摘要 以公共數(shù)據(jù)庫中15個(gè)原核模式生物的代表性菌株、假單胞菌屬及其近緣屬75個(gè)物種的代表性菌株以及708個(gè)銅綠假單胞菌的基因組為研究對(duì)象，分析了含有2個(gè)拷貝的核糖體蛋白YggL的基因，發(fā)現(xiàn)YggL可劃分為2個(gè)分支（Clade），并探討了其演化歷程。在銅綠假單胞菌中，相比于Clade I YggL，Clade II YggL在抗生素處理下表達(dá)量顯著降低，且與同屬于核糖體大亞基組成蛋白的Clade II L31、Clade II L36共同表達(dá)。與Clade II YggL共表達(dá)的基因與膜蛋白緊密關(guān)聯(lián)，編碼核糖體蛋白的基因多拷貝現(xiàn)象可能通過影響核糖體狀態(tài)，從而為膜蛋白折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)提供更好的條件。

關(guān)鍵詞 銅綠假單胞菌；基因演化分析；核糖體蛋白；膜蛋白

中圖分類號(hào) Q 78" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A" 文章編號(hào) 0517-6611（2025）04-0077-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.016

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Evolution and Function Analysis of Ribosomal Protein YggL in Pseudomonas aeruginosa

YANG Fan， SHEN Wei， WANG Qiang

（School of Life Sciences， Nanjing University， Nanjing， Jiangsu 210023）

Abstract This study systematically analyzed a double copied gene encoding the ribosomal protein YggL among representative strains of 15 model prokaryotic organisms， 75 representative strains of Pseudomonas and its closely related genues， as well as 708 genomes of Pseudomonas aeruginosa from public databases. YggL can be divided into 2 distinct branches （Clades）. Their evolutionary history was explored. Compared to Clade I YggL， the expression of Clade II YggL significantly decreased under antibiotic treatment in Pseudomonas aeruginosa. Clade II YggL co expressed with Clade II L31 and Clade II L36， which are also components of the ribosomal large subunit. Genes co expressed with Clade II YggL were closely associated with membrane proteins， suggesting that the phenomenon of multiple copies of genes encoding ribosomal proteins may affect ribosomal status， thereby providing better conditions for membrane protein folding and transportation.

Key words Pseudomonas aeruginosa;Gene evolutionary analysis;Ribosomal protein;Membrane protein

作者簡介 楊帆（1999—），女，河北張家口人，碩士研究生，研究方向：植物與微生物的基因演化。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物與微生物的基因演化研究。

收稿日期 2024-04-19

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤、動(dòng)植物、臨床等環(huán)境^［1］。在臨床環(huán)境中，銅綠假單胞菌已成為引發(fā)革蘭氏陰性菌感染的重要原因，尤其在宿主免疫系統(tǒng)受損的患者中更為常見^［2］。作為常見的條件致病菌之一，由銅綠假單胞菌造成的醫(yī)院感染比例高達(dá)10.1%，可導(dǎo)致呼吸道、燒傷創(chuàng)面、泌尿道等嚴(yán)重感染，與許多疾病的高發(fā)病率和死亡率有關(guān)^［3–5］。銅綠假單胞菌的基因組為5.5～7.0 Mbp，比大多數(shù)細(xì)菌都要大^［1，6］。為了適應(yīng)多元的生存環(huán)境，銅綠假單胞菌可通過祖先復(fù)制或者從其他物種水平基因轉(zhuǎn)移的方式來獲得更多與環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的基因^［7-8］。

生物的核糖體是由大、小兩個(gè)亞基組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基包括核糖體RNA（rRNA）和多個(gè)核糖體蛋白（ribosomal proteins，RPs）^［9］。原核生物的70 S核糖體由30 S小亞基和50 S大亞基組成，其中30 S亞基由1個(gè)16 S rRNA和約21種蛋白質(zhì)組成，而50 S亞基由5 S、23 S rRNA和31種蛋白質(zhì)組成^［10］。在細(xì)菌中，核糖體蛋白不僅與核糖體形成和蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)，還可以影響細(xì)胞生命活動(dòng)的其他過程，如生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡和衰老等^［11］。同時(shí)作為許多重要抗生素的靶標(biāo)，核糖體蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究至關(guān)重要^［12］。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，人們對(duì)于核糖體蛋白的認(rèn)識(shí)逐漸深入。有研究報(bào)道，一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白YggL是大腸桿菌核糖體大亞基的組成部分，影響大小亞基組裝成完整核糖體，拓展了對(duì)核糖體結(jié)構(gòu)和功能的了解^［13］。探究銅綠假單胞菌核糖體蛋白的進(jìn)化來源和潛在的功能差異，有助于發(fā)掘其適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境及獲得耐藥性的分子機(jī)制。

筆者在來自厚壁菌門、放線菌門、衣原體門和變形菌門中15個(gè)模式生物的代表性菌株中鑒定了54個(gè)核糖體蛋白，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的YggL、L31和L36各有2個(gè)拷貝，而其他細(xì)菌僅有1個(gè)拷貝。筆者聚焦于新發(fā)現(xiàn)的編碼YggL的基因多拷貝現(xiàn)象，進(jìn)行了系統(tǒng)的演化分析，旨在回答以下問題：①具有2個(gè)YggL拷貝是否是PAO1菌株所獨(dú)有的，或者是銅綠假單胞菌或假單胞菌廣泛擁有的？②2個(gè)YggL拷貝的進(jìn)化起源是什么？③2個(gè)YggL拷貝是否分化出新的功能并參與不同的生物學(xué)過程？

1 材料與方法

1.1 蛋白鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）下載γ-變形菌綱和模式菌株（reference genomes）的公開基因組信息。采用蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定方法，利用NCBIfam、PANTHER以及Pfam中的hmm文件作為種子文件，并使用HMMER軟件^［14］中的HMMsearch工具分析，設(shè)置參數(shù)為E-value=1e-5，進(jìn)而完成對(duì)Ribosomal Protein Gene Database（RPG）數(shù)據(jù)庫（http：//ribosome.med.miyazaki u.ac.jp）列出的模式生物大腸桿菌的53個(gè)細(xì)菌核糖體蛋白及近年新發(fā)現(xiàn)的YggL的鑒定。

1.2 進(jìn)化樹的構(gòu)建

通過HMMsearch鑒定出用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的120個(gè)細(xì)菌蛋白（bac 120）^［15］。使用MUSCLE軟件^［16］對(duì)bac 120和鑒定出的核糖體蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，利用IQ-TREE^［17］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和蛋白進(jìn)化樹，并采用iTOL^［18］（interactive tree of life）進(jìn)行標(biāo)注和美化，以提高樹形圖的可視化效果。

1.3 基因組學(xué)分析

基因組學(xué)分析包括共線性分析和泛基因組分析。從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載相應(yīng)菌株的基因組組裝文件及注釋文件，用Clinker軟件^［19］進(jìn)行共線性分析，以銅綠假單胞菌的模式菌株P(guān)AO1作為參照。使用PPanGGOLiN^［20］對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫公開的708株銅綠假單胞菌的基因組序列進(jìn)行泛基因組分析，使用Gephi軟件^［21］對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ColabFold^［22］對(duì)YggL的2個(gè)拷貝進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，在PyMOL^［23］軟件中進(jìn)行2個(gè)拷貝之間的差異情況分析。

1.5 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）

從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.pseudomonas.com）中下載銅綠假單胞菌PAO1在不同處理?xiàng)l件下的基因芯片數(shù)據(jù)。由于不同數(shù)據(jù)集在數(shù)據(jù)量和測序深度上存在差異，因此僅從23個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中選取16個(gè)有Gene Expression Omnibus Series（GSE）原始數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。用R語言affy軟件包^［24］中的mas5函數(shù)對(duì)GSE原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)處理?xiàng)l件將203個(gè)樣本分成36個(gè)測試組，從這36個(gè)測試組中隨機(jī)選擇1、2或3個(gè)條件的組合，共得到7 806個(gè)不同的條件組合，去除未發(fā)現(xiàn)共表達(dá)情況的33個(gè)條件組合，總計(jì)條件組合為7 773個(gè)。用R語言WGCNA軟件包^［25］分別對(duì)3類核糖體蛋白的不同拷貝進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)定閾值gt;μ+2σ以篩選出具有實(shí)際統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的共表達(dá)基因，以韋恩圖的形式展示^［26］。通過DAVID^［27］進(jìn)行GO分析，GO分析的結(jié)果用R中的ggplot2包^［28］進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 核糖體蛋白YggL在細(xì)菌中的分布情況

為全面了解核糖體蛋白在細(xì)菌中的存在情況，選取來自厚壁菌門、放線菌門、衣原體門和變形菌門中15個(gè)模式生物的代表性菌株，觀察了RPG數(shù)據(jù)庫收錄的模式生物大腸桿菌的53個(gè)核糖體蛋白及近年來新發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白YggL在這些菌株中的分布模式。與其他代表性菌株只存在1個(gè)拷貝不同，在銅綠假單胞菌模式菌株P(guān)AO1中，核糖體蛋白L31、L36和YggL均鑒定到2個(gè)不同的拷貝（圖1 A）。此前的研究已經(jīng)明確，銅綠假單胞菌編碼L31和L36的基因位點(diǎn)均存在2個(gè)拷貝的現(xiàn)象，并對(duì)二者的演化歷程進(jìn)行了探究，認(rèn)為L31和L36第2個(gè)拷貝的來源可能由于水平基因轉(zhuǎn)移事件導(dǎo)致，但難以排除變形菌進(jìn)化基礎(chǔ)上的復(fù)制^［29］。值得注意的是，YggL基因也含有2個(gè)拷貝為該研究發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。

通過構(gòu)建15個(gè)模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹和3個(gè)核糖體蛋白的進(jìn)化樹，筆者發(fā)現(xiàn)YggL、L31與L36具有不同的分布模式。相比于同屬于γ-變形菌綱的大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）只含有1個(gè)YggL的情況，銅綠假單胞菌模式菌株P(guān)AO1基因組中含有2個(gè)YggL。與YggL不同，L31與L36分布十分廣泛，不僅存在于γ-變形菌綱中，在厚壁菌門的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、放線菌門的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、衣原體門的沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）等不同門類中也有所分布，且能夠在大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）鑒定出多個(gè)不同的L31和L36（圖1 B）。為便于描述，筆者將3類核糖體蛋白中存在于多數(shù)菌株的分支稱為Clade I，只存在于少數(shù)菌株的核糖體蛋白分支稱為Clade II。Clade I YggL由PA3046編碼，Clade II YggL由PA1842編碼；Clade I L31由PA5049/rpmE編碼，Clade II L31由PA3601編碼；Clade I L36由PA4242/rpmJ編碼，Clade II L36由PA3600編碼。

在銅綠假單胞菌708個(gè)完全組裝的基因組中，該研究共鑒定出1 415個(gè)YggL，1 414個(gè)L31和1 415個(gè)L36，表明這3類核糖體蛋白的雙拷貝現(xiàn)象在銅綠假單胞菌菌株中穩(wěn)定存在（表1）。這有助于繼續(xù)深入研究核糖體蛋白額外拷貝的起源、功能分化特性及其對(duì)生物適應(yīng)性的意義。

為了驗(yàn)證1 415個(gè)YggL，1 414個(gè)L31和1 415個(gè)L36在708株銅綠假單胞菌中是否均勻分布，該研究分別構(gòu)建了這3類核糖體蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，YggL、L31和L36的2個(gè)拷貝均勻分布在2個(gè)支系中（圖2 A）。除了最為典型的PAO1菌株外，該研究還選取了假單胞菌屬基因組數(shù)據(jù)庫注釋的4個(gè)常見菌株P(guān)AK、PA7、UCBPP_PA14和LESB58，觀察其在系統(tǒng)發(fā)育樹上的分布并加以標(biāo)注。值得注意的是，PA7來源于銅綠假單胞菌離群分支（outlier clade），雖然有研究建議將這些異常菌株歸類為新的物種——副銅綠假單胞菌（Pseudomonas paraeruginosa）^［30］，但目前文獻(xiàn)中對(duì)這些銅綠假單胞菌離群菌株的分類仍存在爭議，該研究仍視PA7為銅綠假單胞菌。

為進(jìn)一步探究該現(xiàn)象在708個(gè)銅綠假單胞菌菌株中是否具有普遍性，進(jìn)行了銅綠假單胞菌的泛基因組分析。與Clade I YggL、L31和L36各自的2個(gè)拷貝不同，Clade II YggL附近存在1個(gè)與基因組保守性或特定的分布模式相關(guān)的殼基因（shell gene），并未在群體中固定下來，反映了其所在的基因座的不穩(wěn)定性（圖2 B）。因此，推測YggL第2個(gè)拷貝的產(chǎn)生與保留可能是由于近期受到了環(huán)境的影響，是銅綠假單胞菌適應(yīng)環(huán)境的選擇。

2.2 銅綠假單胞菌2個(gè)YggL的演化來源

該研究試圖追蹤YggL基因2個(gè)拷貝的演化起源，對(duì)其所在的假單胞菌屬、近緣的固氮菌屬和Stutzerimonas屬（Pseudomonas stutzeri新被劃分至其中）共74個(gè)物種構(gòu)建了屬水平的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3 A左）和YggL蛋白的進(jìn)化樹（圖3 A右）。該研究發(fā)現(xiàn)，盡管某些假單胞菌部分菌株YggL的拷貝數(shù)大于1.0（表1），但其代表性菌株僅擁有單拷貝，說明大部分假單胞菌物種并非穩(wěn)定擁有2個(gè)YggL，體現(xiàn)了銅綠假單胞菌的特殊性。3類Clade I核糖體蛋白的基因樹與假單胞菌屬水平的物種樹結(jié)構(gòu)一致；3類Clade II的核糖體蛋白只在少量的物種中分布，Clade II YggL在5個(gè)物種中分布，Clade II L31在30個(gè)物種中分布，Clade II L36在7個(gè)物種中分布?；诨驑渑c物種樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的相似性，判斷3類Clade I的核糖體蛋白來源于祖先繼承，而3類Clade II的核糖體蛋白的多拷貝現(xiàn)象在屬內(nèi)的物種分布并非完全一致（圖3A）。

為進(jìn)一步確認(rèn)銅綠假單胞菌YggL第2個(gè)拷貝的來源，該研究在NR庫進(jìn)行了檢索，發(fā)現(xiàn)YggL僅存在于γ-變形菌綱內(nèi)，因此構(gòu)建了整個(gè)γ-變形菌綱的YggL進(jìn)化樹。與Clade I YggL和Clade II YggL相鄰的其他家族的YggL被當(dāng)作潛在靶標(biāo)，并在方框中清晰展示（圖3B），用于探究銅綠假單胞菌YggL額外拷貝的可能來源。共線性分析結(jié)果顯示，YggL的2個(gè)拷貝及其同源基因均表現(xiàn)出良好的同源性和相似性，Clade II YggL只存在于假單胞菌及其固氮菌屬的近緣物種Azotobacter vinelandii中，并未找到其可能來源的遠(yuǎn)緣物種。因此，難以明確YggL第2個(gè)拷貝是來源于自身基因組中祖先基因的復(fù)制還是其他物種水平的基因轉(zhuǎn)移（圖3C）。

2.3 銅綠假單胞菌中2個(gè)YggL的功能分析

基于結(jié)構(gòu)決定功能這一普遍認(rèn)知，為深入探究2個(gè)YggL之間的功能異同，該研究利用ColabFold對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Clade I YggL與Clade II YggL之間的結(jié)構(gòu)相似性較低，且存在明顯差異，暗示著Clade II YggL的出現(xiàn)可能會(huì)導(dǎo)致核糖體的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（圖4）。通過統(tǒng)計(jì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（表2）中36個(gè)測試條件下3類核糖體蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在阿奇霉素、妥布霉素、黏菌素、慶大霉素4種不同抗生素處理的條件下，Clade II YggL、Clade II L31及Clade II L36的表達(dá)量顯著降低，且Clade II YggL對(duì)抗生素可能更為敏感（雙尾Mann-Whitney檢驗(yàn)，Plt;0.001，圖5）。這些抗生素大部分通過靶向細(xì)菌核糖體來發(fā)揮其抗菌活性^［31-32］。

除上述抗生素條件會(huì)改變幾個(gè)核糖體蛋白的表達(dá)量外，并未發(fā)現(xiàn)其他條件能明顯區(qū)分幾類核糖體蛋白的表達(dá)情況。因此，該研究采取加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）的方法，利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，旨在預(yù)測Clade II YggL的功能以及識(shí)別與其共表達(dá)的關(guān)鍵基因，從而深入了解YggL多拷貝現(xiàn)象在銅綠假單胞菌中的功能和重要性。筆者將36個(gè)測試條件排列組合得到7 773個(gè)條件組合，設(shè)定共表達(dá)次數(shù)大于閾值平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差（μ+2σ）來篩選與3類核糖體蛋白顯著共表達(dá)的基因（圖6）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在該標(biāo)準(zhǔn)下，與Clade I YggL存在相同表達(dá)趨勢的基因總計(jì)199個(gè)，與Clade II YggL存在相同表達(dá)趨勢的基因總計(jì)236個(gè)（圖7）。

2個(gè)YggL共表達(dá)基因的交集僅有43個(gè)，2個(gè)拷貝之間并未觀察到共表達(dá)關(guān)系（圖8）。特別值得注意的是，作為核糖體蛋白，Clade II YggL與Clade II L31及Clade II L36之間存在共同表達(dá)的現(xiàn)象，與Clade II YggL共表達(dá)的236個(gè)基因中有133個(gè)與Clade II L36的共表達(dá)基因一致，有109個(gè)與Clade I L31的共表達(dá)基因一致。在Clade II L31與Clade II L36之間也發(fā)現(xiàn)了明顯的共表達(dá)現(xiàn)象（圖8）。這與之前觀察到的抗生素處理?xiàng)l件下基因表達(dá)量降低的現(xiàn)象相吻合，可能是由于三者均受到了抗生素的抑制，提示此三者可能共同表達(dá)，行使一致的生物學(xué)功能（圖5，表3）。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，Clade II YggL與Clade II L31、Clade II YggL與Clade II L36以及Clade II L31與Clade II L36共同共表達(dá)的基因參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程，且與膜相關(guān)的細(xì)胞組分、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能有關(guān)（圖8）。KEGG的結(jié)果也表明，在銅綠假單胞菌中，Clade II YggL與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在共表達(dá)現(xiàn)象。經(jīng)檢驗(yàn)，與Clade II YggL、Clade II L31以及Clade II L36共表達(dá)的基因與編碼膜蛋白的基因顯著相關(guān)（圖9）。考慮到膜蛋白折疊通常需要特殊的條件，該研究推測Clade II YggL、Clade II L31與Clade II L36可能通過改變核糖體狀態(tài)為膜蛋白創(chuàng)造一個(gè)更好的折疊條件，因此始終同膜蛋白基因共表達(dá)。

3 討論

銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性的條件性致病菌，近年來已成為臨床中最常見的病原菌之一，其能夠天然抵抗抗生素，且這種耐藥性逐步增強(qiáng)，嚴(yán)重阻礙了臨床治療的效果^［33］。不合理使用抗菌藥物、大量使用免疫抑制劑等多種因素是導(dǎo)致銅綠假單胞菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要原因^［33］。目前雖然對(duì)多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的治療已經(jīng)取得長足進(jìn)展，但在多重耐藥革蘭氏陰性菌尤其是銅綠假單胞菌的治療中，尚未發(fā)現(xiàn)有效的新藥^［34］。研究銅綠假單胞菌適應(yīng)環(huán)境的生物學(xué)過程和分子機(jī)理，對(duì)于改善臨床治療，預(yù)防感染傳播，推動(dòng)新藥開發(fā)及維護(hù)全球衛(wèi)生安全具有重要意義。

核糖體蛋白在細(xì)胞內(nèi)參與核糖體的生物合成，而核糖體則是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵場所。該研究發(fā)現(xiàn)，編碼核糖體大亞基組成蛋白YggL、L31與L36的基因在銅綠假單胞菌基因組中均含有2個(gè)拷貝，并對(duì)三者在細(xì)菌中的分布情況和YggL的演化歷程進(jìn)行了追蹤。Clade II YggL、Clade II L31與Clade II L36的表達(dá)量在抗生素處理?xiàng)l件下顯著降低，三者之間存在共表達(dá)的現(xiàn)象，且共表達(dá)基因與膜蛋白基因緊密關(guān)聯(lián)。膜蛋白特有的折疊方式和可溶性蛋白質(zhì)不同，通常受到膜環(huán)境的影響。膜蛋白的氨基酸序列中存在影響蛋白折疊和插入的信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)于維持膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，可指導(dǎo)下列生物學(xué)過程^［35-36］：①共翻譯過程：引導(dǎo)其他信號(hào)分子與核糖體相互作用，共翻譯識(shí)別新生肽鏈，指導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊。②插入：膜蛋白在轉(zhuǎn)位復(fù)合物的引導(dǎo)和催化下跨過磷脂雙分子層，這種方式也產(chǎn)生了一些膜插入片段及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。③插入后折疊：根據(jù)磷脂雙分子層不同部分的氨基酸偏好、蛋白質(zhì)本身內(nèi)部相互作用以及蛋白質(zhì)與磷脂雙分子層之間相互作用等因素完成膜蛋白的折疊。Clade II YggL、Clade II L31與Clade II L36核糖體蛋白涉及的生物學(xué)過程基本一致，表明這種多拷貝現(xiàn)象并非使核糖體狀態(tài)增加3類蛋白隨機(jī)組合的6種不同狀態(tài)，而是只增加了1種狀態(tài)，使核糖體可在2種狀態(tài)之間切換。Clade II YggL、Clade II L31與Clade II L36可能通過改變核糖體狀態(tài)，促進(jìn)與膜蛋白信號(hào)的共翻譯，從而為膜蛋白創(chuàng)造更好的折疊條件，因此編碼Clade II YggL的基因始終同膜蛋白基因共表達(dá)。此外，表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，抗生素處理?xiàng)l件下，Clade II YggL表達(dá)量顯著降低?；贑lade II YggL對(duì)膜蛋白的重要性，該研究認(rèn)為這一現(xiàn)象的產(chǎn)生原因有2種可能：其一為Clade II YggL在抗生素的脅迫下被動(dòng)減少表達(dá)；其二為Clade II YggL主動(dòng)減少表達(dá)，進(jìn)而影響膜蛋白的翻譯與折疊過程，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，以此減弱抗生素的作用。總而言之，YggL、L31、L36的多拷貝現(xiàn)象和膜蛋白基因顯著關(guān)聯(lián)的機(jī)制為進(jìn)一步理解臨床中銅綠假單胞菌獲得抗生素耐藥性提供了重要參考，但具體的適應(yīng)性機(jī)制有待進(jìn)一步的研究來明確。

此外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為最大的跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族之一，利用水解ATP產(chǎn)生的能量，實(shí)現(xiàn)對(duì)從離子到蛋白質(zhì)等各種大小物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)^［37-38］。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，其依靠構(gòu)象改變來實(shí)現(xiàn)不同的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制^［39］。一方面，其可以向外轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，參與有毒的內(nèi)源分子和外源物質(zhì)從細(xì)胞中排出的過程。在細(xì)菌等原核生物中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)膜上，介導(dǎo)糖類、氨基酸、脂質(zhì)和多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)，也可以外排多種抗生素，增強(qiáng)菌株耐藥性。已有研究結(jié)果表明，臨床中常見病原菌（如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌和大腸桿菌等）都存在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的抗生素外排^［40-43］。另一方面，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，如通過攝取氨基酸增加細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收^［44-46］。該研究的KEGG結(jié)果表明，在銅綠假單胞菌中，Clade II YggL、Clade II L31與Clade II L36與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在共表達(dá)現(xiàn)象，提示核糖體蛋白的多拷貝現(xiàn)象可能與抗生素吸收與外排相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

該研究提供了銅綠假單胞菌通過增加核糖體蛋白的基因拷貝數(shù)改變核糖體狀態(tài)以及影響膜蛋白折疊的新思路，對(duì)于理解銅綠假單胞菌適應(yīng)環(huán)境的生物學(xué)過程，及未來預(yù)防銅綠假單胞菌的臨床感染具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

［1］ KLOCKGETHER J，CRAMER N，WIEHLMANN L，et al.Pseudomonas aeruginosa genomic structure and diversity［J］.Frontiers in microbiology，2011，2：1-18.

［2］ IHSSANE B，F(xiàn)ATIMA E，ABOUBAKR K，et al.New alternative therapeutic strategies against Pseudomonas aeruginosa，an opportunistic multi resistant pathogen with a myriad of virulence factors［J］.Journal of infection in developing countries，2023，17（7）：891-904.

［3］ JONES R N.Microbial etiologies of hospital acquired bacterial pneumonia and" ventilator associated bacterial pneumonia［J］.Clinical infectious diseases，2010，51（S1）：S81-S87.

［4］ JURADO MARTN I，SAINZ MEJAS M，MCCLEAN S.Pseudomonas aeruginosa：An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors［J］.International journal of molecular sciences，2021，22（6）：1-37.

［5］ 張明月，胡福泉，黃廣濤.銅綠假單胞菌必需基因的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2021，48（6）：2143-2154.

［6］ PANG Z，RAUDONIS R，GLICK B R，et al.Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa：Mechanisms and alternative therapeutic strategies［J］.Biotechnology advances，2019，37（1）：177-192.

［7］ KUNG V L，OZER E A，HAUSER A R.The accessory genome of Pseudomonas aeruginosa［J］.Microbiology and molecular biology reviews，2010，74（4）：621-641.

［8］ 顧祥文，王強(qiáng).銅綠假單胞菌紅素氧還蛋白的演化分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（12）：9-14，20.

［9］ BHAVSAR R B，MAKLEY L N，TSONIS P A.The other lives of ribosomal proteins［J］.Human genomics，2010，4（5）：327-344.

［10］ KOROBEINIKOVA A V，GARBER M B，GONGADZE G M.Ribosomal proteins：Structure，function，and evolution［J］.Biochemistry，2012，77（6）：562-574.

［11］ WOOL I G.Extraribosomal functions of ribosomal proteins［J］.Trends in biochemical sciences，1996，21（5）：164-165.

［12］ RAMAKRISHNAN V.Ribosome structure and the mechanism of translation［J］.Cell，2002，108（4）：557-572.

［13］ HR J，DI GIORGIO S，GEROVAC M，et al.Grad seq shines light on unrecognized RNA and protein complexes in the model bacterium Escherichia coli［J］.Nucleic acids research，2020，48（16）：9301-9319.

［14］ POTTER S C，LUCIANI A，EDDY S R，et al.HMMER web server：2018 update［J］.Nucleic acids research，2018，46：W200-W204.

［15］ PARKS D H，RINKE C，CHUVOCHINA M，et al.Recovery of nearly 8，000 metagenome assembled genomes substantially expands the tree of life［J］.Nature microbiology，2017，2（11）：1533-1542.

［16］ NGUYEN K D，PAN Y.Multiple sequence alignment based on dynamic weighted guidance tree［J］.International journal of bioinformatics research and applications，2011，7（2）：168-182.

［17］ NGUYEN L T，SCHMIDT H A，VON HAESELER A，et al.IQ TREE：A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum likelihood phylogenies［J］.Molecular biology and evolution，2015，32（1）：268-274.

［18］ LETUNIC I，BORK P.Interactive Tree Of Life（iTOL）v5：An online tool for phylogenetic tree display and annotation［J］.Nucleic acids research，2021，49：W293-W296.

［19］ GILCHRIST C L M，CHOOI Y H.Clinker amp; clustermap.js：Automatic generation of gene cluster comparison figures［J］.Bioinformatics，2021，37（16）：2473-2475.

［20］ GAUTREAU G，BAZIN A，GACHET M，et al.PPanGGOLiN：Depicting microbial diversity via a partitioned pangenome graph［J］.PLoS computational biology，2020，16（3）：1-27.

［21］ BASTIAN M，HEYMANN S，JACOMY M.Gephi：An open source software for exploring and manipulating networks［J］.Proceedings of the third international AAAI conference on weblogs and social media，2009，3（1）：361-362.

［22］ MIRDITA M，SCHTZE K，MORIWAKI Y，et al.ColabFold：Making protein folding accessible to all［J］.Nature methods，2022，19（6）：679-682.

［23］ DELANO W L.Pymol：An open source molecular graphics tool［J］.Newsletter on protein crystallography，2002，40：1-8.

［24］ GAUTIER L，COPE L，BOLSTAD B M，et al.Affy：Analysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level［J］.Bioinformatics，2004，20（3）：307-315.

［25］ LANGFELDER P，HORVATH S.WGCNA：An R package for weighted correlation network analysis［J］.BMC bioinformatics，2008，9：1-13.

［26］ BARDOU P，MARIETTE J，ESCUDI F，et al.Jvenn：An interactive Venn diagram viewer［J］.BMC bioinformatics，2014，15（1）：1-7.

［27］ SHERMAN B T，HAO M，QIU J，et al.DAVID：A web server for functional enrichment analysis and functional annotation of gene lists（2021 update）［J］.Nucleic acids research，2022，50：W216-W221.

［28］ GINESTET C.ggplot2：Elegant graphics for data analysis［J］.Journal of the royal statistical society series A：Statistics in society，2011，174（1）：245-246.

［29］MAKAROVA K S，PONOMAREV V A，KOONIN E V.Two C or not two C：Recurrent disruption of Zn ribbons，gene duplication，lineage specific gene loss，and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins［J］.Genome biology，2001，2（9）：1-14.

［30］ RUDRA B，DUNCAN L，SHAH A J，et al.Phylogenomic and comparative genomic studies robustly demarcate two distinct clades of Pseudomonas aeruginosa strains：Proposal to transfer the strains from an outlier clade to a novel species Pseudomonas paraeruginosa sp.nov［J］.International journal of systematic and evolutionary microbiology，2022，72（11）：1-15.

［31］ JELIC′ D，ANTOLOVIC′ R.From erythromycin to azithromycin and new potential ribosome binding antimicrobials［J］.Antibiotics（Basel），2016，5（3）：1-13.

［32］ FOSSO M Y，ZHU H，GREEN K D，et al.Tobramycin variants with enhanced ribosome targeting activity［J］.Chembiochem，2015，16（11）：1565-1570.

［33］ 白云，史永勝，方巧巧，等.醫(yī)院2019—2023年銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性分析［J］.臨床合理用藥雜志，2024，17（6）：44-46.

［34］ 黃心林，成海恩，李振鵬.銅綠假單胞菌的多黏菌素耐藥機(jī)制［J］.國外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)），2024，45（1）：12-19.

［35］ HUBER D，JAMSHAD M，HANMER R，et al.SecA cotranslationally interacts with nascent substrate proteins in vivo［J］.Journal of bacteriology，2017，199（2）：1-14.

［36］ BOWIE J U.Solving the membrane protein folding problem［J］.Nature，2005，438（7068）：581-589.

［37］ HOLLAND I B.ABC transporters，mechanisms and biology：An overview［J］.Essays in biochemistry，2011，50（1）：1-17.

［38］ YU J，GE J，HEUVELING J，et al.Structural basis for substrate specificity of an amino acid ABC transporter［J］.PNAS，2015，112（16）：5243-5248.

［39］ PAOLINI A，BALDASSARRE A，DEL GAUDIO I，et al.Structural features of the ATP binding cassette（ABC）transporter ABCA3［J］.International journal of molecular sciences，2015，16（8）：19631-19644.

［40］ ROBERTSON G T，DOYLE T B，LYNCH A S.Use of an efflux deficient Streptococcus pneumoniae strain panel to identify ABC class multidrug transporters involved in intrinsic resistance to antimicrobial agents［J］.Antimicrobial agents and chemotherapy，2005，49（11）：4781-4783.

［41］ ARII K，KAWADA MATSUO M，OOGAI Y，et al.Single mutations in BraRS confer high resistance against nisin A in Staphylococcus aureus［J］.MicrobiologyOpen，2019，8（11）：1-14.

［42］ ZHAO K L，LIU Y，ZHANG X Y，et al.Detection and characterization of antibiotic resistance genes in Arcanobacterium pyogenes strains from abscesses of forest musk deer［J］.Journal of medical microbiology，2011，60：1820-1826.

［43］ BOUNTRA K，HAGELUEKEN G，CHOUDHURY H G，et al.Structural basis for antibacterial peptide self immunity by the bacterial ABC transporter McjD［J］.The EMBO journal，2017，36（20）：3062-3079.

［44］ BERGER E A，HEPPEL L A.Different mechanisms of energy coupling for the shock sensitive and shock resistant amino acid permeases of Escherichia coli［J］.Journal of biological chemistry，1974，249（24）：7747-7755.

［45］ THEODOULOU F L，KERR I D.ABC transporter research：Going strong 40 years on［J］.Biochemical society transactions，2015，43（5）：1033-1040.

［46］ LEE M，CHOI Y，BURLA B，et al.The ABC transporter AtABCB14 is a malate importer and modulates stomatal response to CO 2［J］.Nature cell biology，2008，10（10）：1217-1223.