賀容+張生珍+王超+刁正鵬+薛紅梅+徐立青+李增魁

摘要：為進(jìn)一步研究外膜蛋白Omp25的結(jié)構(gòu)和功能，以羊種布氏桿菌3型青海省海晏縣自然株為研究對(duì)象，通過基因的克隆測(cè)序，采用生物信息學(xué)方法對(duì)外膜蛋白Omp25基因及其編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、分子表面可能性、柔韌性、親水性、抗原指數(shù)、B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果顯示：羊種布氏桿菌3型Omp25分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列的各項(xiàng)參數(shù)存在5段共同區(qū)段，其中59～74、93～112、182～202位氨基酸的各項(xiàng)生物信息學(xué)參數(shù)尤為突出，是其B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)的可能性很大。

關(guān)鍵詞：羊種布氏桿菌3型；Omp25基因；序列測(cè)定；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S855.99

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0025-03

羊布氏桿菌病是由布氏桿菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染病，該病在全球范圍內(nèi)流行[1]，臨床特征為慢性疲勞、波浪熱、生殖系統(tǒng)損壞及全身性疾病[2]。青海省是人、畜見布氏桿菌病的高發(fā)區(qū)，1954年青海省首次分離出布氏桿菌，到2000年省內(nèi)布氏桿菌病得到有效控制，并且達(dá)到國家頒布的布氏桿菌病“控制區(qū)”標(biāo)準(zhǔn)[3]，但是2006年該病疫情呈回升狀態(tài)[4]。雖然目前針對(duì)該病的疫苗已經(jīng)存在，但是由于疫苗使用不當(dāng)造成布氏桿菌感染家畜或人的事件時(shí)有發(fā)生[5]，可見其保護(hù)率、安全性均很低。

布氏桿菌外膜蛋白（outer membrane proteins）Omp25/Omp31家族免疫原性強(qiáng)，可誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高滴度特異性抗體，純化蛋白可用于布魯菌病的診斷[6]。由于布氏桿菌的外膜蛋白（OMPs）暴露于S菌的表面，不僅能與IgG抗體發(fā)生反應(yīng)，而且還可以引起保護(hù)性免疫反應(yīng)，一直被作為研究的重點(diǎn)[7]。本研究采用羊種布氏桿菌3型青海省海晏縣自然野毒株，對(duì)其外膜蛋白Omp25基因進(jìn)行克隆，用生物信息學(xué)方法對(duì)Omp25基因及其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，避免試驗(yàn)的盲目性，為大量制備重組Omp25蛋白及其免疫原性及布氏桿菌多表位疫苗的設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)，還可通過試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)比驗(yàn)證其生物學(xué)活性，也為布氏桿菌病的診斷、用藥及疫苗研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

羊種布氏桿菌3型23號(hào)[8]由青海省地方病預(yù)防控制所徐立青老師惠贈(zèng)。

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)及基因組DNA的提取

將布氏桿菌23號(hào)劃線于肝浸液固體培養(yǎng)基，生長24 h。挑單個(gè)菌落置于肝浸液液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，取3 mL菌液置于2個(gè)1.5 mL無菌離心管中，80 ℃ 水浴30 min，將滅活菌液按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明操作，分裝后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成

參考GenBank基因編碼區(qū)序列，結(jié)合克隆載體pMD19-T的閱讀框，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)羊布氏桿菌Omp25基因PCR引物，預(yù)計(jì)其擴(kuò)增目的片段長度為640 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體信息見表1。

1.4 Omp25基因的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中模板1 μL，濃度為 10 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Master Mix（含染料） 12.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后，取10 μL反應(yīng)液在1%瓊脂糖凝膠中電泳，檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 Omp25基因克隆載體的構(gòu)建

Omp25基因PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后與pMD19-T載體于16 ℃連接3 h，連接體系為：0.5 μL pMD19-T載體，2 μL Omp25基因PCR產(chǎn)物，2.5 μL SolutionⅠ。取5 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化100 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal的LB氨芐青霉素（Amp，100 μg/mL）固體培養(yǎng)基上；次日挑白色菌落，接種于3 mL含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)14 h，按照質(zhì)粒小量提抽試劑盒說明提取質(zhì)粒；用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，挑取陽性克隆，送上海華大基因科技有限公司測(cè)序。陽性克隆命名為 pMD19-T-Omp25。

1.6 Omp25基因抗原表位預(yù)測(cè)

綜合利用DNAman、ProtParam、DANStar、SOPMA、SWISS-MODEL、BepiPred 生物學(xué)軟件系統(tǒng)對(duì)Omp25分子的立體結(jié)構(gòu)、分子的親水性、表面可能性、柔韌性及免疫學(xué)特性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Omp25基因擴(kuò)增結(jié)果及克隆后雙酶切鑒定結(jié)果

Omp25基因擴(kuò)增片段及克隆后雙酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)計(jì)長度相符，詳見圖1。

2.2 Omp25基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白氨基酸序列

經(jīng)測(cè)序顯示，Omp25基因核苷酸序列長為640 bp，共編碼213個(gè)氨基酸，詳見圖2。

2.3 Omp25蛋白分子抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

利用生物學(xué)軟件DNAstar、ExPASy服務(wù)器的ProtParam分析羊Ⅲ型布氏桿菌外膜蛋白Omp25分子的理化性質(zhì)，詳見表2。

通過NPS@IBCP服務(wù)器的SOPMA預(yù)測(cè)Omp25的二級(jí)結(jié)構(gòu)，詳見圖3?？梢娖洇?螺旋占24.88%，β-轉(zhuǎn)角占 13.15%，無規(guī)卷曲占37.07%，延伸鏈占24.88%，總體來看該蛋白的卷曲程度較高，因此成為B細(xì)胞表位可能性大。