陳凱麗 孫延鳴++沈文++陳冬梅 +郭海英

摘要：以湖羊SPLUNC1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、保守區(qū)域分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，湖羊SPLUNC1蛋白的分子量為26.53 ku，理論等電點(diǎn)為5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外。SPLUNC1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲。該蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折疊片和2個(gè)α螺旋組成的桶形結(jié)構(gòu)域組成。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，湖羊的SPLUNC1蛋白在山羊、牛、豬、人、小鼠中，與山羊首先聚為一類，后與牛聚為一類，這與動(dòng)物學(xué)分類結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：湖羊；短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： Q781文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0048-03

收稿日期：2015-01-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31460686）

作者簡介：陳凱麗（1988—），女，河南南陽人，碩士，主要從事動(dòng)物學(xué)研究。E-mail：kellyhenan@163.com。

通信作者：孫延鳴，博士，教授，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：sym@shzu.edu.cn。

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]）因其特異表達(dá)于上腭、肺及鼻咽上皮而被命名。Weston等首次克隆了小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因[1]。SPLUNC1具有分泌物的生化特性[2]，分布于細(xì)胞胞漿中[3]。人、小鼠、牛、豬[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]分別定位于20號(hào)染色體、2號(hào)染色體、13號(hào)染色體、17號(hào)染色體。研究表明哺乳類動(dòng)物物種擁有共同的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]表達(dá)模式，即在口咽部、上呼吸道、唾液腺和氣管表達(dá)，且在革蘭陰性細(xì)菌引起的呼吸道感染中能起到抗菌及抗炎雙重作用[4]。Liu等證明了SPLUNC1是吸道病原菌感染肺部黏膜固有免疫防御相關(guān)決定性成分[5]。Chu等證實(shí)SPLUNC1是一種新的宿主防御肺炎支原體蛋白，體內(nèi)過表達(dá)的SPLUNC1能顯著地抑制肺部肺炎支原體的載荷量[6]。此外，SPLUNC1在維持上呼吸道穩(wěn)態(tài)方面也起了重要的作用[7]。目前，有關(guān)人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因功能已有相關(guān)報(bào)道，但未見有關(guān)羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]相關(guān)功能及其生物信息學(xué)分析的報(bào)道。在此前的研究中，筆者采用RACE技術(shù)，從湖羊的肺組織中克隆得到[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA序列，并在GenBank上登錄（登錄號(hào)：KJ749828.1）。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因序列進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究湖羊SPLUNC1蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件

NCBI（美國生物技術(shù)研究中心）：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastEXPASY：http：//www.us.expasy.ch（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）；MEGA 5.05軟件；RasMol軟件。

1.2湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全長的獲得

從湖羊肺組織中提取RNA，利用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增出[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]的3′末端和5′末端序列并送基因公司測序，用DNAMAN軟件將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA 的全長序列。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA的全長序列的具體克隆步驟參照文獻(xiàn)[8]。

1.3生物信息分析方法

利用在線分析工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸理化分析。利用在線分析工具NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。利用在線分析工具WoLF PSORT（http：//wolfpsort.org）、TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和SignalP-3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白在真核細(xì)胞的亞細(xì)胞位置和信號(hào)肽進(jìn)行分析。利用在線分析工具TMPred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析。利用在線分析工具SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測湖羊SPLUNC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用NCBI的在線分析工具Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome）對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。利用在線分析工具3D-PSSM（http//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和RasMol軟件對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用NCBI 的在線分析工具Blast對(duì)湖羊的SPLUNC1進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。利用MEGA 5.05構(gòu)建湖羊SPLUNC1蛋白的分子進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因基本信息與理化性質(zhì)分析

研究利用ExPaSy蛋白數(shù)據(jù)庫中的ProtParam在線工具對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質(zhì)（GenBank登錄號(hào)：AIG92771.1）進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分子式為C1206H2031N305O348S5，原子總數(shù)為3 895，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為26.53 ku，理論等電點(diǎn)為5.07；不穩(wěn)定系數(shù)為 29.88，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為152.08，總平均親水性為0.704，說明該蛋白是疏水蛋白。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的255個(gè)氨基酸中含量最高的是Leu、Gly 和Val，各有62個(gè)、24個(gè)和24個(gè)，分別占24.3%、9.4%和9.4%，且不含有Pyl、 Trp和Sec。利用NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測N-糖基化序列，發(fā)現(xiàn)湖羊的SPLUNC1序列中含有2個(gè)糖基化序列，分別是：NITA和NLTG。由圖1可知，使用亮氨酸拉鏈公式：Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu （X 指代任意氨基酸殘基），在N末端發(fā)現(xiàn)了亮氨酸拉鏈序列。

[FK（W6][TPCKL1.tif][FK）]

2.2湖羊SPLUNC1蛋白的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)域分析

結(jié)合Emanuelsson1等和Paul等的亞細(xì)胞定位方法對(duì)湖羊的SPLUNC1進(jìn)行信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位分析[9-10]。使用這2篇文獻(xiàn)中提到的在線分析工具進(jìn)行分析。

WoLF PSORT預(yù)測運(yùn)用最鄰近結(jié)點(diǎn)算法（k-nearest neighbor algorithm，KNN），K值為32，queryProtein details extr：28，E.R.：3 （extr即extracellular細(xì)胞外的，E.R.即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。點(diǎn)擊網(wǎng)頁結(jié)果中的”details“查看與湖羊SPLUNC1匹配的32個(gè)蛋白中，有28個(gè)與細(xì)胞外蛋白相似，且評(píng)論大部分為分泌蛋白；有3個(gè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)，1個(gè)與溶酶體蛋白相似。

TargetP 1.1 Server結(jié)果表明湖羊SPLUNC1具有分泌途徑，且含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。

按照Emanuelsson1等的建議[9]，對(duì)TargerP 1.1 Server預(yù)測的信號(hào)肽使用SignalP-3.0進(jìn)行再次分析，得出的結(jié)果采用neural networks （NN）算法，湖羊SPLUNC1蛋白的信號(hào)肽切割位點(diǎn)為第19個(gè)氨基酸和第20個(gè)氨基酸之間（圖2）。

[FK（W10][TPCKL2.tif][FK）]

利用在線TMPred工具對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果為：有2個(gè)可能的模型值得考慮，其中一個(gè)模型是N末端在內(nèi)部，有2個(gè)大的跨膜螺旋，分別位于1～21位氨基酸（由內(nèi)到外），47～68位氨基酸（由外到內(nèi)），總分：2 611；另一種模型是有1個(gè)大的跨膜螺旋，位于1～19位氨基酸（由外到內(nèi)），總分：1 260（圖3）。

[FK（W10][TPCKL3.tif][FK）]

綜上所述，湖羊SPLUNC1蛋白含有1個(gè)19位氨基酸的信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外，有2個(gè)大的跨膜螺旋。

2.3湖羊SPLUNC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

本研究利用SOPMA工具預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示參與形成螺旋（alpha helix）的氨基酸有135個(gè)、占52.94%，參與形成延伸直鏈（extended strand）的氨基酸有38個(gè)，占14.90%，參與形成無規(guī)則卷曲（random coil）的氨基酸有69個(gè)，占27.06%。二級(jí)結(jié)構(gòu)分布見圖4。

[FK（W9][TPCKL4.tif][FK）]

2.4湖羊SPLUNC1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

本研究利用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模工具預(yù)測湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，獲得該蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。使用SWISS-MODEL模板庫匹配靶序列的進(jìn)化相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行Blast和HHBlits搜索，在匹配的23個(gè)模板里，模板4 kgo.1.A與湖羊SPLUNC1序列的相似最高。使用RasMol軟件查看預(yù)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折疊片和2個(gè)α螺旋組成的桶形結(jié)構(gòu)域組成（圖5）。

2.5湖羊SPLUNC1蛋白保守區(qū)域預(yù)測

利用NCBI的Blast比對(duì)預(yù)測湖羊SPLUNC1的結(jié)構(gòu)域，由圖6可見，湖羊SPLUNC1蛋白有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中第58個(gè)氨基酸到第233個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域與LBP_BPI_CEPT結(jié)[CM（25]構(gòu)域相似，第104個(gè)氨基酸到第231個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守[CM）]

[FK（W6][TPCKL5.tif][FK）]

結(jié)構(gòu)域與BPI1結(jié)構(gòu)域相似。

2.6湖羊SPLUNC1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

使用NCBI 的Blast在線工具對(duì)湖羊SPLUNC1的氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，湖羊與山羊、家牛、豬、人、小鼠物種相似性為98%、92%、78%、79%、67%。利用Clustal X 1.81軟件對(duì)6個(gè)物種[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，然后使

[FK（W6][TPCKL6.tif][FK）]

用MEGA 5.05的鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）基于該基因氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果構(gòu)建6個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而反映不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化及親緣關(guān)系（由圖7可見，分支節(jié)點(diǎn)處數(shù)字為1 000次Bootstrop檢驗(yàn)的支持百分比）。結(jié)果表明，湖羊和山羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因同屬一個(gè)分支，親緣關(guān)系比較密切，聚為一類，隨后這2者與牛聚為一類，而后與豬聚為一類，而人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因單獨(dú)為1支。

[FK（W9][TPCKL7.tif][FK）]

3結(jié)論與討論

本研究通過DNAMAN、NCBI等在線工具和軟件，對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因的蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析。由分析結(jié)果可知，克隆的湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全長（GenBank登錄號(hào)：KJ749828.1）為1 091 bp，含1個(gè)完整的開放閱讀框（ORF）768 bp，共編碼255個(gè)氨基酸。將湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因翻譯的氨基酸序列與已發(fā)表文章小鼠和豬[1，11]SPLUNC1的信息進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)湖羊的SPLUNC1與小鼠在N端都有亮氨酸拉鏈，且排列的位置相同。小鼠的為MFLVGSLVVLCGLLAHSTAQLAGLPLPL，湖羊的為MFQIGSLIVLCGLLAQTTALLEALPVPL，豬的N端未發(fā)現(xiàn)，表明亮氨酸拉鏈在物種進(jìn)化上存在差異。另外小鼠的糖基化序列是NPTD、NITA和NLTG，湖羊是NITA和NLTG，豬只有1個(gè)糖基化序列NITV。同時(shí)，在小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上發(fā)現(xiàn)的PLPL結(jié)構(gòu)域以及保守結(jié)構(gòu)域蛋白激酶C（SLK）和酪蛋白激酶Ⅱ（SFVD和SGLD）在湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]上沒有被發(fā)現(xiàn)，而豬的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上卻發(fā)現(xiàn)有蛋白激酶C（SLK）序列。

最早先采用的是信號(hào)肽預(yù)測軟件SignalP 4.0分析湖羊SPLUNC1蛋白，發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽切割位點(diǎn)在23～24，而報(bào)道的小鼠和豬的信號(hào)肽切割位點(diǎn)在19～20之間，人的SPLUNC1 蛋白的N 端的信號(hào)肽長度為19個(gè)氨基酸[12]，但是結(jié)合了亞細(xì)胞定位后，支持了信號(hào)肽切割位點(diǎn)為19～20。在亞細(xì)胞定位時(shí)參考了孫偉等和杜慕云等的亞細(xì)胞定位方法[13-14]，對(duì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，用Signal 3.0分析有2個(gè)結(jié)果，neural networks （NN）的分析結(jié)果為信號(hào)肽切割位點(diǎn)為 19～20，hidden Markov models （HMM）的分析結(jié)果為信號(hào)肽切割位點(diǎn)為23～24。綜合比較后，判斷湖羊SPLUNC1的信號(hào)肽切割位點(diǎn)應(yīng)為 19～20之間，但是仍需試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

從近些年的研究報(bào)道中，可以看出大部分的SPLUNC1生物學(xué)研究功能主要在人和鼠上，鮮見羊SPLUNC1生物學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道。此次研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白的基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，初步預(yù)測了湖羊SPLUNC1蛋白所擁有的部分特性，以期為深入探討其生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

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