摘要：寧夏枸杞在生長過程中極易遭受各種各樣的蟲害，植物脂氧合酶（LOX）是生物合成抗蟲植物激素茉莉酸的關(guān)鍵酶，脂氧合酶可能與植物抗蟲緊密相關(guān)，參與植物誘導(dǎo)型防御。為了探討枸杞LOX基因家族的分子特征和表達模式，以枸杞為研究對象，通過在全基因組水平對枸杞LOX基因家族成員進行鑒定，并對該基因家族成員的蛋白理化性質(zhì)、保守基序、染色體定位、系統(tǒng)進化、差異表達及順勢作用元件進行分析。結(jié)果表明，從枸杞全基因組中共鑒定出13個LOX家族成員，該家族成員包含773～924個氨基酸，蛋白相對分子量為87 729.75～104 405.08 u，等電點為5.42～7.58，脂溶指數(shù)為83.55～89.87，61%的LOX基因定位于細胞質(zhì)。將枸杞的LOX家族基因與擬南芥及其他4個物種的LOX基因共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)枸杞LOX基因家族共分為2個亞家族，且部分枸杞的LOX基因與擬南芥LOX基因間的進化關(guān)系較近；13個枸杞LOX基因不均勻地分布在6條染色體上，其中6號染色體分布得最多。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，不同LOX基因在枸杞不同器官中的表達不同，大多數(shù)枸杞基因在莖尖、青果、雌蕊、新葉中顯著表達，推測這些基因可能在枸杞生長成熟過程中起作用。qPCR結(jié)果顯示，大多LOX基因?qū)Ψ强剐灾仓旮用舾?，在非抗性植株中，LOX基因總體上對有生物脅迫的處理組更敏感；在抗性植株中的表現(xiàn)則相反，表明不同LOX基因在不同脅迫、不同抗性植株中的表達具有特異性。

關(guān)鍵詞：寧夏枸杞；LOX基因家族；鑒定；差異表達；癭螨

中圖分類號：S188+.1；S567.1+90.1" 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0083-11

收稿日期：2024-03-27

基金項目：寧夏自然科學(xué)基金（編號：2023AAC03314）。

作者簡介：楊子君（1998—），女，云南曲靖人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：18388860713@163.com。

通信作者：王翠平，副研究員，主要從事枸杞遺傳育種方面的研究。E-mail：wangcuiping@nmu.edu.cn。

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是茄科枸杞屬多年生落葉灌木，主要分布在西北地區(qū)的戈壁灘或鹽堿地，具有重要的生態(tài)價值［1］。枸杞子富含多糖、礦物質(zhì)、甜菜堿、類胡蘿卜素等，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用食物，具有抗衰老、抗疲勞、降血糖、抗氧化等功效［2］。寧夏枸杞枝葉生長迅速，枝葉幼嫩，營養(yǎng)豐富，因此極易遭受多種病蟲的危害。危害寧夏枸杞的害蟲種類繁多，主要有枸杞癭螨、枸杞木虱、枸杞蚜蟲、枸杞薊馬和枸杞紅癭蚊等。近年來，隨著枸杞栽培規(guī)模的不斷擴大，其病蟲害的發(fā)生規(guī)模和危害程度也在不斷提升，病蟲害已經(jīng)成為制約枸杞產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要限制因素之一。

脂氧合酶（LOX）是一種含有非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，屬于氧化還原酶類，它能催化不飽和脂肪酸氧化分解為飽和脂肪酸［3-4］。當(dāng)植株個體受到脅迫刺激時，植物體中的LOX可以在不飽和脂肪酸的協(xié)助催化下，經(jīng)由一系列生物化學(xué)反應(yīng)，形成茉莉酸（JA）及其衍生物，然后生成生理活性物質(zhì)，進而誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生防御，最終激活植物的抗性反應(yīng)。LOX作為植物脂肪酸代謝路徑中的關(guān)鍵酶，在對植物器官生長、果實成熟、油脂氧化的調(diào)節(jié)及生物和脅迫的信號傳遞中都起到了至關(guān)重要的作用［5］。例如，擬南芥ATLOX1基因?qū)γ撀渌帷⒉≡那秩径急容^敏感［6］。在番茄中，番茄脂氧合酶基因tomLOXD可以作為促進茉莉酸產(chǎn)生的信號分子，從而提升番茄防御基因的表達水平，增強番茄的抗性［7］。在煙草中，NtLOX1基因的缺失有可能會降低煙草植株對病菌的抗性［8］。在馬鈴薯中，當(dāng)葉片被某種致病細菌侵染后，POTLX3基因的表達量會呈現(xiàn)上升的趨勢［9］。隨著植物基因組測序技術(shù)的進展，不同物種的LOX基因被連續(xù)地分析和報道［10-13］。在對水稻基因組的研究中，發(fā)現(xiàn)了16個LOX基因，而在中黃13大豆基因組中鑒定出36個LOX基因家族成員，在高粱基因組中則發(fā)現(xiàn)了11個LOX基因，在擬南芥中共鑒定出6個LOX基因家族成員，根據(jù)亞油酸或亞麻酸被氧化時反應(yīng)位點的不同，可以將其劃分為9-LOX、13-LOX這2個亞家族［14-17］。其中9-LOX亞家族基因主要在種子、器官及果實發(fā)育中發(fā)揮作用［18-19］。13-LOX亞家族基因則在植物生長發(fā)育及其抗逆反應(yīng)中發(fā)揮作用［20-22］。在對玉米的基因研究中發(fā)現(xiàn)，ZmLOX10是玉米中與抗蟲害有關(guān)的重要基因，直接參與玉米的生物防御［23］。通過對水稻種子胚的研究發(fā)現(xiàn)，在水稻種子胚中OsLOX1基因與水稻植株的抗蟲性密切相關(guān)［24］。

目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的大部分枸杞品種抗病蟲能力較差，對病蟲害的防治一直沿用化學(xué)方法，雖然能夠取得一定效果，但是化學(xué)農(nóng)藥的大量使用會帶來一系列生態(tài)問題。因此，選育具有抵御蟲害特性的新品種枸杞是防治枸杞害蟲最有效、最安全的手段。篩選枸杞抗蟲相關(guān)基因，可為抗蟲新品種的選育提供理論依據(jù)，對于枸杞抗蟲分子育種具有重要意義。基于此，本研究在全基因組范圍內(nèi)篩選枸杞LOX基因家族，分析家族保守結(jié)構(gòu)域、啟動子結(jié)構(gòu)區(qū)，并鑒定不同癭螨抗性的枸杞品種中LOX基因的器官差異表達模式和癭螨蟲害誘導(dǎo)下的基因表達模式。預(yù)計本研究結(jié)果可為進一步研究LOX基因在植株生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中的作用、克隆與功能等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用寧夏枸杞（L. barbarum）和黑果枸杞（L. ruthenicum Murr.）無性系于2018年定植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞科學(xué)研究所蘆花臺枸杞種質(zhì)資源圃（38°64′N，106°15′E），按照常規(guī)栽培管理。2022年6月選擇生長健壯、長勢良好的植株，取枸杞不同部位及果實不同發(fā)育時期的樣品，每個重復(fù)樣品取3株植株，各重復(fù)采集3次；抗性枸杞品種中科1號（L. barbarum Zhongke1）和易感枸杞品種寧杞8號（L. barbarum Ningqi 8）無性系定植于青銅峽枸杞種質(zhì)基地（38°20′N，106°56′E）。2022年6月，分別取未遭受癭螨蟲害和遭受癭螨蟲害的幼嫩葉片，每個重復(fù)樣品分別從3株植株上取樣，各重復(fù)采集3次。材料采集后立即置于液氮中速凍，存于 -80 ℃ 冰箱備用。

1.2 枸杞LOX基因家族的鑒定

分別通過TBtools軟件中的GXF Sequences Extract和Batch Translate CDS to Protein 功能，從已有的枸杞基因組數(shù)據(jù)中提取出所有編碼序列（CDS），將其翻譯成蛋白質(zhì)序列。再通過Tbtools軟件中的ID simplify去除正負鏈。然后，用TBtools軟件中的several sequences to a Big File［commonly used］功能，雙向比對找到枸杞的LOX基因序列，共獲得13個LOX序列。通過NCBI-CDD、SMART 2個在線網(wǎng)站驗證，進一步去除不含有LH2結(jié)構(gòu)域的序列并刪掉重復(fù)、冗余序列，最終獲得13個LOX序列，用于后續(xù)分析。

1.3 枸杞LOX蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測

將驗證過的枸杞LOX蛋白序列提交至在線軟件，用WOLF PSORT網(wǎng)站（https：//wolf psort. Hgc. jp/）和https：//www. Genscript. com/wolf-psort. Html對13個枸杞的LOX蛋白序列進行理化性質(zhì)與亞細胞定位預(yù)測分析。

1.4 枸杞LOX蛋白的保守基序分析

用MEME在線工具進行Motif分析，將鑒定好的枸杞LOX序列上傳至MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/），使用Motif Discovery功能預(yù)測枸杞LOX蛋白家族的保守基序，其中最大motif數(shù)設(shè)置為10個，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.5 枸杞LOX蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

用MEGA軟件將鑒定到的枸杞LOX蛋白序列與擬南芥LOX蛋白序列進行多水平的序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，通過ITOL在線工具對系統(tǒng)進化樹進行進一步美化和修飾。

1.6 枸杞LOX基因的染色體定位

根據(jù)枸杞基因組注釋GFF格式文件中提供的位置信息，將所有13個LOX基因定位到相應(yīng)染色體上。利用TBtools軟件中的Gene Location Visualize from GFF/GTF繪制染色體定位圖。

1.7 枸杞啟動子順式作用元件分析

用TBtools的Simple Bio Sequence Viewer模塊對基因的順式作用元件進行測定。用TBtools中的GFF3/GTF Sequence Extractor模塊截取基因上游2.0 kb的啟動子序列，利用在線網(wǎng)址Plant Care數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對相關(guān)順式調(diào)控元件進行預(yù)測分析，對于分析后的數(shù)據(jù)進行整理，保留需要的響應(yīng)元件，再將整理后的數(shù)據(jù)提交到TBtools進行可視化分析。

1.8 枸杞總RNA的提取、文庫的構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測序及反轉(zhuǎn)錄

用植物總RNA提取試劑盒（RNA Prep Pure Plant Kit）分別提取黑果枸杞、寧杞1號枸杞植株不同發(fā)育時期、不同組織部位及中科1號、寧杞1號枸杞植株有癭螨、無癭螨葉片的總RNA，并用Nano-500分光光度計檢測RNA純度（D260 nm/D280 nm），通過Qubit（恒斐生物科技有限公司，上海）對RNA濃度進行精確定量，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，待樣品檢測合格后，將部分樣品送到北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，后續(xù)分析便基于此測序結(jié)果，剩余部分樣品則用于反轉(zhuǎn)錄及定量試驗分析。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）去除gDNA并制備cDNA，將反應(yīng)得到的cDNA于-80 ℃保存，使用時需要將cDNA稀釋20倍。

1.9 qPCR分析LOX基因差異表達模式

利用在中科1號、寧杞8號枸杞植株葉片上感染癭螨與未感染癭螨的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及黑果枸杞、寧杞1號枸杞植株不同部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對枸杞LOX家族基因的表達量進行了分析，用Tbtools軟件中的heatmap繪制枸杞不同植株、不同組織的LOX基因家族表達熱圖。

表達模式分析根據(jù)枸杞LOX基因的CDS，使用NCBI中的Primer-blast工具進行引物設(shè)計，引物序列見表1。使用熒光定量PCR儀進行qPCR檢測。PCR反應(yīng)體系為20 μL。以枸杞Actin基因為內(nèi)參，相對表達量的計算采用2-ΔΔCT方法［25］。通過Origin 2021將定量分析結(jié)果與不同枸杞植株葉片是否感染癭螨繪制成雙Y軸柱狀-點線圖。反應(yīng)體系如下：10 ng/μL模板cDNA 2 μL，10 μmol/L正、反向引物各1 μL，2×TransTaq HiFi PCR Super MixⅡ 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。熔解曲線分析過程：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞LOX基因家族的鑒定和蛋白理化性質(zhì)分析

本研究從枸杞全基因組中共鑒定到13個LOX基因家族成員，所編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為773～924個，預(yù)測的蛋白相對分子量為87 729.75～104 405.08 u。LOX 蛋白家族成員的理論等電點（PI）介于5.42～7.58之間，等電點平均值為6.12，其中Lba03g03083、Lba05g01585的等電點大于7.0，呈堿性，其余11個枸杞LOX蛋白的等電點小于7.0，呈酸性。13個基因編碼的蛋白均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)大于30），平均疏水性（GRAVY）都為負值，表明它們均為親水性蛋白，脂溶指數(shù)介于83.55～89.87之間。通過WOLF PSORT進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示有8個LOX基因定位于細胞質(zhì)，分別為Lba07g01470、Lba03g03083、Lba06g02440、Lba06g02439、Lba07g01467、Lba05g01585、Lba06g02438、Lba09g01923；2個LOX基因定位于細胞核，分別為Lba09g00701、Lba06g02441；3個LOX基因定位于葉綠體，分別為Lba02g00304、Lba05g01588、Lba02g00307（表2）。以上結(jié)果表明，枸杞LOX家族成員亞細胞定位具有多樣性，有利于枸杞LOX家族成員在調(diào)控植物生長發(fā)育中不同功能的分化。

2.2 枸杞LOX蛋白保守基序分析

用MEME在線工具分析LOX蛋白家族包含的保守基序，結(jié)果（表3）表明，共獲得10個保守基序，分別命名為motif 1～motif 10，10個保守基因序列的長度不一，其中motif 10基序長度最短，motif 1～motif 4及motif 7長度都為50。13個枸杞LOX蛋白家族所包含的motif數(shù)目及種類存在一定差異，所有的枸杞LOX家族成員都含有1～10個不等的保守基序motif，13個LOX 家族成員包含的motif 1～motif 10的比例有所差異。其中，motif 1的第3、25、34、35位的亮氨酸在枸杞LOX蛋白中高度保守，motif 5的第2、4、6、24、38、39位的甘氨酸在枸杞LOX蛋白中高度保守，motif 10的第6、7、9、12、24位的精氨酸在枸杞LOX蛋白中高度保守。由此推測，motif 1、motif 5、motif 10在枸杞LOX蛋白中發(fā)揮重要作用，具有類似保守基序的LOX基因在功能上具有相似性（圖1）。在13個枸杞 LOX 蛋白序列中鑒定出10個保守基序，這些基序長度從26到50個氨基酸不等（表3）。其中，Lba02g00304蛋白沒有保守基序2、4，Lba09g01923、Lba06g02439蛋白多了1個保守序列19，其余10個枸杞LOX蛋白均含有 1～10個保守基序，且它們的排列順序基本一致，表明LOX基因在枸杞中高度保守（圖2）。

2.3 枸杞LOX蛋白系統(tǒng)進化分析

為了明確枸杞LOX基因家族成員與其他物種中已知的LOX家族成員的進化關(guān)系，本研究以寧夏枸杞LOX家族為研究對象，通過與其他5個物種的34個LOX蛋白氨基酸序列比較，確定其與其他植物L(fēng)OX的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果（圖3）顯示，LOX家族在進化樹上可劃分為9-LOX、13-LOX這2大類，13-LOX亞族可進一步細分為Ⅰ型、Ⅱ型。枸杞的13個LOX家族蛋白中，屬于9-LOX亞家族的有8個（Lba06g02438、Lba06g02439、Lba06g02441、Lba09g01923、Lba09g00701、Lba07g01467、Lba07g01470和Lba06g02440），屬于TypeⅡ13-LOX亞家族的有5個（Lba05g01588、Lba05g01585、Lba03g03038、Lba02g00307和Lba02g00304）。其中，Lba05g01588、Lba05g01585、Lba03g03038這3個基因與擬南芥ATLOX3、ATLOX3、ATLOX3位于同一分支，Lba02g00307和Lba02g00304與ATLOX3在同一支，剩余8個基因與ATLOX1、ATLOX5在同一分支。上述結(jié)果說明，枸杞LOX基因家族成員與擬南芥LOX基因家族成員的進化關(guān)系較近，推測2個物種LOX基因可能具有相似功能。

2.4 枸杞LOX家族成員的染色體定位分析

為了探究LOX基因家族的在染色體上的分布情況，通過TBtools軟件對其進行染色體定位。由圖4可見，在枸杞的6條染色體上13個LOX基因不均勻分布，其中Chr03上有1個基因，在Chr06染色體上分布的基因最多，分別是Lba06g02438、 Lba06g02439、

Lba06g02440、Lba06g02441，說明這4個基因之間可能有重復(fù)串聯(lián)。

2.5 枸杞LOX基因啟動子順式作用元件分析

啟動子順式作用元件在起始因子轉(zhuǎn)錄開始過程中發(fā)揮著重要作用，在基因的表達調(diào)控中也具有重要作用。為了進一步了解LOX基因的生物學(xué)功能，利用枸杞LOX基因啟動子上游2.0 kb序列，通過在線網(wǎng)站PlantCARE預(yù)測順式作用調(diào)控元件。由

圖5可見，枸杞LOX基因啟動子區(qū)域存在很多與轉(zhuǎn)錄、光響應(yīng)、非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件。此外，還發(fā)現(xiàn)了與激素信號途徑有關(guān)的元件，如茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、生長素（IAA）。其中，32個LOX基因有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，22個LOX基因有脫落酸響應(yīng)元件，7個LOX基因有水楊酸響應(yīng)元件，7個LOX基因有生長素響應(yīng)元件。上述結(jié)果表明，大部分枸杞LOX基因可能參與到JA、ABA介導(dǎo)的信號通路中。預(yù)測還發(fā)現(xiàn)，有些元件可能參與非生物脅迫，如低溫脅迫與無氧，與低溫有關(guān)的元件有13個，與無氧有關(guān)的元件有31個（表4）。此外，預(yù)測結(jié)果還表明，幾乎所有LOX基因都包含與光響應(yīng)相關(guān)的元件。

2.6 枸杞LOX家族的基因表達分析

為了解枸杞LOX基因家族在不同枸杞品種不同組織的表達情況，根據(jù)寧夏枸杞、黑果枸杞不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用TBtools軟件繪制表達模式熱圖，對枸杞LOX基因的表達情況進行分析。圖6中結(jié)果顯示，LOX基因在黑果枸杞的青果、新葉中的表達量較高，其中Lba03g03083、Lba02g00307在新葉中的表達量較高，Lba07g01467、Lba07g01470、Lba06g02440在青果中的表達量較高，Lba05g01585在雌蕊中的表達量較高，Lba06g02439在雄蕊中的表達量較高，Lba09g01923在老葉中的表達量較高，Lba06g02441、Lba02g00304主要在莖尖表達。在寧杞1號枸杞中，LOX基因在雌蕊、新葉、莖尖中的表達量最高，其中Lba05g01588主要在雌蕊中表達，Lba06g02440主要在青果中表達量較高，Lba09g00701在新葉、莖尖的表達量較高，Lba02g00304在老葉中的表達量較高，Lba09g01923在成熟果中的表達量較高，Lba06g02438在雄蕊中的表達量較高。上述結(jié)果說明，枸杞LOX基因具有組織的表達特異性，對枸杞成熟有一定調(diào)控作用。

2.7 不同抗性枸杞植株在生物脅迫處理下LOX基因的表達分析

為了探尋可能與枸杞癭螨抗性相關(guān)的LOX基因，對不同抗性的枸杞感染癭螨條件下枸杞的LOX基因的誘導(dǎo)表達模式進行了分析，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與qPCR結(jié)果驗證繪制雙Y軸柱狀-點線圖。圖7中結(jié)果顯示，LOX基因在抗性枸杞品種中科1號、易感枸杞品種寧杞8號感染癭螨與未感染癭螨條件下具有不同的表達模式。在寧杞8號感染癭螨的枸杞植株中，Lba06g02441、Lba02g00304這2個基因的相對表達量最高；Lba05g1585、Lba05g1588、Lba09g01923、Lba06g02438基因在未感染癭螨的寧杞8號枸杞植株中的表達量較高。在中科1號感染癭螨枸杞植株中，Lba06g02439、Lba02g00307這2個基因有較高表達量；Lba07g01467、Lba07g01470、Lba09g00701、Lba06g02440、Lba03g03083基因在未感染癭螨的中科1號枸杞植株中的表達量最高。上述結(jié)果說明，對于不同抗性枸杞植株來說，LOX基因具有不同表達模式，同時對于有無生物脅迫，不同LOX基因也表達出了不同模式。Lba06g02440、Lba07g01467、Lba03g03083、Lba07g01470、Lba09g00701、Lba06g02439、Lba02g00307基因?qū)剐澡坭街仓旮用舾校鳯ba06g02441、Lba02g00304、Lba05g01585、Lba05g01588、Lba09g01923、Lba02g02439基因?qū)Ψ强剐澡坭街仓旮用舾?，Lba06g02441、Lba02g00304、Lba06g02439、Lba02g00307基因?qū)τ谏锩{迫更加敏感，其他基因?qū)τ谏锩{迫敏感度很低或幾乎不敏感。在中科1號植株中，Lba06g02440、Lba07g01470、Lba09g00701、Lba06g02439這4個基因在感染癭螨后表達量明顯升高；在寧杞8號枸杞植株中，Lba05g01588、Lba09g01923這2個基因在感染癭螨后的表達量也有較明顯的上升。qPCR分析基因的相對表達量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的趨勢基本一致。

3 討論

LOX基因廣泛存在不同植物中，不同植物中LOX基因家族成員數(shù)目不同。目前，研究人員分別在擬南芥、水稻、花生、高粱、大豆、梨、番茄等植物中發(fā)現(xiàn)6、14、36、11、36、107、14個LOX成員［26-30］。本研究在全基因組范圍內(nèi)對枸杞LOX基因家族成因進行鑒定，共獲得13個LOX基因。通過對枸杞LOX蛋白的理化性質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸長度差異很大，大多數(shù)枸杞LOX蛋白家族成員不穩(wěn)定。LOX蛋白家族成員為親水性蛋白，59%的pI大于7，表明大多數(shù)LOX蛋白在自然生理條件下呈堿性。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，大多數(shù)枸杞LOX蛋白位于細胞質(zhì)中，說明其主要在細胞質(zhì)上行使功能，這與汪美佳對槲樹LOX蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果［31］一致。

本研究利用生物信息學(xué)方法，通過對枸杞基因組的鑒定分析，共篩選出13個LOX枸杞基因家族成員，它們不均勻地分布于6條染色體上。利用亞細胞定位軟件對13個基因進行了初步預(yù)測，該預(yù)測可以為LOX基因的功能預(yù)測提供一些線索。定位結(jié)果表明，LOX基因廣泛分布于枸杞植株內(nèi)，除了細胞質(zhì)外，還有一部分存在于細胞核、葉綠體上。Lba09g00701、Lba06g02441基因位于細胞核上，Lba02g00304、Lba05g01588、Lba02g00307基因定位于葉綠體上，其他LOX家族成員均定位于細胞質(zhì)中。該結(jié)論可通過后續(xù)試驗對其進行亞細胞定位，對其關(guān)鍵基因進行進一步試驗驗證。對于LOX基因而言，它在不同組織細胞中可能會有不同的功能表達。例如在對馬鈴薯LOX基因家族的研究分析中發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯LOX基因定位于細胞質(zhì)中，且該基因主要對馬鈴薯塊莖的生長發(fā)育起到調(diào)控作用［32］。在前期的生物信息學(xué)分析中，將鑒定的13個枸杞LOX基因與擬南芥、馬鈴薯、野生煙草、紅花煙草、

楊樹共44個LOX基因通過MEGA構(gòu)建進化樹，并借鑒擬南芥LOX基因家族的分類標(biāo)準(zhǔn)將其分為9-LOX、13-LOX這2個大的亞家族。結(jié)果表明，在進化樹中，枸杞大多數(shù)LOX基因與ATLOX5基因聚在一起。而在植物綠葉形成揮發(fā)性化合物的過程中，ATLOX5起到了重要作用。因此，推測定位于細胞質(zhì)中的枸杞LOX基因在枸杞植株的生長發(fā)育及對脅迫的響應(yīng)調(diào)控過程中也可能也會通過形成揮發(fā)性的物質(zhì)來發(fā)揮其功能，9-LOX亞家族的Lba0g00701與ATLOX1聚類結(jié)果相近，這說明這幾個基因可能對枸杞植株側(cè)根發(fā)育有一定影響［33］。但是，最終結(jié)果尚需通過轉(zhuǎn)基因植株進行驗證。

基因表達熱圖分析結(jié)果顯示，枸杞LOX基因在油棕中雌蕊、雄蕊、新葉、老葉、青果、成熟果和莖尖中均有不同程度的表達，具有不同的組織表達模式，其中Lba03g03083、Lba07g01467、Lba06g02439基因分別在黑果枸杞新葉、青果、雄蕊中有較高水平表達，推測這些基因可能參與黑果枸杞果實發(fā)育。Lba05g01588、Lba06g02440、Lba09g00701、Lba06g02438基因分別在寧杞1號枸杞的雌蕊、青果、新葉、雄蕊中具有較高表達量，推測這些基因可能與寧杞1號枸杞的生長發(fā)育有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，LOX基因也可參與其開花、發(fā)育和外界脅迫誘導(dǎo)的植株個體衰老等多個生理過程［34-35］。下一步可通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)驗證其基因功能。

本研究根據(jù)基因結(jié)構(gòu)域，將枸杞LOX基因家族成員分為3組。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果揭示了與LOX基因相關(guān)的典型結(jié)構(gòu)域，例如LH2、Lipoxygenase。13個枸杞LOX基因家族成員在其結(jié)構(gòu)中至少具有這些結(jié)構(gòu)域之一，這與李志遠等對煙草和楊樹的研究結(jié)果［36-37］相似。

通過順式作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)LOX基因有可能在多個生物過程中起到調(diào)控作用。在對枸杞的13個LOX基因進行的分析中，共檢測到36個光響應(yīng)元件、32個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、22個脫落酸響應(yīng)元件、7個水楊酸反應(yīng)響應(yīng)元件、7個生長素應(yīng)答元件、13個低溫響應(yīng)元件、31個無氧響應(yīng)元件。順勢作用元件分析結(jié)果表明，13個LOX基因在枸杞生長發(fā)育及對脅迫的防御過程中有著不可或缺的作用，但是最終結(jié)論還需要通過試驗來進一步驗證。有研究發(fā)現(xiàn)，LOX基因可參與調(diào)節(jié)植物對一系列生物、非生物脅迫的響應(yīng)，這與本研究結(jié)論相似［38］。因此，枸杞植株的生長發(fā)育及對脅迫的防御反應(yīng)可能與LOX基因?qū)に匦盘柾返奶禺愋越閷?dǎo)調(diào)控有關(guān)。在植株體內(nèi)，茉莉酸途徑、水楊酸途徑主要響應(yīng)病原菌的入侵［39］。雖然兩者對不同類型病原菌均有響應(yīng)，但已有的研究結(jié)果顯示，茉莉酸、水楊酸在對病原菌侵入的防御過程中具有協(xié)同作用［40］。枸杞LOX基因具有水楊酸、茉莉酸2種信號傳導(dǎo)途徑的響應(yīng)應(yīng)答元件，表明枸杞LOX基因具有抗菌活性。

4 結(jié)論

本研究從枸杞樣本中識別出了13個LOX基因，并且所有檢測到的枸杞LOX蛋白中都包含LH2的結(jié)構(gòu)域。此外，經(jīng)過鑒定，枸杞LOX家族的成員被劃分為9-LOX、13-LOX這2個子家族，其中 13-LOX 進一步可以被分類為TypeⅠ、TypeⅡ這2個子家族。通過對表達模式的分析，發(fā)現(xiàn)部分LOX家族成員在組織表達上具有特異性。在枸杞中，大部分LOX家族的成員都對不同的抗性枸杞植株及是否受到生物脅迫的處理作出了反應(yīng)，并且LOX家族成員含有與光響應(yīng)、激素調(diào)節(jié)、脅迫等多方面有關(guān)的作用元件，枸杞LOX家族成員可能在植物防御反應(yīng)中具有重要作用。研究結(jié)果可為抗蟲基因的克隆和基因功能驗證奠定基礎(chǔ)。

致謝：

感謝北京林業(yè)大學(xué)陳金煥教授提供寧夏枸杞不同器官以及果實不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。

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