摘要：GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)等多個(gè)生物過程中發(fā)揮重要作用?；в螅ˋmorphophallus konjac）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，目前尚無關(guān)于花魔芋GRAS家族基因的相關(guān)報(bào)道。采用生物信息學(xué)手段對花魔芋GRAS家族基因進(jìn)行全基因組鑒定與功能分析，通過RNA-Seq解析了花魔芋GRAS家族基因響應(yīng)非生物和生物脅迫脅迫的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，花魔芋有51個(gè)GRAS家族成員，劃分為8個(gè)亞家族。該家族編碼的蛋白由144～850個(gè)氨基酸組成，分子量介于15 789.78～90 823.32 u之間，等電點(diǎn)在4.94～11.19之間，大部分AkGRAS編碼蛋白為酸性不穩(wěn)定蛋白。順式作用元件分析顯示AkGRAS基因的啟動子區(qū)富含激素、干旱和低溫等逆境響應(yīng)元件。RNA-seq結(jié)果表明，多個(gè)亞家族基因成員響應(yīng)干旱、鹽脅迫和軟腐病原菌侵染表達(dá)。且PAT1亞家族基因AkGRAS35、AkGRAS19、AkGRAS40在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，AkGRAS41顯著下調(diào)表達(dá)；AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS35、AkGRAS51在軟腐病原菌侵染下上調(diào)表達(dá)，AkGRAS8和AkGRAS46下調(diào)表達(dá)。推測PAT1亞家族基因在花魔芋高鹽脅迫和軟腐病原菌侵染應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：花魔芋；GRAS家族基因；逆境響應(yīng)；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：Q943.2；S632.301" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0040-14

收稿日期：2024-11-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31860057）；云南省基礎(chǔ)研究專項(xiàng)面上項(xiàng)目（編號：202401AT070002）；安康市科技計(jì)劃（編號：AK2022-NY-04）；安康學(xué)院專項(xiàng)計(jì)劃（編號：2023AYKCYZ05）；曲靖師范學(xué)院博士創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃。

作者簡介：李竹梅（1988—），女，云南騰沖人，博士，講師，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：lizhume@163.com。

通信作者：褚洪龍，博士，副教授，從事植物抗逆生理、植物與微生物互作研究。E-mail：chuhonglo@163.com。

GRAS是一類在植物中起著重要調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子家族，其名稱來源于3個(gè)典型家族成員赤霉素不敏感（GAI）、赤霉素不敏感抑制因子（RGA）和稻草人（SCR）。GRAS家族蛋白一般含有400～770個(gè)氨基酸殘基，這些蛋白的編碼通常由非保守的N末端基序和高度保守的C末端基序組成［1］。GRAS蛋白的N末端包含固有無序區(qū)（IDR），即非折疊區(qū)，使得GRAS蛋白被歸類為固有無序化蛋白（IDPs）［2］。IDRs序列在溶液狀態(tài)下不形成穩(wěn)定的二級或三級結(jié)構(gòu)，但在遇到合適的配體時(shí)會折疊成有序結(jié)構(gòu)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能調(diào)節(jié)。其中C末端基序中包含了一系列高度保守的結(jié)構(gòu)域，如亮氨酸七肽重復(fù)序列Ⅰ（LHRⅠ）、VHIID、亮氨酸七肽重復(fù)序列Ⅱ（LHRⅡ）、PFYRE和SAW。VHIID（其中V為纈氨酸，H組氨酸，I為異亮氨酸，D為天冬氨酸）結(jié)構(gòu)域位于LRⅠ和LRⅡ結(jié)構(gòu)域之間，是這些保守結(jié)構(gòu)域中的核心結(jié)構(gòu)域，在蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用中起著重要作用［3］。Hirsch等根據(jù)GRAS蛋白結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，將其分類為8個(gè)亞家族，分別為LISCL、DELLA、PAT1、HAM、LS、SCR、SHR和SCL3［4］。

目前GRAS家族己經(jīng)在水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹（Populus przewalskii Maxim.）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、甜瓜（Cucumis melo）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、蘋果（Malus pumila）等多個(gè)物種中被鑒定研究［1，5-11］。不同物種之間由于GRAS蛋白序列N末端的長度和序列不同，GRAS家族成員數(shù)量和亞族存在著較大的差異。在水稻、玉米、花生、獼猴桃、蘋果、楊樹、擬南芥中分別有60、49、64、173、88、78、106、34個(gè)GRAS基因。在獼猴桃、玉米以及花生中，GRAS基因家族分類為8個(gè)不同的亞家族；在蘋果中，GRAS基因家族劃分為11個(gè)亞家族，其中LISCL亞家族成員數(shù)量最多。在擬南芥、楊樹、水稻中GRAS基因蛋白至少分為13個(gè)亞家族。

GRAS轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、逆境適應(yīng)等方面都具有重要的影響。研究表明，擬南芥GRAS轉(zhuǎn)錄因子中的DELLA蛋白是赤霉素（GA）信號途徑的負(fù)調(diào)控因子，例如在莖伸長、開花誘導(dǎo)、種子萌發(fā)和花發(fā)育等過程中抑制植物對GA的應(yīng)答反應(yīng) ［12-13］。GRAS蛋白家族的PAT1和SCL21在光信號傳導(dǎo)過程中起著積極的調(diào)控作用。例如，Bolle等在擬南芥pat1-1突變體中發(fā)現(xiàn)，phyA（Phytochrome A）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期階段受到干擾，導(dǎo)致在遠(yuǎn)紅光照射下下胚軸的伸長不再受光抑制［14］。此外，SCL21在不同的光線處理下表達(dá)量有所降低，而PAT1則未受影響，這表明它們在遠(yuǎn)紅光調(diào)控路徑中發(fā)揮著不同的作用。徐紅云和張明意通過比較野生型擬南芥和AtSCL4突變體在滲透脅迫下的生理指標(biāo)和基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AtSCL4在滲透脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，且突變體具有更強(qiáng)的抗?jié)B能力［15］。張群等通過對白樺（Betula platyphylla）的研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，BpGRAS1的表達(dá)量上升，過表達(dá)植株的電解質(zhì)滲透率、失水率和MDA含量降低，同時(shí)POD和SOD活性增強(qiáng)，從而出現(xiàn)過表達(dá)植株的耐鹽性增強(qiáng)，而抑制表達(dá)植株的耐鹽性降低［16］。王同歡等發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，菊花腦（Chrysanthemum nankingense）GRAS家族中有14個(gè)基因表現(xiàn)出顯著的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)［17］。楊杰等通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，枳（Poncirus trifoliata）中12個(gè)PtrGRAS基因在低溫脅迫下表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化，其中PtrGRAS11、PtrGRAS26和PtrGRAS30受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，推測它們可能在抵御低溫脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］。

花魔芋（Amorphophallus konjac）隸屬于天南星科魔芋屬，是一種多年生草本植物，主要分布于中國、日本、東南亞地區(qū)。魔芋地下球莖主要成分為葡甘聚糖，含量在44%～64%之間［19］。葡甘聚糖具有多種優(yōu)良的特性，使得其在食品工業(yè)、生物醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用 ［20-21］。隨著花魔芋全基因組測序工作的完成，為基因家族的全基因組分析提供了便利，也為花魔芋功能基因組學(xué)研究提供了可靠的基因組數(shù)據(jù)信息?；贕RAS基因家族在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的重要作用，本研究利用生物信息學(xué)手段，以花魔芋全基因組為基礎(chǔ)，鑒定花魔芋AkGRAS基因家族成員，并對這些基因的理化特性、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、共線性關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)域以及啟動子順式元件等進(jìn)行分析，利用RNA-Seq技術(shù)分析GRAS基因在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的表達(dá)模式。以期為后續(xù)花魔芋GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因功能研究提供重要參考，為魔芋分子育種提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 花魔芋GRAS基因的鑒定及定位分析

在線數(shù)據(jù)庫Figshare（https：//doi.org/10.6084/m9.figshare.15169578）下載花魔芋gff3基因組注釋數(shù)據(jù)文件和蛋白序列文件，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_022559845.1/）數(shù)據(jù)庫下花魔芋的基因組文件［20］。從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）網(wǎng)站上下載GRAS基因保守結(jié)構(gòu)域（Pfam檢索號為PF03514）的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）。利用Tbtools-Ⅱ（v2.083）軟件，使用Simple HMM Search命令對花魔芋全基因組蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索。篩選出E值小于1.0×10-5的基因ID，并提取相應(yīng)蛋白序列。通過NCBI Batch CD-Search工具（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART在線網(wǎng)站（https：//smart.embl.de/）驗(yàn)證候選蛋白是否包含GRAS保守結(jié)構(gòu)域。將缺失GRAS結(jié)構(gòu)域的候選基因移除，最終確定花魔芋GRAS基因。使用Tbtools的Graphics功能對基因位置進(jìn)行可視化。

1.2 花魔芋GRAS家族的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

使用Tbtools軟件中的Protein Paramter Calc工具，對花魔芋GRAS家族編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行多項(xiàng)理化性質(zhì)的預(yù)測和分析，包括脂肪系數(shù)、親水性、不穩(wěn)定系數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目等。同時(shí)，通過在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）對該家族的蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.3 花魔芋GRAS家族順式作用元件分析及保守結(jié)構(gòu)域、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析分析

使用TBtools軟件提取花魔芋GRAS基因上游的2 000 bp啟動子序列，通過Plant CARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行分析。使用TBtools軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

將花魔芋GRAS蛋白序列上傳至NCBI網(wǎng)站的Batch CD-Search（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具中，獲取hitdata結(jié)果文件。hitdata文件包含了蛋白序列與Conserved Domain Database（CDD）中保守結(jié)構(gòu)域的匹配信息。隨后，利用TBtools軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化操作。利用MEME（http：//meme-suite.org）在線網(wǎng)站對花魔芋GRAS基因進(jìn)行motif預(yù)測。利用TBtools軟件展示出各個(gè)motif在GRAS基因家族中的分布情況和特征。根據(jù)基因組注釋文件（gff）通過TBtools軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化。

1.4 花魔芋GRAS家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

從Plant TFDB數(shù)據(jù)庫（https：//planttfdb.gao-lab.org）上下載了擬南芥的34個(gè)GRAS蛋白序列和水稻的60個(gè)GRAS蛋白序列（附表 1）。利用MEGA 11.0對花魔芋、擬南芥和水稻這3種物種的GRAS蛋白進(jìn)行了多序列比對，最大似然法（ML）構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，將Bootstrap method設(shè)置為1 000。利用iTOL在線工具（https：//itol.embl.de/login.cgi）美化進(jìn)化樹。

1.5 花魔芋GRAS家族共線性分析

利用TBtools軟件的Fasta Stats和GFF3/GTF Gene Position（Info.） Parse功能來獲取染色體長度和基因位置信息。通過Table Row Extract or Filter模塊提取目標(biāo)基因的信息。使用McscanX工具進(jìn)行共線性分析，并結(jié)合Advanced Circos工具繪制出花魔芋GRAS家族的共線性關(guān)系圖譜。使用TBtools軟件中McscanX功能分析花魔芋與擬南芥以及水稻之間的同源關(guān)系。通過TBtools軟件中Dual Systeny Plot for MCscanX工具進(jìn)行共線性可視化。

1.6 花魔芋GRAS基因非生物脅迫和生物脅迫下的表達(dá)分析

2022年10月對曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源開發(fā)與利用研究中心組培間的花魔芋組培苗進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫處理：用濃度為20%的PEG-6000對花魔芋組培苗進(jìn)行干旱脅迫處理，脅迫誘導(dǎo)4 h；用濃度為80 mmol/L的NaCl溶液對花魔芋組培苗進(jìn)行鹽脅迫處理，脅迫誘導(dǎo)4 h。脅迫處理后分別對花魔芋組培苗的地上部分和地下部分進(jìn)行收樣，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，不做處理的為對照組（CK）。生物脅迫處理為接種花魔芋軟腐病病原菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum），采用針刺法接種，于接種24、48 h后收樣液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫詿o菌水處理為對照［21］。

干旱脅迫和鹽脅迫處理樣品送諾禾致源測序公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得測序結(jié)果。生物脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自BioProject數(shù)據(jù)庫，索引號為PRJNA1017648。根據(jù)花魔芋GRAS基因家族的ID提取該家族基因的FPKM數(shù)值，以Actin值（HIC_ASM_3.3714）作為參照，得到其相對表達(dá)量。通過Student’s t-test（t檢驗(yàn)）檢測基因表達(dá)量與CK是否存在顯著差異，若有顯著差異，則用*號標(biāo)記。最后，利用TBtools軟件繪制熱圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花魔芋GRAS基因家族成員的鑒定及定位分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫中GRAS基因保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型（PF03514），對花魔芋全基因組序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析和篩選，初步篩選得到56個(gè)AkGRAS候選基因。進(jìn)一步運(yùn)用NCBI Batch CD-Search和SMART工具，對這56個(gè)候選基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了逐一檢索和驗(yàn)證，以確保每個(gè)候選基因均包含完整的GRAS基因保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果（圖1）顯示，有5個(gè)GRAS候選基因不具備完整的結(jié)構(gòu)域，分別是HIC_ASM_9.10171、CTG_ASM_14911.2、HIC_ASM_5.9023、HIC_ASM_11.6731、HIC_ASM_5.8807。因此，手動剔除不具備完整GRAS結(jié)構(gòu)域的候選基因后，最終確定51個(gè)花魔芋GRAS基因家族成員。依照AkGRAS基因在染色體上的排列次序，51個(gè)基因被命名為AkGRAS1～AkGRAS51。經(jīng)過對AkGRAS基因家族的染色體定位分析，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因（AkGRAS45～AkGRAS51）在染色體骨架上，而其余的44個(gè)基因則分布在13條染色體上。其中，第6號染色體上存在9個(gè)AkGRAS基因，是所有染色體中基因數(shù)量最多的一條染色體。而第5號染色體上則有7個(gè)AkGRAS基因，僅次于第6號染色體。而第1、4、13號染色體上各僅有1個(gè)AkGRAS基因。此外，有8組基因（AkGRAS5/AkGRAS6/AkGRAS7、AkGRAS10/AkGRAS11/AkGRAS12、AkGRAS13/AkGRAS14、AkGRAS21/AkGRAS22、AkGRAS27/AkGRAS28、AkGRAS37/AkGRAS38、AkGRAS40/AkGRAS41、AkGRAS42/AkGRAS43）在染色體上緊密連鎖在一起，推測每組基因可能具有某種結(jié)構(gòu)或功能上的聯(lián)系。

2.2 花魔芋GRAS家族的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

由表1可知，該家族成員所編碼的氨基酸數(shù)量在144～850個(gè)，分子量在15 789.78～90 823.32 u之間。51個(gè)AkGRAS基因家族成員親水性總平均值介于-0.653～0.334之間，僅有4個(gè)（AkGRAS4、AkGRAS15、AkGRAS22和AkGRAS50）是疏水性蛋白，表明大多數(shù)AkGRAS基因家族成員具有一定的親水性特征。不穩(wěn)定系數(shù)在34.23（AkGRAS15）～68.44（AkGRAS11）之間，AkGRAS4、AkGRAS15和AkGRAS50是穩(wěn)定蛋白。等電點(diǎn)分布在4.94～11.19之間，42個(gè)蛋白呈酸性，9個(gè)蛋白呈堿性。這9個(gè)蛋白分別是AkGRAS2、AkGRAS4、AkGRAS8、AkGRAS16、AkGRAS17、AkGRAS31、AkGRAS33、AkGRAS34、AkGRAS46。利用WoLF PSORT預(yù)測花魔芋GRAS蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果（表 1）表明，花魔芋GRAS蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體、線粒體這4個(gè)位置上的分布最為常見。

2.3 花魔芋GRAS家族順式作用元件分析

通過PlantCARE在線網(wǎng)站，分析了花魔芋GRAS基因家族的順式作用元件種類和元件潛在功能。結(jié)果（圖2）表明，花魔芋GRAS基因家族2 000 bp的啟動子區(qū)域存在大量的順式調(diào)控元件，包括光響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、低溫響應(yīng)元件（LTR）等順式作用元件。由表2可知，51個(gè)AkGARS基因全部含有光響應(yīng)元件，其中有26個(gè)AkGARS含有赤霉素響應(yīng)元件、25個(gè)AkGARS含有水楊酸響應(yīng)元件、49個(gè)AkGARS含有脫落酸響應(yīng)元件、23個(gè)AkGARS含有生長素響應(yīng)元件和22個(gè)AkGARS含有低溫響應(yīng)元件。除以上提到的順式作

2.4 花魔芋GRAS家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

研究結(jié)果顯示，在這些AkGRAS基因中，不同的motif種類和數(shù)量存在一定的差異，而且這些motif的排列順序也呈現(xiàn)一定的規(guī)律。大部分AkGRAS基因按照motif10、motif6、motif1、motif8、motif7、motif9、motif5、motif3、motif2、motif4的排列順序來呈現(xiàn)其保守基序motif骨架。其中有14個(gè)基因，即AkGRAS5、AkGRAS6、AkGRAS9、AkGRAS12、AkGRAS13、AkGRAS14、AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS21、AkGRAS35、AkGRAS43、AkGRAS44、AkGRAS47、AkGRAS51，它們都包含了10個(gè)motif，顯示出較為豐富的保守基序種類。相反，AkGRAS8和AkGRAS17基因包含的保守基序種類最少，只有1個(gè)motif。值得注意的是，在每個(gè)GRAS蛋白里，motif4通常出現(xiàn)在C端的末尾位置，而motif8則容易出現(xiàn)缺失。此外，通過基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，所有的花魔芋GRAS基因包含了1～3個(gè)編碼序列（CDS），有38個(gè)AkGRAS成員不含內(nèi)含子（圖3）。

2.5 花魔芋GRAS家族的保守結(jié)構(gòu)域分析

AkGRAS家族基因編碼的蛋白都含有GRAS結(jié)構(gòu)域（圖4）。值得注意的是，AkGRAS9、AkGRAS3和AkGRAS15這3個(gè)蛋白質(zhì)中各有2個(gè)不同的保守結(jié)構(gòu)域。AkGRAS9蛋白包含1個(gè)能夠參與植物各種生理過程調(diào)節(jié)的DELLA結(jié)構(gòu)域。因此，可以推測AkGRAS9蛋白在植物生長發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。AkGRAS3蛋白含有Atrophin1 superfamily結(jié)構(gòu)域。Atrophin1 superfamily結(jié)構(gòu)域在不同生物體中都具有重要的功能，可能與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等相關(guān)。AkGRAS15蛋白含有RNA1 superfamily結(jié)構(gòu)域，可能在基因調(diào)控或信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著特定的功能。

2.6 花魔芋GRAS家族共線性分析

通過對花魔芋GRAS基因的共線性分析發(fā)現(xiàn)，在51個(gè)GRAS基因中共有7對共線性關(guān)系（圖5）。具體來說，第8號與第9號和第10號染色體之間有1對同源基因；第6號和第2號染色體之間有1對同源基因；第5號和第3號染色體之間存在1對同源基因；第11號和第12號染色體上各自存在同源基因。這些結(jié)果為深入研究花魔芋基因的演化和功能提供了重要的基礎(chǔ)。此外，還進(jìn)行了花魔芋、擬南芥和水稻之間的GRAS基因家族的共線性分析。其中，擬南芥為雙子葉植物，花魔芋和水稻屬于

子葉植物。 從共線性圖譜中（圖6）可以觀察到， 花

魔芋與擬南芥、水稻之間的同源基因?qū)?shù)量的差異，即花魔芋與擬南芥存在12對同源基因，與水稻存在18對同源基因?；в笈c水稻之間的同源基因?qū)?shù)量多于花魔芋與擬南芥之間的同源基因?qū)?shù)量。這種現(xiàn)象表明花魔芋與其他物種之間的GRAS基因在演化過程中存在一定的差異，可能反映了它們在基因組結(jié)構(gòu)和功能上的特異性。

2.7 花魔芋GRAS家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 11.0將篩選得到的花魔芋（51個(gè)）與擬南芥（34個(gè)）、水稻（60個(gè)）的GRAS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。根據(jù)Hirsch等［4］和Dutta等［22］的分類方式，51個(gè)AkGRAS家族基因被劃分為8個(gè)亞家族，分別是SHR、PAT1、LS、LISCL、SCL3、DELLA、SCR和HAM亞家族，但是各亞家族成員數(shù)量的分布并不均勻。其中，LISCL、DELLA和SCL3亞家族的成員數(shù)量較少，分別有4、5、8個(gè)；而SHR和PAT1亞家族的成員數(shù)量最多，都有10個(gè)。相比之下，LS亞族的成員數(shù)量最少，僅有2個(gè)。

2.8 花魔芋GRAS基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

干旱和高鹽等非生物因素對作物產(chǎn)量造成的負(fù)面影響已經(jīng)成為全球糧食生產(chǎn)上的一大挑戰(zhàn)。植物對干旱、高鹽等逆境壓力做出響應(yīng)時(shí)，植物根系充當(dāng)直接響應(yīng)外部環(huán)境的器官，發(fā)揮著重要作用。如圖 8所示，花魔芋地下部分SCL、DELLA和PAT1亞家族的成員在干旱脅迫和鹽脅迫時(shí)，其表達(dá)量顯著上調(diào)。這些成員包括1個(gè)SCL的基因（AkGRAS24）、1個(gè)DELLA的基因（AkGRAS29）和3個(gè)PAT1的基因（AkGRAS35、AkGRAS19和AkGRAS40），推測它們可能是花魔芋地下部分抗旱、耐鹽的候選基因。然而，部分亞家族基因在花魔芋地下部分呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，例如SCR（AkGRAS12）、HAM（AkGRAS3和AkGRAS23）、DELLA（AkGRAS9）?；в蟮厣喜糠郑ㄈ缜o、葉）鹽脅迫誘導(dǎo)下PAT1亞族基因AkGRAS8表達(dá)顯著上調(diào)，而LISCL亞族基因AkGRAS36表達(dá)顯著下調(diào)；而在干旱脅迫下地上部分沒有任何基因顯著差異表達(dá)。在干旱和鹽脅迫條

件下，花魔芋GRAS家族基因中的DELLA、SHR、SCL3、SCR、PAT1、LISCL和HAM亞家族均顯示出明顯的表達(dá)變化。值得關(guān)注的是，在鹽脅迫條件下，PAT1（AkGRAS41）和SHR（AkGRAS13）在花魔芋地上部分和地下部分的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著下調(diào)，PAT1（AkGRAS40）則呈現(xiàn)顯著上調(diào)。

2.9 花魔芋GRAS基因在生物脅迫下的表達(dá)分析

魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）引起的毀滅性病害［23］，因目前缺乏有效防控措施，嚴(yán)重影響著魔芋的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了魔芋的生產(chǎn)和發(fā)展［21］。本研究探究了花魔芋接種軟腐病原菌24、48 h GRAS家族基因的表達(dá)情況。結(jié)果（圖9）表明，隨著接種時(shí)間的延長，更多的AkGRAS家族基因成員被誘導(dǎo)下調(diào)或上調(diào)表達(dá)。其中，接種軟腐病原菌24 h，PAT1亞家族中AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS35、AkGRAS51顯著上調(diào)，AkGRAS8和AkGRAS46顯著下調(diào)；SCL3亞家族AkGRAS45和SISCL亞家族的AkGRAS30顯著上調(diào)；DELLA亞家族的AkGRAS32，HAM亞家族的AkGRAS3、AkGRAS7、AkGRAS22和SHR亞家族的AkGRAS5、AkGRAS6顯著下調(diào)。接種軟腐病原菌 48 h，PAT1亞家族中AkGRAS19、AkGRAS35、AkGRAS51顯著上調(diào)，AkGRAS8顯著下調(diào)；SCL3亞家族的AkGRAS24、AkGRA45和SISCL亞家族的AkGRAS30顯著上調(diào)；而HAM亞家族的AkGRAS3、AkGRAS7、AkGRAS22，SCL42亞家族的AkGRAS42，SCR亞家族的AkGRAS10、AkGRAS11、AkGRAS12和SHR亞家族的AkGRAS5、AkGRAS6、AkGRAS21、AkGRAS47顯著下調(diào)。

3 討論

GRAS基因家族參與植物的生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)和逆境脅迫等生物學(xué)過程。近年來，隨著多種植物基因組測序數(shù)據(jù)的公布，對GRAS基因家族成員的鑒定工作已經(jīng)在不同植物物種中開展，如水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹（Populus przewalskii）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、甜瓜（Cucumis melo）、生姜（Zingiber officinale）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、蘋果（Malus pumila）等［1，5-11，22］?；в笫且环N多年生草本植物，其塊莖富含葡甘聚糖，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。目前未見有關(guān)花魔芋GRAS基因家族的研究。本研究采用生物信息學(xué)手段對花魔芋GRAS基因家族進(jìn)行了鑒定與表達(dá)分析。結(jié)果顯示，花魔芋有51個(gè)GRAS家族成員，并發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因（AkGRAS45～ AkGRAS51）在染色體骨架上，而其余的44個(gè)基因則分布在13條染色體上（圖1）?；в驡RAS基因家族成員劃分為8個(gè)亞家族，分別是SHR、PAT1、LS、LISCL、SCL3、DELLA、SCR和HAM亞家族（圖7）。其蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，該家族成員所編碼的氨基酸數(shù)量在 144～850個(gè)之間，分子量在15 789.78～90 823.32 u之間。等電點(diǎn)在 4.94～11.19之間，大部分AkGRAS編碼蛋白為酸性不穩(wěn)定蛋白，且具有一定的親水性（表1）。

花魔芋GRAS基因家族2 000 bp的啟動子區(qū)域存在大量的順式調(diào)控元件（圖2），這些元件的種類多樣，主要包括光響應(yīng)元件、脅迫應(yīng)答元件（例如低溫、厭氧和防御反應(yīng)等）以及各種激素響應(yīng)元件（例如生長素、脫落酸、赤霉素和水楊酸等）。這表明花魔芋GRAS基因幫助植物適應(yīng)外界環(huán)境變化和抵御各種生物或非生物脅迫。對花魔芋的GRAS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，約75%的花魔芋GRAS基因家族成員不含內(nèi)含子（圖3）。在其他植物中，如黃瓜（Cucumis sativus）、番茄（Solanum lycopersicum）中，無內(nèi)含子的GRAS蛋白所占的比例分別為75.67%和77.40%［24-25］。這表明在不同植物中，無內(nèi)含子的GRAS基因比例相對較高，且這種基因結(jié)構(gòu)在各種物種中都表現(xiàn)出較高的保守性。

已有多種植物的GRAS基因家族被報(bào)道參與非生物脅迫應(yīng)答［25-28］。例如，葡萄（Vitis vinifera）的GRAS基因VviRGA5（DELLA亞家族）和VviLISCL1（SCL亞家族）對鹽脅迫有響應(yīng)；擬南芥（A. thaliana）的SCL亞家族基因AtSCL14對鹽脅迫的響應(yīng)強(qiáng)烈［26-27］。番茄（Lycopersicon esculentum）的SlGRAS2（PAT4亞家族）和LeHAM3（HAM亞家族）對鹽脅迫表現(xiàn)出強(qiáng)烈響應(yīng) ［25］。水稻（Oryza sativa）的OsGRAS23（SCL亞家族）在鹽脅迫下也有顯著響應(yīng)，而在鹽地堿蓬（Halostachys caspica）中，SCL亞家族的HcSCL13在干旱和鹽脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，且增加了其過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長量和鹽脅迫耐受性［28-29］。胡楊（Populus euphratica）中的PeSCL7也對鹽脅迫有響應(yīng)［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽和干旱脅迫下，花魔芋中1個(gè)SCL亞家族基因（AkGRAS24）、1個(gè)DELLA亞家族基因（AkGRAS29）和3個(gè)PAT1亞家族基因（AkGRAS35、AkGRAS19和AkGRAS40）顯著上調(diào)；同時(shí)，部分基因在脅迫下顯著下調(diào)，例如SCR亞家族（AkGRAS12）、HAM亞家族（AkGRAS3和AkGRAS23）和DELLA亞家族（AkGRAS9）。植物通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活性來清除細(xì)胞中過量的活性氧（ROS），從而提高干旱和鹽的耐受性［31-32］。例如，水稻中的OsGRAS2（SCL亞家族）參與干旱脅迫響應(yīng)，而OsGRAS23在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，且其過表達(dá)植株中SOD和POD活性增加［33］。PeSCL7

是胡楊中的應(yīng)激響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，能提高其對干旱和鹽脅迫的耐受性［34］。在本研究中，花魔芋在干旱脅迫下，多數(shù)AkGRAS基因在地下部分差異表達(dá)，推測這些基因主要在根部發(fā)揮調(diào)控作用。值得注意的是，在鹽脅迫下顯著差異表達(dá)的AkGRAS19、AkGRAS35、AkGRAS40和AkGRAS41成員都屬于PAT1亞家族。同樣，干旱脅迫下葡萄中的PAT1亞家族基因VviPAT3、VviPAT4、VviPAT6和VviPAT7上調(diào)表達(dá) ［35］。Zhang等發(fā)現(xiàn)棉花中的GRAS基因 Gh_D01G0564 和Gh_A04G01966（屬于PAT1亞家族）在鹽、低溫、高溫和PEG處理下的表達(dá)顯著上調(diào)［36］。Yuan等則發(fā)現(xiàn)葡萄（Vitis amurensis）的GRAS轉(zhuǎn)錄因子VaPAT1過表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對低溫、干旱和高鹽的耐受性［37］。因此，推測花魔芋的PAT1亞家族基因在提高鹽耐受性方面具有重要作用。然而，要全面了解GRAS基因在植物干旱和鹽脅迫中的功能，仍需進(jìn)一步研究。

GRAS基因DELLA亞家族的成員在擬南芥感染致病細(xì)菌期間起到了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，并增強(qiáng)了對病原菌的抗性［38］。本研究中，發(fā)現(xiàn)花魔芋在感染軟腐病原菌24 h后，AkGRAS42（DELLA亞家族）顯著下調(diào)。Bonshtien等首次證明了GRAS基因在番茄抗病起關(guān)鍵作用，S1GRAS4和S1GRAS6在響應(yīng)真菌誘導(dǎo)劑時(shí)也被誘導(dǎo)表達(dá)，GRAS基因的超表達(dá)表明這些基因可能參與了激活植物防御反應(yīng)［39-0］。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著接種病原細(xì)菌處理時(shí)間的延長，更多GRAS基因家族成員被誘導(dǎo)表達(dá)。盡管如此，大多數(shù)GRAS家族基因的具體作用仍不清楚，進(jìn)一步研究有助于深入理解GRAS基因與植物防御系統(tǒng)的相互關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

［1］吳占清，陳 威，趙 展，等. 玉米GRAS基因家族的全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2024，26（3）：15-25.

［2］暢文軍，劉習(xí)文，張治禮. 植物GRAS蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué)，2013，25（11）：1045-1052.

［3］王 楠. 吉林人參GRAS基因家族的系統(tǒng)分析及PgGRAS68-01基因的功能研究［D］. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

［4］Hirsch S，Oldroyd G E D. GRAS-domain transcription factors that regulate plant development［J］. Plant Signaling amp; Behavior，2009，4（8）：698-700.

［5］Liu X Y，Alex W D. Genome-wide comparative analysis of the GRAS gene family in Populus，Arabidopsis and rice［J］. Plant Molecular Biology Reporter，2014，32：1129-1145.

［6］To V T，Shi Q，Zhang Y，et al. Genome-wide analysis of the GRAS gene family in barley（Hordeum vulgare L.） ［J］. Genes，2020，11（5）：553.

［7］任 靜，王 奇，閆彩霞，等. 花生GRAS基因家族全基因組鑒定與表達(dá)模式分析［J］. 分子植物育種，2024：1-13（2023-11-08） ［2024-10-15］. https：//link.cnki.net/urlid/46.1068.S.20231107.0935.004.

［8］鄭 玲，閆曉曼. 甜瓜GRAS家族全基因組的鑒定與表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（11）：53-59.

［9］Tian S，Wan Y，Jiang D，et al. Genome-wide identification，characterization，and expression analysis of GRAS gene family in ginger （Zingiber officinale Roscoe） ［J］. Genes，2022，14（1）：96.

［10］劉振盼，盧立媛，楊偉聰，等. 獼猴桃GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組鑒定［J/OL］. 分子植物育種，2024：1-11（2024-03-25）［2024-10-15］. https：//link.cnki.net/urlid/46.1068.S.20240322.1550.004.

［11］于婷婷，李 歡，寧源生，等. 蘋果GRAS全基因組鑒定及其對生長素的響應(yīng)分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2023，50（2）：397-409.

［12］Wen C K，Chang C. Arabidopsis RGL1 encodes a negative regulator of gibberellins response［J］. Plant Cell，2002，14（1）：87-100.

［13］Tyler L，Thomas S G，Hu J，et al. Della proteins and gibberellin-regulated seed germination and floral development in Arabidopsis［J］. Plant Physiology，2004，135（2）：1008-1019.

［14］Bolle C，Koncz C，Chua N H. PAT1，a new member of the GRAS family，is involved in phytochrome A signal transduction［J］." Genes amp; Development，2000，14（10）：1269-1278.

［15］徐紅云，張明意. GRAS轉(zhuǎn)錄因子AtSCL4負(fù)調(diào)控?cái)M南芥應(yīng)答滲透脅迫［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（6）：129-135.

［16］張 群，及曉宇，賀子航，等. 白樺BpGRAS1基因的克隆及耐鹽功能分析［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，45（5）：38-46.

［17］王同歡，吳雨馨，武藝圓，等. 菊花腦GRAS家族鑒定及其低溫脅迫響應(yīng)表達(dá)分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2023，50（4）：815-830.

［18］楊 杰，陳 蓉，胡文娟，等. 枳GRAS基因家族鑒定及其對低溫脅迫的響應(yīng)［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2022，58（1）：130-140.

［19］Gao Y，Zhang Y，F(xiàn)eng C，et al. A chromosome-level genome assembly of Amorphophallus konjac provides insights into konjac glucomannan biosynthesis［J］. Computational and Structural Biotechnology Journal，2022，20：1002-1011.

［20］牛 義，張盛林，王志敏，等. 中國魔芋資源的研究與利用［J］. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（5）：69-73.

［21］Gao P，Qi Y，Li L，et al. Phenylpropane biosynthesis and alkaloid metabolism pathways involved in resistance of Amorphophallus spp. against soft rot disease［J］. Frontiers in Plant Science，2024，15：1334996.

［22］Dutta M，Saha A，Moin M，et al. Genome-wide identification，transcript profiling and bioinformatic analyses of GRAS transcription factor genes in rice［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12：777285.

［23］Zhang Y，Chu H，Yu L，et al. Analysis of the taxonomy，synteny，and virulence factors for soft rot pathogen Pectobacterium aroidearum in Amorphophallus konjac using comparative genomics［J］. Frontiers in Microbiology，2022，13：868709.

［24］唐 瑞，韓 妮，虎亞靜，等. 黃瓜GRAS家族全基因組鑒定與表達(dá)分析［J］. 分子植物育種，2021，19（13）：4242-4251.

［25］Huang W，Xian Z，Kang X，et al. Genome-wide identification，phylogeny and expression analysis of GRAS gene family in tomato［J］. BMC Plant Biology，2015，15：1-18.

［26］Agudelo-Romero P，Erban A，Rego C，et al. Transcriptome and metabolome reprogramming in Vitis vinifera cv. Trincadeira berries upon infection with Botrytis cinerea［J］. Journal of Experimental Botany，2015，66：1769-1785.

［27］Fode B，Siemsen T，Thurow C，et al. The Arabidopsis GRAS protein SCL14 interacts with class Ⅱ TGA transcription factors and is essential for the activation of stress-inducible promoters［J］. The Plant Cell，2008，20：3122-3135.

［28］Czikkel B E，Maxwell D P. NtGRAS1，a novel stress-induced member of the GRAS family in tobacco，localizes to the nucleus［J］. Journal of Plant Physiology，2007，164：1220-1230.

［29］Zhang S，Li X，F(xiàn)an S，et al. Overexpression of HcSCL13，a Halostachys caspica GRAS transcription factor，enhances plant growth and salt stress tolerance in transgenic Arabidopsis［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2020，151：243-254.

［30］Wang H L，Chen J，Tian Q，et al. Identification and validation of reference genes for Populus euphratica gene expression analysis during abiotic stresses by quantitative real-time PCR［J］. Physiologia Plantarum，2014，152：529-545.

［31］Li Z，Zhang Y，Liu C，et al. Arbuscular mycorrhizal fungi contribute to reactive oxygen species homeostasis of Bombax ceiba L. under drought stress［J］. Frontiers in Microbiology，2022，13：991781.

［32］Luo C，Li Z，Shi Y，et al. Arbuscular mycorrhizal fungi enhance drought resistance in Bombax ceiba by regulating SOD family genes［J］. PeerJ，2024，12：e17849.

［33］Xu K，Chen S，Li T，et al. OsGRAS23，a rice GRAS transcription factor gene，is involved in drought stress response through regulating expression of stress-responsive genes［J］. BMC Plant Biology，2015，15：1-13.

［34］Ma H S，Liang D，Shuai P，et al. The salt-and drought-inducible poplar GRAS protein SCL7 confers salt and drought tolerance in Arabidopsis thaliana［J］. Journal of Experimental Botany，2010，61：4011-4019.

［35］Grimplet J，Agudelo-Romero P，Teixeira R T，et al. Structural and functional analysis of the GRAS gene family in grapevine indicates a role of GRAS proteins in the control of development and stress responses［J］. Frontiers in Plant Science，2016，7：353.

［36］Zhang B，Liu J，Yang Z E，et al. Genome-wide analysis of GRAS transcription factor gene family in Gossypium hirsutum L.［J］. BMC Genomics，2018，19：1-12.

［37］Yuan Y，F(xiàn)ang L，Karungo S K，et al. Overexpression of VaPAT1，a GRAS transcription factor from Vitis amurensis，confers abiotic stress tolerance in Arabidopsis［J］. Plant Cell Reports，2016，35：655-666.

［38］Wild M，Daviere J M，Cheminant S，et al. The Arabidopsis DELLA RGA-LIKE3 is a direct target of MYC2 and modulates jasmonate signaling responses［J］. The Plant Cell，2012，24：3307-3319.

［39］Bonshtien A，Lev A，Gibly A，et al. Molecular properties of the Xanthomonas AvrRxv effector and global transcriptional changes determined by its expression in resistant tomato plants［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions，2005，18：300-310.

［40］Mayrose M，Ekengren S K，Melech-Bonfil S，et al. A novel link between tomato GRAS genes，plant disease resistance and mechanical stress response［J］. Molecular Plant Pathology，2006，7：593-604.