郭琳　鐘金城　柴志欣等

摘要：為探討腦紅蛋白（NGB）在西藏牦牛高原低氧適應(yīng)機(jī)制中的作用，利用分子克隆技術(shù)獲得了西藏牦牛NGB基因序列，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因及其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NGB基因全長為2 993 bp，編碼125個(gè)氨基酸；其編碼蛋白屬于親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，西藏牦牛NGB與野牦牛、牛、綿羊等物種的遺傳距離較近，具有高度同源性。

關(guān)鍵詞：西藏牦牛；NGB基因；克??；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S823.8+52文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0026-04

收稿日期：2015-04-27

基金項(xiàng)目：西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（編號(hào)：CX2015SZ106）；西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2014XWD-S071007）。

作者簡介：郭琳（1990—），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail：guolin20151@163.com。

通信作者：陳智華，博士，教授，主要從事生物多樣性研究。E-mail：Chenzhihua_czh@sohu.com。牦牛（Bos grunniens）屬哺乳綱偶蹄目反芻亞目?？崎L毛的牛屬動(dòng)物。主要生活在高寒生態(tài)條件下海拔3 000m以上的地區(qū)，是青藏高原特有的牛種，被認(rèn)為是研究高原低氧適應(yīng)的代表性動(dòng)物之一[1]。該物種主要分布于喜馬拉雅山、阿爾金山、昆侖山以及祁連山，這些地區(qū)海拔高、地勢(shì)復(fù)雜、空氣稀薄、氣候寒冷，年平均氣溫在0 ℃以下，最低溫度可達(dá) -50 ℃，環(huán)境極端惡劣復(fù)雜。西藏自治區(qū)是我國牦牛的主產(chǎn)區(qū)之一，由于各地區(qū)自然生態(tài)環(huán)境條件的差異，形成了桑桑牦牛、丁青牦牛、桑日牦牛、類烏齊牦牛、工布江達(dá)牦牛、申扎牦牛、巴青牦牛等不同的地方品種和類群，其中類烏齊牦牛[2]主要分布于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，對(duì)于高海拔、含氧量低的高寒地區(qū)有著良好的適應(yīng)性。目前對(duì)腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）基因的研究主要集中在人、小鼠、豬以及甘南牦牛[3-6]，而對(duì)西藏牦牛NGB基因的研究尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)類烏齊牦牛NGB基因的全序列克隆與表達(dá)，為進(jìn)一步研究牦牛高原低氧環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。腦紅蛋白是近期發(fā)現(xiàn)的一種攜氧球蛋白，是繼血紅蛋白（hemoglobin，HB）和肌紅蛋白（myoglobin，MB）之后的第3種攜氧球蛋白，主要在脊椎動(dòng)物神經(jīng)組織和視網(wǎng)膜中表達(dá)[7]。Burmester等最初利用斑點(diǎn)雜交法在小鼠大腦前葉、下丘腦和丘腦中發(fā)現(xiàn)NGB mRNA的分布，并通過原位雜交法發(fā)現(xiàn)海馬的錐體細(xì)胞層有NGB mRNA陽性物質(zhì)的存在[8]。2001年，我國學(xué)者張成崗等對(duì)大鼠腦紅蛋白基因編碼區(qū)進(jìn)行了克隆及多態(tài)性分析，證明了其多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的存在，并進(jìn)一步驗(yàn)證了NGB基因在大鼠腦供氧及氧結(jié)合與運(yùn)輸中的重要作用[9]。馬蘭等對(duì)青藏高原特有物種藏羚羊的NGB基因進(jìn)行了研究，著重分析了該基因在不同組織表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)NGB mRNA在大腦皮層頂葉中的表達(dá)最高，繼而是海馬、尾狀核等，證實(shí)了NGB基因與藏羚羊?qū)Φ脱醐h(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性有關(guān)[10]。腦紅蛋白的主要功能是與循環(huán)中的O2結(jié)合，形成氧合NGB，在腦組織缺氧或神經(jīng)元耗氧突然增加時(shí)把儲(chǔ)存的O2釋放，以提供組織對(duì)氧的需要[11]。但目前低氧引起腦紅蛋白增加的機(jī)制尚不十分清楚，本研究通過對(duì)高原牦牛NGB基因的研究，探究其表達(dá)變化模式與西藏牦牛低氧適應(yīng)性的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑大腸桿菌E. Coli DH5α購于TIANGEN公司；pMDl9-T克隆載體購于TaKaRa公司；DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸出粉均購于Oxoid公司，瓊脂糖為成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。梯度PCR儀為Eppendorf（Germany）。

1.1.2樣品牦牛耳組織樣品，采自于西藏自治區(qū)類烏齊縣的類烏齊牦牛。液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取利用組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取基因組DNA[12]，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度，使用DNA marker D2000（TIANGEN）。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成參考NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中野牦牛（NW_005398357）NGB基因序列，采用交叉重疊原理，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1）對(duì)NGB基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得西藏NGB基因的序列。引物由上海伯津生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3NGB基因的克隆PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen的凝膠回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，取適量純化后的PCR 產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞并在Amp的瓊脂平板上涂菌，37 ℃培養(yǎng)12 h。在固體LB培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落連接于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中[13]。經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往上海伯津生物技術(shù)有限公司測(cè)序，使用軟件剪切拼接后獲得全長序列。

1.2.4NGB基因序列分析將序列擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行拼接，運(yùn)用Protparam 和ProtScale等在線分析軟件對(duì)NGB基因的理化性質(zhì)及親水性/疏水性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。運(yùn)用TMpred預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用在線分析軟件NetPhos 2.0 Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。用MegAlign和MEGA.5 軟件，對(duì)類烏齊牦牛NGB基因與NCBI中獲得的17個(gè)物種的NGB基因序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。運(yùn)用在線軟件CpGplot預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)NGB基因中是否含有CpG島。

2結(jié)果

2.1NGB基因的擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見NGB-1擴(kuò)增為大于2 000 bp片段，與預(yù)期的2 035 bp片段長度較一致。NGB-2擴(kuò)增結(jié)果在1 000～2 000 bp之間，靠近1 000 bp，與預(yù)期擴(kuò)增的1 200 bp片段長度基本一致（圖1），初步證明克隆成功。

2.2NGB基因序列分析

運(yùn)用GENSCAN 1.0（http：//genscanw.biosino.org）對(duì)克隆得到的類烏齊NGB基因進(jìn)行在線預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)類烏齊牦牛NGB基因預(yù)測(cè)開放閱讀框長度為378 bp，共編碼125個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA（圖2）。運(yùn)用在線軟件CpGplot預(yù)測(cè)分析，未發(fā)現(xiàn)NGB基因中含有CpG島。

2.3密碼子分析

密碼子是核酸和蛋白質(zhì)攜帶遺傳信息的基本原則，是生物體內(nèi)信息傳遞的基本環(huán)節(jié)?；蛎艽a子的使用和基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)。運(yùn)用CodonW軟件對(duì)NGB基因進(jìn)行密碼子使用偏好性分析。密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaption index，CAI）為0.306，代表了密碼子與高表達(dá)基因的所用密碼子的接近程度。有效密碼子數(shù)（effective number of codon，NC）為30.06，代表密碼子的偏好程度。通常，CAI與NC成正相關(guān)。GC含量為0.643，密碼子第3個(gè)堿基中GC出現(xiàn)的頻率（GC3s）為0.866，不同物種中GC含量具有很大的變化，CAI和NC影響著密碼子的選擇。密碼子偏愛指數(shù)（cond bias index，CBI）為0.251，最優(yōu)密碼子使用頻率（frequency of optimal condons，F(xiàn)OP）為0.555，同義密碼子數(shù)（L_sym）為119，總平均親水性（grand average of hydropathy，GRAVY）為-0.015 200，證明此蛋白為親水性蛋白（表2）。

2.4NGB基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ProtParam（ http：//web.expasy.org/protparam ）在線軟件對(duì)NGB基因編碼蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為13 901.9 u，由20種氨基酸組成，最高含量為Leu（14.4%）。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為15個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為12個(gè)。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為51.56，表明此蛋白具有不穩(wěn)定性[14]。

2.5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)

2.5.1NGB基因編碼蛋白質(zhì)親水性/疏水性分析運(yùn)用ProScale程序（ http：//expasy.org/tools/protscale.html ）對(duì)NGB基因進(jìn)行親疏水性分析，正值越大說明越疏水，負(fù)值越大說明越親水[15]。最小值為-1.433，分別位于第22、23和24氨基酸上，親水性最強(qiáng)。最大值為2.544，位于第46位氨基酸，疏水性最強(qiáng)（圖3）。由于親水性所占比例大于疏水性，由此推斷該編碼蛋白表現(xiàn)為親水性，親水蛋白起調(diào)控作用，穩(wěn)定性較差，與上述理化性質(zhì)分析結(jié)果相一致。

2.5.2NGB基因跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)跨膜區(qū)域即蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)的部分，跨膜區(qū)域數(shù)量不限，有的1個(gè)，有的可能存在多個(gè)跨膜區(qū)域。運(yùn)用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/softweare/TMPRED_form.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，其中在第17～33位氨基酸區(qū)域可能存在TM-螺旋（圖4）。

2.5.3蛋白質(zhì)磷酸位點(diǎn)分析運(yùn)用分析軟件NetPhos2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/），對(duì)NGB基因磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白共含有8個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中Ser磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，分別位于第24、25、32、57、58、81堿基處；Thr磷酸化位點(diǎn)2個(gè)，位于51和82位堿基處；不含有Tyr磷酸化位點(diǎn)（圖5）。

2.5.4蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域運(yùn)用NCBI中[Conserved Domain Search Service （CD Search）]在線分析NGB基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，有1個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域，是1個(gè)珠球蛋白。超級(jí)珠蛋白家族中包含了各種各樣的螺旋蛋白結(jié)合的卟啉、藻膽蛋白和其他非血紅素輔助因子（圖6）。

2.5.5NGB基因編碼蛋白質(zhì)功能分析運(yùn)用分析軟件Protfun2.2 Server（www.cds.dtu.dk/services/ProtFun-2.2）對(duì)NGB基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析。蛋白質(zhì)功能以運(yùn)輸和結(jié)合為主，概率為0.773，可能性是1.885。其次是嘌呤嘧啶和輔因子的生物合成，概率分別是0.331和0.210（表3）。由此推斷此蛋白屬于運(yùn)輸?shù)鞍?，可以有效地與氧結(jié)合，促進(jìn)氧在腦中的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高氧的利用率。

2.6西藏牦牛NGB的系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MegAlign和MEGA.5 軟件，將獲得的18條NGB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]（圖7），類烏齊牦牛與牦牛和牛的親緣關(guān)系最近，具有高度的同源性。并與綿羊、長江豚、豬、獼猴、橄欖狒狒、黑猩猩、人、長臂猿、天竺鼠、狗、蝙蝠、兔子、老鼠、中國倉鼠形成哺乳動(dòng)物的一個(gè)分支，與雞形成一個(gè)較遠(yuǎn)的分支。

3討論

低氧適應(yīng)性一直是高原生態(tài)研究的重點(diǎn)，而牦牛又是高原低氧地區(qū)特有的物種之一，對(duì)高原地區(qū)特有的生態(tài)環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)力。因此，本研究選用西藏牦牛作為研究對(duì)象，通過對(duì)類烏齊牦牛NGB基因的研究，進(jìn)一步分析牦牛對(duì)低氧適應(yīng)性的影響。腦紅蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白為3大攜氧球蛋白[17]，其中腦紅蛋白作為一種內(nèi)源性神經(jīng)蛋白，參與了神經(jīng)元氧分的運(yùn)輸和儲(chǔ)存[18-19]。雖然在腦蛋白中含量很低，僅為0.01%，但有利于提高氧的利用率，在缺氧條件下具有很顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[20-21]。2000年，Burmester等[8]研究證實(shí)該蛋白主要在腦中表達(dá)，可能會(huì)增加腦組織的氧供應(yīng)。在對(duì)西藏牦牛NGB基因的組織表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)存在于哺乳動(dòng)物消化器官中。Sun等[22]對(duì)NGB基因的藥物機(jī)理進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)該基因在缺氧環(huán)境下能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，識(shí)別缺氧環(huán)境，在缺氧環(huán)境下NGB基因的表達(dá)量將會(huì)升高。

本研究克隆了類烏齊牦牛NGB基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)，類烏齊牦牛NGB基因開放閱讀框長度為378 bp，編碼125個(gè)氨基酸。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為51.56，表明該蛋白具有不穩(wěn)定性。石寧寧等[4]對(duì)甘南牦牛的研究也證明了該基因具有不穩(wěn)定性，極易與氧結(jié)合，親水性所占比例大于疏水性，為水溶性蛋白，能夠有效地在缺氧條件下，運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧分來滿足機(jī)體需求，與在蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)中結(jié)果一致，編碼蛋白功能主要為運(yùn)輸和結(jié)合為主，進(jìn)一步證實(shí)了NGB基因在氧運(yùn)輸中的作用，白振忠等[23]在對(duì)高原鼠兔腦紅蛋白基因研究中也得到了類似結(jié)論。在第17～33位氨基酸區(qū)域可能存在TM-螺旋，有1個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域。與普通牛進(jìn)行對(duì)比，缺失了26個(gè)氨基酸，與野牦牛對(duì)比具有高度同源性，是否存在突變或由于類烏齊地區(qū)特殊的生態(tài)環(huán)境造成，需進(jìn)一步研究。超級(jí)珠蛋白家族中包含了各種各樣的螺旋蛋白結(jié)合的卟啉、藻膽蛋白和其他非血紅素輔助因子，并在3個(gè)領(lǐng)域中扮演著不同的角色，包括傳感器或是氧氣的運(yùn)輸。它包括M（肌紅蛋白）、S（蛋白傳感器）、T（截短蛋白，TrhB）家族和藻蛋白（PBPs）。M家族包括鑲嵌和單結(jié)構(gòu)域蛋白，S家族包括珠蛋白耦合傳感器、單結(jié)構(gòu)域蛋白，T家族分為3個(gè)主要群體TrHb1s （N）、TrHb2s （O）、TrHb3s （P）。M和S家族具有血紅蛋白的一個(gè)典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在對(duì)類烏齊牦牛NGB基因的同源性研究中顯示，野牦牛、牛和綿羊等物種與類烏齊牦牛具有高度同源性，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與動(dòng)物分類學(xué)的觀點(diǎn)基本一致，這與李盛杰等對(duì)天竺白牦牛的研究結(jié)果[20]相一致，表明了NGB基因在生物進(jìn)化上的高度保守性。

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