞病理剖檢可見(jiàn)肺部和支氣管里有許多黃色干酪樣栓塞,部分死亡雞支氣管剖開(kāi)有白色分泌物。通過(guò)病毒分離、電鏡觀察、血清學(xué)和RT-PCR鑒定確定為H9亞型禽流感病毒,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)胚及動(dòng)物

番鴨胚、雞胚、30日齡無(wú)母源抗體雛雞等均來(lái)自非疫區(qū)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及單克隆抗體

抗新城疫病毒(NDV)陽(yáng)性血清購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所;抗減蛋綜合征(EDSV76)陽(yáng)性血清和抗H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所?？剐鲁且卟《?NDV)單抗和抗雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)單抗均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試驗(yàn)試劑

TriZol LS Reagent,RNasin,M-MLV購(gòu)自Invitrogen公司,rTaq聚合酶、dNTPs、pMD18-T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自大連寶生物工程公司。

1.4 病毒分離

1.4.1 病料采集及處理。無(wú)菌采集死亡雞的心、肝、脾、肺、腎,剪碎研磨,以Hanks液制成1∶5勻漿,加雙抗各1 000U,4℃過(guò)夜,凍融3次,7 000rpm離心10min,取上清液供接種病料。

1.4.2 病毒分離。取處理的病料上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚3枚,0.1mL/枚,37℃孵化,觀察2次/d,棄去24h內(nèi)的死胚,收取24～120h的死胚或活胚,置4℃過(guò)夜后,收獲雞胚尿囊液,并觀察胚胎病變。

1.5 血清學(xué)鑒定

1.5.1 間接免疫熒光抗體(IFA)試驗(yàn)。取死胚的心臟冷凍切片,冷丙酮固定后,按常規(guī)方法[1]用抗NDV和IBDV單抗進(jìn)行間接熒光抗體試驗(yàn)。

1.5.2 血凝價(jià)(HA)測(cè)定。參照Allan等[2]的報(bào)道,測(cè)定雞胚尿囊液的HA價(jià)。

1.5.3 血凝抑制試驗(yàn)(HI)。用4個(gè)血凝單位的分離毒(第3代胚液毒)分別與抗新城疫、抗EDSV76 和AIV H5、H7、H9等標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清,按微量法進(jìn)行HI試驗(yàn)[3]。

1.6 分離毒生物學(xué)特性

1.6.1 血球凝集(HA)試驗(yàn)。采集小白鼠、鴿、鴨和雞的紅細(xì)胞,按常規(guī)方法進(jìn)行HA試驗(yàn)。

1.6.2 血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn)。將第3代胚液毒(YD3)分裝于滅菌離心管,于56℃水浴分別作用0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min,測(cè)定各自的HA效價(jià)。

1.6.3 耐熱性試驗(yàn)。將第3代胚液毒分裝于滅菌離心管,于50℃水浴分別作用10min、20min、30min、60min,60℃水浴分別作用10min、20min、30min后,分別接5枚非免疫雞胚,37℃培養(yǎng),收集雞胚尿囊液測(cè)定HA效價(jià)。

1.6.4 對(duì)雞胚、番鴨胚的ELD50和最小致死量平均死亡時(shí)間(MDT)的測(cè)定。將分離毒用Hanks液作連續(xù)10倍倍比稀釋,每個(gè)稀釋度接種4枚9日齡雞胚或12日齡番鴨胚,0.1 mL/枚,37℃孵化,棄去24h內(nèi)的死胚,以后每2h照蛋1次,記錄胚胎死亡情況,按Karber氏法計(jì)算ELD50。根據(jù)文獻(xiàn)計(jì)算全部胚胎死亡的最高稀釋度MDT[4]。

1.7 RT-PCR鑒定

1.7.1 病毒RNA的提取。取感染AIV H9N2雞胚尿囊液250 μL,加入750μL TriZol LS Reagent RNA提取液,混勻,室溫放置15min,加入200μL氯仿,振蕩混勻,4℃ 12 000rpm離心15min,取上清加入500μL異丙醇,室溫放置10min后12 000rpm離心10min,棄上清,75%乙醇除鹽,倒置濾紙上吸掉剩余液體,干燥后懸于25μL的DEPC水中,備用。

1.7.2 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)禽流感M基因全長(zhǎng)序列,用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物如下:上游引物P1為5′-AGCAAAAGCA GGTAGATG-3′,下游引物P2為5′-AGTAGAAACAAGGTA GTTTTTTAC-3′,以上引物由大連寶生物TAKARA公司合成。

1.7.3 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。①RT采用20μL體系,在PCR反應(yīng)管中分別加入7μL已制備的RNA,加入1μL下游引物(20pmoL),70℃熱吸附10min,冰浴10min,繼續(xù)加入5×First Standing Buffer 4μL,10mM dNTPs 2μL,0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)5U/μL,0.25μL RNA酶抑制劑(40U),用無(wú)RNA酶水調(diào)至總體積20μL,瞬時(shí)離心混勻。反應(yīng)程序:30℃ 10min,42℃ 60min,99℃ 5min。②M基因的擴(kuò)增用50μL體系。以制備好的cDNA 2μL作模版,加入相應(yīng)的上、下游引物(20pmoL)各1μL,2.5mM dNTPs 4μL,10×Buffer 5 μL,rTaq 1μL,滅菌水36μL,反應(yīng)體系50μL。在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性 5min,然后94℃ 變性1min、53℃ 變性1min、72℃延伸2min,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。結(jié)束后取PCR產(chǎn)物4μL,在1%瓊脂凝膠上電泳檢查,然后在紫外燈下觀察結(jié)果,自動(dòng)凝膠成像掃描儀拍照及處理。

1.8 人工感染試驗(yàn)

將分離毒雞胚尿囊液毒原液經(jīng)腿肌注射30日齡雛雞3羽,每羽0.5mL;另取3羽,注射生理鹽水,每羽0.5mL,隔離飼養(yǎng)。觀察發(fā)病情況和臨床癥狀,并從病死雞中進(jìn)行病毒分離或測(cè)定耐過(guò)雞血清抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

雞胚接種病料96h后開(kāi)始死亡,死胚的胚體呈彌漫性充血、出血,其HA效價(jià)為27。連續(xù)盲傳3代,病毒增殖趨于穩(wěn)定,接種分離毒36h開(kāi)始死亡,其HA效價(jià)為29。分離毒按Karber氏法計(jì)算對(duì)雞胚的ELD50為10-5.5。

2.2 血清學(xué)鑒定

2.2.1 IFA試驗(yàn)。死胚心臟冷凍切片,經(jīng)抗NDV和IBDV單抗染色后,均未發(fā)現(xiàn)有熒光病灶。

2.2.2 血凝抑制試驗(yàn)(HI)。分離毒的血凝特性能被AIV H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制,但不被新城疫、減蛋綜合征和AIV H5、H7標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制。

2.3 分離毒生物學(xué)特性

2.3.1 血球凝集(HA)試驗(yàn)。分離毒YD3對(duì)小白鼠、鴿、鴨和雞的紅細(xì)胞均有凝集作用。其HA效價(jià)為小白鼠27、鴿29、鴨27、雞28。

2.3.2 血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn)和耐熱性試驗(yàn)。該分離株在56℃水浴處理10min,其HA效價(jià)下降2個(gè)滴度;在60℃處理30min后,具有HA效價(jià)的雞胚數(shù)下降2枚。表明該分離株對(duì)熱不穩(wěn)定性。

2.3.3 ELD50和MDT的測(cè)定。雞胚尿囊液毒的HA效價(jià)和雞胚半數(shù)感染量明顯高于番鴨胚尿囊液毒;分離毒對(duì)雞胚和番鴨胚的MDT分別為78h和70h,其最小致死量分別為10-7和10-6。

2.4 RT-PCR鑒定

從分離毒的雞胚尿囊液中擴(kuò)增出1 027bp片段。

2.5 人工感染試驗(yàn)

3羽30日齡雛雞經(jīng)腿肌注射分離毒后,在20d觀察期內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)異常。血清HI抗體測(cè)定結(jié)果表明,攻毒前HI為陰性,攻毒10d后抗H9亞型HI均在28以上。

3 結(jié)論與討論

從肺部有黃色干酪樣栓塞和支氣管有白色分泌物的病死雞肝、脾、肺、腎中分離到1株病毒,經(jīng)鑒定為H9亞型禽流感病毒,命名為AIV-YD株。該分離毒AIV-YD具有血凝活性,并能被AIV H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制,但不被新城疫、減蛋綜合征和AIV H5、H7標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制。生物學(xué)試驗(yàn)表明:該分離毒具熱不穩(wěn)定性且對(duì)熱敏感;分離毒在雞胚尿囊液的HA效價(jià)和雞胚半數(shù)感染量明顯高于番鴨胚尿囊液;雞胚和番鴨胚的MDT分別為78h和70h;而且分離毒YD3對(duì)雞胚和番鴨胚的最小致死量分別為10-7和10-6;PCR結(jié)果表明,所擴(kuò)增出的片段大小約為1 027bp,與預(yù)期長(zhǎng)度相符。這些結(jié)果表明分離毒為H9亞型禽流感病毒。

陳伯倫等[5]于1994年首次從雞中分離到了AIV H9 亞型。Alexander[6]認(rèn)為目前H9亞型流感病毒廣泛存在于家禽中,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅,而1997年香港“禽流感”事件之后Peiris等[7]從類(lèi)似流感癥狀的病人中分離到H9N2亞型流感病毒。近年來(lái)AIV H9 亞型對(duì)全世界的威脅已經(jīng)越來(lái)越嚴(yán)重,應(yīng)引起廣大學(xué)者的重視。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 程由銓,林天龍,胡奇林,等.雛番鴨細(xì)小病毒病分離與鑒定[J].病毒學(xué)報(bào),1993,9(3):228-235.

[2] LANG G,FERGUSON A E,CONNELL M C,et al.Isolation of an unidentified hernagglutination from the respiratory tract of turkeys[J].Avian Dis,1964(8):495-504.

[3] ALLAN W H,GAUG R E. A standard hemagglutination inhibitton test for Newcastle disease:(1)A comparison of micro and micro methods[J].Vet Rec,1974(95):120-123.

[4] ALEXANDER D J. Newcastle Disease In:A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens[M].Iowa:Kendall/Hunt Pubilshing Company,1989.

[5] 陳伯倫,張澤紀(jì),陳偉斌.雞A型流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1994,20(10):3-5.

[6] TAISUKE H,YOSHIHIRO K. Andemic threat pose by avain influenza A virus[J].Clinical Microbiology Reviews,2001(14):126-149.

[7] JOHNSON N P,MUELLER J. Updating the accounts:global mortality of the 1918-1920“Spanish”influenza Pandemic[J].Bull Hist Med,2002(76):105-115.