摘 要：肉類食品是全球消費(fèi)者的重要蛋白質(zhì)來源，但微生物引起的腐敗不僅會(huì)導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失，還可能引發(fā)食源性疾病。經(jīng)典的微生物檢測方法雖然操作簡單，但存在檢測時(shí)間長、靈敏度低等不足，難以滿足現(xiàn)代食品安全保障的需求。近年來，隨著肉品微生物檢測新技術(shù)的應(yīng)用，微生物檢測在速度、靈敏度和特異性方面得到顯著提升。本文綜述培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、生化反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測及熒光檢測等經(jīng)典檢測方法的優(yōu)勢和不足，介紹高通量測序、數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、紅外光譜、拉曼光譜和高光譜等新技術(shù)的檢測原理和技術(shù)優(yōu)勢，探討其在未來食品安全檢測中的應(yīng)用前景，旨在為提高肉品安全的監(jiān)測水平提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：肉品微生物；食品安全；經(jīng)典檢測技術(shù)；微生物檢測新技術(shù)；應(yīng)用

Application of New Microbial Detection Techniques in Meats： An Update

XIONG Yinghan1， LI Chongyan2， LI Ruolin2， WU Rao2， ZHOU Zhiwei2， SUN Honghu3， SUN Qun1，2，*

（1. College of Light Industry Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610064， China;

2. College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China;

3. Irradiation Preservation Key Laboratory of Sichuan， Chengdu Institute of Food Inspection， Chengdu 611135， China）

Abstract： Meat is a vital source of protein for consumers worldwide. Microbial spoilage not only leads to economic losses， but also may cause foodborne illnesses. Classical detection techniques are simple to operate but also have some drawbacks such as long detection time and low sensitivity， making them inadequate to meet the demands of modern food safety. With the application of new techniques， microbial detection has seen dramatic improvements in speed， sensitivity， and specificity. This review summaries the advantages and shortcomings of classical microbial detection methods， including culture， immunology， biochemical reaction， polymerase chain reaction （PCR）， and fluorescence， and introduces the principles and advantages of new technologies such as high-throughput sequencing， digital PCR （dPCR）， matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）， infrared spectroscopy， Raman spectroscopy， and hyperspectroscopy. Future prospects for their application in food safety testing are also explored， aiming to provide technical support for improving meat safety monitoring.

Keywords： meat microbiology; food safety; classical detection techniques; new microbial detection techniques; application

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240902-228

中圖分類號(hào)：TS251.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2025）02-0046-09

引文格式：

熊穎涵， 李重言， 李若林， 等. 微生物檢測新技術(shù)在肉品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2025， 39（2）： 46-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240902-228." "http：//www.rlyj.net.cn

XIONG Yinghan， LI Chongyan， LI Ruolin， et al. Application of new microbial detection techniques in meats： an update[J]. Meat Research， 2025， 39（2）： 46-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240902-228." "http：//www.rlyj.net.cn

肉類及其制品是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素的重要來源。隨著全球人口增長和生活水平提高，全球肉類產(chǎn)量從2016年的3.171 7億 t增加到2024年的3.506 4億 t[1]。然而，肉品的豐富營養(yǎng)是微生物的理想培養(yǎng)基，新鮮肉品的高水分活度（＞0.998）及中性至微酸性的pH值為各種細(xì)菌和真菌提供了理想的生長環(huán)境，加之脂質(zhì)氧化和酶促自溶作用，共同促進(jìn)了肉品的腐敗。全球每年有7 300～9 100萬 t肉類因腐敗而被浪費(fèi)[2]，這不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還引發(fā)了嚴(yán)重的食品安全問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年約有6億 人患食源性疾病，其中有42萬 人因食用不安全食品而死亡，其中由微生物性致病因子引起的病例占總發(fā)病人數(shù)的60%以上[3]。在我國，肉類是引發(fā)食源性疾病暴發(fā)的第二大常見食品類別，占所有食源性疾病暴發(fā)總數(shù)的16.4%，因此對(duì)肉品中微生物的檢測尤為重要[4]。

目前，肉品微生物的檢測主要依賴于經(jīng)典的檢測方法，如培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、生化反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測及熒光檢測等，雖然這些方法操作簡單、成本較低，但存在檢測時(shí)間長、靈敏度低和操作過程復(fù)雜等局限，難以滿足現(xiàn)代食品特別是肉品安全的快速檢測和溯源需求。近年來，隨著高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、紅外光譜、拉曼光譜和高光譜等新技術(shù)的出現(xiàn)，肉品微生物檢測在速度、靈敏度和特異性方面得到顯著提升。HTS可以提供詳盡的基因組信息，dPCR適用于低豐度病原體的檢測，MALDI-TOF MS可實(shí)現(xiàn)快速、高度精確的鑒定，而紅外光譜、拉曼光譜和高光譜技術(shù)則通過無損檢測手段促進(jìn)了實(shí)時(shí)質(zhì)量安全的監(jiān)控。這些新技術(shù)不僅克服了經(jīng)典方法的多種局限性，還通過更精準(zhǔn)、快捷的分析手段，大幅提高檢測效率。當(dāng)然，新的檢測技術(shù)也面臨著挑戰(zhàn)，如設(shè)備成本高、操作復(fù)雜及缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化流程。

基于此，本文對(duì)肉品中微生物檢測經(jīng)典方法的優(yōu)勢和不足進(jìn)行總結(jié)，著重介紹一系列新型檢測技術(shù)的原理、優(yōu)勢，探討其在未來食品安全檢測中的應(yīng)用前景，旨在為提高肉品安全的監(jiān)測水平提供技術(shù)支持。

1 肉品微生物經(jīng)典檢測技術(shù)

1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

傳統(tǒng)培養(yǎng)法仍是檢測肉品微生物的主要標(biāo)準(zhǔn)。該方法通過將待檢樣本接種在特定的培養(yǎng)基上，并在適宜的條件下孵育形成菌落，再根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色和大小初步鑒定微生物種類。細(xì)菌和真菌都能夠在培養(yǎng)基上生長，形成可見菌落后進(jìn)行初步檢測，并根據(jù)需要進(jìn)行其他下游檢測。該方法無需復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)，成本較低，適合各種實(shí)驗(yàn)室條件，可生成基于培養(yǎng)基的食品病原體定性和定量數(shù)據(jù)。目前，GB 4789系列《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》均是以傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)為基礎(chǔ)的經(jīng)典檢驗(yàn)方法，培養(yǎng)法仍是食品微生物檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法的顯著缺點(diǎn)是操作繁瑣，需提前配制培養(yǎng)基，稀釋管、槍頭等用品需要高壓滅菌，樣品的前處理、增菌和分離培養(yǎng)通常需要48 h以上，致病菌和真菌檢測常需要1 周甚至更長的時(shí)間，因此不適用于食源性病原菌的現(xiàn)場快速檢測。此外，一些可培養(yǎng)的細(xì)菌（如傷寒桿菌和大腸桿菌）可能因環(huán)境壓力導(dǎo)致其以具有活力但不可培養(yǎng)的形式存在，使檢測產(chǎn)生假陰性結(jié)果[5]。某些微生物可能在特定培養(yǎng)基上無法生長或生長緩慢，且低濃度的微生物難以被檢測到。

1.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)檢測方法是通過抗原-抗體的特異性結(jié)合來識(shí)別待測成分。通常采用酶聯(lián)、熒光或膠體金等方式放大信號(hào)。檢測時(shí)，顏色深淺與待檢物質(zhì)的量成比例，可直接根據(jù)顏色深淺進(jìn)行樣品分析。常見的方法如酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）因其高通量、良好的特異性和穩(wěn)健性及操作簡便而被廣泛使用[6]。王利剛[7]利用全自動(dòng)ELISA熒光分析儀法對(duì)生鮮肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行檢測，將檢測時(shí)間從傳統(tǒng)檢測周期所需的4～5 d縮短至51 h。免疫學(xué)檢測方法的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更快，通常可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，可以檢測毒素，且能夠特異性地識(shí)別目標(biāo)微生物，適用于檢測難以培養(yǎng)的微生物。ELISA試劑盒法已被廣泛應(yīng)用于葡萄球菌腸毒素、黃曲霉毒素B1等微生物相關(guān)毒素的測定。

然而傳統(tǒng)ELISA技術(shù)仍存在一些缺點(diǎn)，其檢測限（最低102 CFU/mL）不足以達(dá)到許多蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的臨床閾值，難以檢測微生物污染早期階段的低濃度抗原。此外，食品中的脂肪、鹽類、碳水化合物等共存成分可能會(huì)抑制抗體與抗原的結(jié)合，導(dǎo)致ELISA檢測受限。加之ELISA試劑盒價(jià)格較高，導(dǎo)致其檢測成本高昂。

1.3 生化測試

生化測試方法是通過檢測微生物在特定生化反應(yīng)中的反應(yīng)產(chǎn)物或相關(guān)酶活性鑒定微生物的種類和數(shù)量。生化反應(yīng)可以通過檢測細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物鑒別細(xì)菌的種屬。例如，糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、Voges-Proskauer試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等，這些生化試驗(yàn)通常在特定的培養(yǎng)基中進(jìn)行，可以提供關(guān)于微生物代謝特性的重要信息，有助于微生物的鑒定和分類[8]。生化測試檢測方法具有檢測特異性較高、成本較低、可了解微生物的代謝特性和生理功能的優(yōu)點(diǎn)。目前，商品化的微生物生化鑒定試劑盒和配套儀器設(shè)備可將多個(gè)生化測試集成并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化培養(yǎng)和分析鑒別，如梅里埃VITEK 2 Compact的全自動(dòng)藥敏分析儀、梅里埃AIP 20E等。

生化測試檢測的缺點(diǎn)在于檢測時(shí)間較長，通常需要24 h以上才能完成。對(duì)于復(fù)雜的微生物群體，可能需要多種生化測試來確認(rèn)，難以在生產(chǎn)加工現(xiàn)場進(jìn)行檢測。此外，結(jié)果解讀依賴專業(yè)人士，主觀因素可能影響準(zhǔn)確性。

1.4 PCR檢測

PCR可以對(duì)特定的DNA和RNA系列進(jìn)行擴(kuò)增，因其特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好而被廣泛應(yīng)用。PCR提供了更準(zhǔn)確、靈敏和快速的單一細(xì)菌或基因檢測，避免傳統(tǒng)方法的表型特征模棱兩可的情況。Heo等[9]利用hlyA基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立的PCR法可以區(qū)分單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和其他3 種同屬異種菌。PCR技術(shù)的應(yīng)用極大優(yōu)化了檢測步驟，縮短了檢測時(shí)間。目前，GB 4789.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》及GB 4789.40—2024《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌檢驗(yàn)》中致瀉大腸埃希氏菌、克羅諾桿菌等致病菌可使用PCR和電泳的方式進(jìn)行檢測。

PCR系列技術(shù)在用于病原體檢測的過程中也存在一些不足，如易受PCR抑制劑影響，且檢測前需要分離出單個(gè)菌落并對(duì)其進(jìn)行確定。PCR儀器和特異性引物費(fèi)用較高，且無法對(duì)失去生物活性的菌株進(jìn)行識(shí)別。此外，PCR反應(yīng)的高靈敏度可能導(dǎo)致DNA被污染從而引起假陽性，失去活性的病菌DNA在體外擴(kuò)增也可能導(dǎo)致假陽性的結(jié)果[10]。

PCR技術(shù)還有許多變化，如實(shí)時(shí)定量PCR、多重PCR等，可以定量檢測樣品中微生物數(shù)量，或同時(shí)一次性檢測多種病原微生物。

1.5 熒光檢測技術(shù)

腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）熒光檢測技術(shù)是一種基于生物發(fā)光反應(yīng)的快速檢測方法，被廣泛應(yīng)用于肉制品檢測領(lǐng)域。該技術(shù)利用熒光素酶催化ATP和熒光素之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過測定熒光的強(qiáng)度間接反映樣品中的ATP含量，從而推斷出食品中的微生物或有機(jī)殘留水平。ATP熒光檢測技術(shù)具有檢測靈敏度高、數(shù)據(jù)處理速度快、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。Liu Zhenning等[11]提出了一種基于S1核酸酶、6-羧基熒光素胺標(biāo)記的單鏈DNA和氧化石墨烯建立的新型傳感器，用于檢測ATP和評(píng)估牛肉樣品的新鮮度。結(jié)果表明，在最佳條件下，熒光與20～3 500 μmol/L的ATP濃度之間存在線性相關(guān)性，檢測限為3.2 μmol/L，表明該改良熒光技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性高于紫外-可見光譜分析。ATP熒光檢測技術(shù)的缺點(diǎn)也很明顯，它無法區(qū)分不同類型的微生物（如病原菌與非病原菌），其檢測結(jié)果只能反映總ATP含量，而不能具體指示污染來源。環(huán)境中殘留的非微生物ATP或其他含ATP的物質(zhì)可能干擾檢測結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

經(jīng)典檢測技術(shù)的優(yōu)勢和不足如表1所示。

2 肉品微生物檢測新技術(shù)

2.1 基于分子生物學(xué)的檢測方法

2.1.1 HTS技術(shù)

HTS技術(shù)也被稱為下一代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要工具。這項(xiàng)技術(shù)能夠同時(shí)測定數(shù)十萬至數(shù)百萬條DNA分子序列，極大擴(kuò)展了基因組學(xué)的應(yīng)用范圍，是目前應(yīng)用最廣泛的測序方法[12]。

NGS技術(shù)顯著提高了測序速度和效率，能同時(shí)處理多個(gè)樣本，生成大量基因組數(shù)據(jù)。在肉品微生物檢測中，NGS主要有2 種應(yīng)用方式：一是通過對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)單個(gè)微生物進(jìn)行全基因組測序。例如，Wang Qin等[13]利用該技術(shù)完成了中國零售肉類中大腸桿菌的測序，報(bào)道了mcr-10在零售肉類中的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的傳播，揭示了肉品中的大腸桿菌可能通過食物鏈傳播抗性基因，該研究表明，NGS技術(shù)在揭示微生物耐藥性、毒力因子及遺傳變異信息方面顯示出巨大潛力。二是無需對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)即可快速識(shí)別肉品中微生物種類的宏組學(xué)技術(shù)。例如，de Matos等[14]利用NGS技術(shù)分析牛肉中細(xì)菌多樣性，確定了關(guān)鍵細(xì)菌種類的相對(duì)豐度，與傳統(tǒng)方法相比，NGS提供了更具體和精確的微生物群落信息。Park等[15]則利用NGS技術(shù)全面分析雞肉供應(yīng)鏈各環(huán)節(jié)的微生物群落，識(shí)別微生物的來源和擴(kuò)散路徑，從而提高食品安全管理效率。然而，該技術(shù)實(shí)驗(yàn)及分析周期長，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求高，且需要高效的計(jì)算和分析方法處理龐大的數(shù)據(jù)量，否則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，不同實(shí)驗(yàn)室的測序平臺(tái)、樣本處理、數(shù)據(jù)分析方法的差異也可能影響結(jié)果的可比性。短讀長測序平臺(tái)還可能產(chǎn)生一定比例的測序錯(cuò)誤，并且樣本間的交叉污染也可能進(jìn)一步影響數(shù)據(jù)的可靠性[16]。

2.1.2 dPCR技術(shù)

dPCR是一種用于核酸分子絕對(duì)定量的技術(shù)，該技術(shù)將核酸樣品分配到數(shù)萬個(gè)獨(dú)立微反應(yīng)單元中，每個(gè)單元盡可能只含1 個(gè)目標(biāo)模板分子，然后進(jìn)行獨(dú)立PCR擴(kuò)增。通過讀取熒光信號(hào)判斷結(jié)果，陽性為“1”，陰性為“0”，最后統(tǒng)計(jì)陽性個(gè)數(shù)和比例。由于反應(yīng)孔中可能含有零個(gè)或多個(gè)模板分子，dPCR通過泊松統(tǒng)計(jì)法校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，計(jì)算拷貝數(shù)和濃度[17]，其反應(yīng)原理如圖1所示。

與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time PCR）相比，dPCR無需借助內(nèi)參基因、標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)曲線即可直接實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量分析；泊松分布的應(yīng)用使得dPCR能夠檢測到樣本中的微小差異，特別適用于復(fù)雜背景序列中低豐度目的序列的定量檢測。dPCR對(duì)樣本進(jìn)行極限稀釋，檢測靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子，減少了靶標(biāo)分子對(duì)擴(kuò)增試劑的競爭。因此，dPCR在低濃度病原體的檢測中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，即使在復(fù)雜樣品基質(zhì)中也能保持高靈敏度和抗抑制劑能力[18]。

我國目前對(duì)食源性致病菌的檢測主要依賴于耗時(shí)較長的傳統(tǒng)培養(yǎng)法和real-time PCR技術(shù)等，但在食品基質(zhì)復(fù)雜、目標(biāo)分子含量低的情況下，這些方法的檢測結(jié)果可能存在偏差。dPCR無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行絕對(duì)定量分析，縮短了檢測時(shí)間，在食源性致病菌的檢測中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。?z等[19]開發(fā)了一種基于微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）的檢測方法，用于快速檢測生碎肉樣品中的沙門氏菌屬。該方法通過短時(shí)預(yù)增菌步驟，結(jié)合特異性的引物和探針設(shè)計(jì)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙門氏菌屬的準(zhǔn)確檢測，檢測限達(dá)到1.39 CFU/mL。Kong Jiaqi等[20]將NGS與ddPCR相結(jié)合，用于準(zhǔn)確檢測肉品中的大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌血清型，在雞肉表面的檢測限為3～4（lg（CFU/g）），在雞肉等食品中可檢測到低至2～3（lg（CFU/mL））的病原菌。此外，Suo Yuanjie 等[21]開發(fā)了一種基于適配體的dPCR芯片用于鼠傷寒沙門氏菌檢測，能夠在復(fù)雜食品基質(zhì)中直接定量細(xì)菌，檢測限低至90 CFU/反應(yīng)，整個(gè)過程僅需約2 h。目前，ddPCR方法已在一系列進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中被應(yīng)用于食品致病菌和病毒檢測，作為快速檢測放行的依據(jù)。

然而，dPCR仍存在一些局限性，如試劑和設(shè)備價(jià)格昂貴，使用成本較高；液滴的穩(wěn)定性與可控性相對(duì)較差，難以避免液滴的少量融合[22]；大部分儀器對(duì)結(jié)果采用終點(diǎn)檢測法，無法監(jiān)控?cái)U(kuò)增過程中的實(shí)時(shí)熒光數(shù)據(jù)，影響了數(shù)據(jù)的可信度。隨著技術(shù)的進(jìn)步和成本的降低，dPCR技術(shù)有望在肉品微生物檢測中得到更廣泛的應(yīng)用。

2.1.3 變性氣泡介導(dǎo)的鏈交換擴(kuò)增（strand exchange amplification，SEA）技術(shù)

SEA技術(shù)是一種基于DNA呼吸作用引起的變性泡介導(dǎo)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，于2016年被提出。SEA引入了鏈置換酶（strand displacement enzyme，SDE），該酶在低溫下具有高度特異性和高效率的鏈交換活性。在SEA反應(yīng)中，引物與待擴(kuò)增的目標(biāo)序列結(jié)合，SDE將引物與目標(biāo)序列進(jìn)行鏈交換，從而生成新的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過不斷循環(huán)此過程，實(shí)現(xiàn)恒溫下靶核酸區(qū)域的指數(shù)式擴(kuò)增，SEA反應(yīng)原理如圖2所示。

SEA技術(shù)為肉品微生物檢測提供了一種快速、靈敏且成本效益高的檢測方法[23]?；赟EA技術(shù)，研究人員開發(fā)了交錯(cuò)SEA（staggered SEA，SSEA）和加速SEA技術(shù)，進(jìn)一步提高了檢測速度和靈敏度。這些簡單、快速、低成本且高靈敏的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的即時(shí)分子診斷，尤其在大腸桿菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌等食源性病原菌的檢測中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢[24]。Zhang Meilin等[25]利用SEA技術(shù)有效檢測了低至1.0×10?13 mol/L的基因組DNA，無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，即可實(shí)現(xiàn)基因組DNA、培養(yǎng)液和菌落的實(shí)時(shí)熒光檢測，大大提高了檢測效率。金黃色葡萄球菌污染已成為世界性的食品安全問題，SEA特別適用于金黃色葡萄球菌的現(xiàn)場快速檢測和大規(guī)模篩查[26]。Zhang Jian等[27]開發(fā)的SSEA技術(shù)在1 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)了低至1.0×103 CFU/g的金黃色葡萄球菌檢測，展示了其在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用潛力。

SEA技術(shù)也存在一定的局限性，由于SDE的限制，SEA技術(shù)對(duì)擴(kuò)增長度有一定的限制，通常適用于較短的目標(biāo)序列，且對(duì)于新使用者來說，獲得最優(yōu)的引物較為困難，這些因素限制了其應(yīng)用范圍。隨著技術(shù)的改進(jìn)，SEA有望在食品安全檢測中發(fā)揮更重要的作用。

2.2 基于蛋白組的檢測方法（MALDI-TOF MS技術(shù)）

MALDI-TOF MS技術(shù)是一種用于微生物快速鑒定的技術(shù)，該技術(shù)通過檢測微生物細(xì)胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖譜來實(shí)現(xiàn)微生物的鑒定。這些蛋白質(zhì)（如管家蛋白和核糖體蛋白）被提取并離子化后，根據(jù)其質(zhì)量-電荷比在飛行管中飛行并被檢測器檢測，形成特征性的質(zhì)譜圖，隨后通過將這些質(zhì)譜圖與已知微生物的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，利用算法評(píng)估匹配，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的快速、準(zhǔn)確鑒定[28]，其反應(yīng)原理如圖3所示。

MALDI-TOF MS通過分析微生物的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行鑒定，由于這些蛋白質(zhì)在物種內(nèi)部通常具有高度的保守性和獨(dú)特性，MALDI-TOF MS能夠提供具有高度確定性的鑒定結(jié)果[29]。此外，MALDI-TOF MS技術(shù)所需樣品和制備步驟少，數(shù)據(jù)處理時(shí)間短，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測，因此常被用于微生物的快速鑒定。該技術(shù)已被成熟應(yīng)用于單一細(xì)菌的快速鑒定，準(zhǔn)確率高且檢測時(shí)間短，在1 h內(nèi)的物種鑒定正確率為84%～94%，被證明是一種非常快速、經(jīng)濟(jì)且可靠的細(xì)菌鑒定工具[30]。Sapugahawatte等[31]利用MALDI-TOF MS從香港濕貨市場的魚類和豬肉中鑒定出多重耐藥病原體。Wang Chen等[32]利用該技術(shù)以98.5%的準(zhǔn)確率鑒定了從日本和埃及采集的食品樣本中的腸球菌。GB/T 33682—2017《基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》也給出了MALDI-TOF MS應(yīng)用于微生物鑒定檢測中的應(yīng)用原則和要求，有利于未來該方法在微生物鑒定領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。

MALDI-TOF MS技術(shù)在應(yīng)用中也有一定的局限性，首先是數(shù)據(jù)庫中參考譜圖的完整性和準(zhǔn)確性直接影響物種的識(shí)別效果，因此還需不斷更新圖譜庫以增加鑒定的準(zhǔn)確性；此外，MALDI-TOF MS譜圖的重現(xiàn)性受樣品培養(yǎng)、制備和保存及所使用的基質(zhì)類型影響；當(dāng)物種具有近似相同的譜圖時(shí)（如大腸桿菌和志賀氏桿菌[33]），仍需通過表型方法和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步區(qū)分。隨著數(shù)據(jù)庫的完善和樣本處理技術(shù)的進(jìn)步，MALDI-TOF MS有望逐步取代傳統(tǒng)的生化鑒定方法。

2.3 基于光譜技術(shù)的檢測方法

2.3.1 紅外光譜技術(shù)

紅外光譜通過測量物質(zhì)對(duì)特定頻率紅外光的吸收或發(fā)射情況獲取物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成信息。

紅外覆蓋頻率范圍為12 500～33 cm?1，可分為近中紅外（12 500～400 cm?1）和遠(yuǎn)紅外（400～33 cm?1）[34]。近紅外和中紅外光譜在化學(xué)分析和微生物檢測中被廣泛應(yīng)用，因?yàn)槲⑸锏募?xì)胞膜和細(xì)胞壁含有獨(dú)特的化學(xué)成分，如核酸、蛋白質(zhì)等，它們?cè)诩t外光譜中有特定的吸收特征[35]。盡管微生物的紅外光譜可能表現(xiàn)出相似性，借助光譜預(yù)處理技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法（如偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）、基于支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）回歸和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等），仍然可以實(shí)現(xiàn)微生物的準(zhǔn)確定量分析和區(qū)分。此外，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析等方法可以對(duì)微生物進(jìn)行有效的識(shí)別和分類。通常通過計(jì)算相關(guān)系數(shù)和均方根誤差確保模型的準(zhǔn)確性和可靠性，以評(píng)估預(yù)測模型的性能[36]。

由于紅外光譜操作簡便、分析速度快且應(yīng)用范圍廣泛，已成為成熟的微生物檢測手段。目前，已建立多種微生物的紅外光譜數(shù)據(jù)庫，并且商業(yè)化的紅外光譜微生物檢測設(shè)備也已問世。然而，大多數(shù)研究仍依賴于昂貴且笨重的臺(tái)式儀器，限制了其在現(xiàn)場微生物檢測中的靈活性和適應(yīng)性。同時(shí)，近紅外光譜設(shè)備在應(yīng)用于先前未分析過的樣本時(shí)，通常缺乏穩(wěn)健性和準(zhǔn)確性。因此，建立更全面的樣本數(shù)據(jù)庫和使用先進(jìn)的算法對(duì)于實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性和高準(zhǔn)確性至關(guān)重要。在Zhang Zhepeng[37]、Zhang Fan[38]等的研究中，通過改進(jìn)即時(shí)報(bào)學(xué)習(xí)模型，提出了一種穩(wěn)健的近紅外光譜方法，用于檢測豬肉中的總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量。該方法結(jié)合了自研的雙波段傳感器（可見光/短波近紅外光譜儀和長波近紅外光譜儀），用來采集豬肉的光譜反射率，通過即時(shí)報(bào)學(xué)習(xí)策略和最小二乘SVM預(yù)測模型，顯著提高了對(duì)未知樣本的預(yù)測精度，特別是在新批次樣本的預(yù)測中，模型預(yù)測決定系數(shù)達(dá)到0.92。這項(xiàng)研究證實(shí)近紅外光譜技術(shù)在快速、無損檢測肉類變質(zhì)方面的應(yīng)用潛力，特別是在那些對(duì)檢測精度和模型實(shí)時(shí)更新有高要求的場景中。通過擴(kuò)展樣本庫和優(yōu)化算法，可以進(jìn)一步提高模型的魯棒性和預(yù)測的準(zhǔn)確性，這表明結(jié)合現(xiàn)代算法和便攜式設(shè)備的紅外光譜技術(shù)在未來微生物檢測和精準(zhǔn)防控中具有巨大潛力。

2.3.2 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)在肉品微生物檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，該技術(shù)通過檢測肉品樣本的拉曼散射光，能夠獲得肉品中微生物的分子結(jié)構(gòu)和組成信息，從而檢測肉品中微生物的種類、數(shù)量和活性。這為快速評(píng)估肉品的質(zhì)量和安全提供了依據(jù)[39]，其檢測流程如圖4所示。

與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法相比，拉曼光譜檢測技術(shù)速度快，特異性高，且無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜處理，具有顯著優(yōu)勢[40]。拉曼光譜技術(shù)因其對(duì)肉品貯藏期間化學(xué)變化的高靈敏度監(jiān)測，成為評(píng)估肉品新鮮度的關(guān)鍵工具。這些化學(xué)變化包括蛋白質(zhì)分解和脂質(zhì)氧化，通常由微生物活動(dòng)引起，與肉品腐敗過程密切相關(guān)。結(jié)合拉曼光譜數(shù)據(jù)和多元統(tǒng)計(jì)分析方法（PLSR和PCA），可以預(yù)測肉品中的TVB-N含量，進(jìn)而評(píng)估肉品腐敗程度。通過正交信號(hào)校正和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（convolutional neural network，CNN）等機(jī)器學(xué)習(xí)算法，拉曼光譜技術(shù)不僅提升了微生物種類識(shí)別的準(zhǔn)確性，還能有效區(qū)分不同腐敗階段的微生物[41]。例如，便攜式拉曼光譜儀結(jié)合CNN在鱸魚魚片新鮮度檢測中展現(xiàn)了快速、無損的檢測潛力，提供了食品安全和質(zhì)量評(píng)估的高效工具。特征選擇與方差分析的結(jié)合，顯著提升了CNN模型的分類準(zhǔn)確性和計(jì)算效率，為肉類產(chǎn)品的微生物安全評(píng)估提供了新途徑[42]。

此外，Liu Shijie等[43]開發(fā)了一種基于Ag@AuNP陣列的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)5 種常見細(xì)菌孢子的快速、準(zhǔn)確鑒定，為肉制品中的孢子監(jiān)測提供了前景廣闊的技術(shù)策略。

高昂的設(shè)備成本限制了拉曼光譜在肉類產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用[44]。此外，數(shù)據(jù)量大、分析難度高、靈敏度低等問題使其推廣應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)。未來的研究應(yīng)致力于開發(fā)更輕便、小型化的拉曼光譜設(shè)備，并探索成本效益更高的解決方案，以實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)監(jiān)測和與現(xiàn)有設(shè)備的集成。

2.3.3 高光譜技術(shù)

高光譜成像（hyperspectral imaging，HSI）技術(shù)（圖5）是一種集成成像與光譜分析的先進(jìn)手段，能夠捕獲每個(gè)像素點(diǎn)在不同波長下的光譜信息，生成包含空間和波長維度的三維數(shù)據(jù)集，即超立方體。與傳統(tǒng)的成像或光譜技術(shù)相比，HSI的獨(dú)特之處在于其能夠同時(shí)測量圖像中每個(gè)像素的空間信息和光譜參數(shù)，捕捉從可見光到近紅外或短波紅外光譜（0.4～2.5 μm）范圍內(nèi)的連續(xù)光譜信息[45]。

當(dāng)表面帶有微生物的食品或液體培養(yǎng)基暴露在HSI系統(tǒng)的光源下，光線與樣品相互作用，產(chǎn)生反射或透射光。由于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成（如蛋白質(zhì)、脂類、核酸等）的差異，它們?cè)谔囟úㄩL范圍內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出特定的光譜響應(yīng)。通過這些光譜特征，可以將不同類型的微生物區(qū)分開來。例如，不同種類的細(xì)菌或真菌在特定波長下的光譜差異可用于分類[46]。

作為一種非侵入性、非接觸性、非破壞性的技術(shù)，HSI的高光譜分辨率使其在快速、無損監(jiān)測微生物腐敗方面具有顯著優(yōu)勢。與耗時(shí)的傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，HSI的處理時(shí)間更短，更適合于實(shí)時(shí)質(zhì)量評(píng)估。此外，HSI能夠精確識(shí)別圖像中的關(guān)鍵分析區(qū)域，同時(shí)獲取空間和光譜信息，提供更準(zhǔn)確、全面的數(shù)據(jù)分析，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[47]。

HSI在預(yù)測總活菌數(shù)（total viable count，TVC）方面顯示出巨大潛力。Li Huanhuan等[48]通過結(jié)合豬肉樣本的高光譜數(shù)據(jù)和比色傳感器響應(yīng)，應(yīng)用多變量分析方法，建立高效SVM的TVC預(yù)測模型，其模型的預(yù)測均方根誤差為2.991 3，這顯示出HSI與比色傳感器相結(jié)合的多變量分析方法在無損檢測豬肉質(zhì)量與安全方面具有巨大潛力。此外，HSI也被用于其他微生物的快速無損檢測。Zhao Jiexi等[49]利用HSI結(jié)合AdaBoost-RT算法對(duì)冷藏雞肉中的假單胞菌進(jìn)行檢測，通過獲取329～1 113 nm波段的高光譜數(shù)據(jù)，建立了新鮮雞胸肉中定性檢測金黃色葡萄球菌的方法。該研究將HSI與PCA、多種特征選擇技術(shù)（如競爭自適應(yīng)重加權(quán)采樣、遺傳算法和連續(xù)投影算法）、SVM算法相結(jié)合，開發(fā)出分類模型。HSI在食品質(zhì)量和安全評(píng)估，尤其是評(píng)估肉類新鮮度和微生物風(fēng)險(xiǎn)方面具有較好的應(yīng)用潛力[50]。

盡管HSI技術(shù)具有明顯優(yōu)勢，但也存在一些局限性。HSI系統(tǒng)的購置成本較高，且由于產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，需要高速計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和大容量存儲(chǔ)設(shè)備。圖像采集過程中，信號(hào)可能受到環(huán)境因素如散射和照明的影響，可能導(dǎo)致信噪比降低。此外，通常難以使用光譜數(shù)據(jù)在等效圖像中檢測和識(shí)別到不同的物體。盡管存在這些挑戰(zhàn)，HSI技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用前景依然廣闊，值得進(jìn)一步的研究與開發(fā)。

3 結(jié) 語

在食品檢測過程中，經(jīng)典檢測方法仍然是應(yīng)用最廣泛的方法，某些檢測新技術(shù)則成為輔助手段。這些技術(shù)如NGS、dPCR、SEA、MALDI-TOF MS和紅外光譜、拉曼光譜、HSI等，不僅在檢測速度、靈敏度和特異性方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，還大大提高了檢測效率和準(zhǔn)確性。其中，NGS能夠同時(shí)分析多個(gè)樣本的基因組信息，識(shí)別未知微生物種類，為揭示微生物的耐藥性和毒力因子提供了新的視角。dPCR技術(shù)憑借其高靈敏度和絕對(duì)定量的優(yōu)勢，成為低豐度病原體檢測的理想選擇。SEA技術(shù)因其恒溫?cái)U(kuò)增的特性，非常適合現(xiàn)場快速檢測。MALDI-TOF MS則通過質(zhì)譜分析微生物的蛋白質(zhì)譜圖，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的快速鑒定。紅外光譜技術(shù)則實(shí)現(xiàn)了微生物的定量分析和區(qū)分，能夠在短時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的分析結(jié)果。而拉曼光譜、HSI技術(shù)以其非破壞、非入侵性和快速檢測的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了樣品的無損檢測。

盡管這些新技術(shù)在肉品微生物檢測中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，但其在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。如NGS和dPCR技術(shù)的應(yīng)用成本較高，數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，設(shè)備成本高；MALDI-TOF MS受限于數(shù)據(jù)庫的完整性，難以鑒別相似物種；而拉曼光譜技術(shù)則由于設(shè)備昂貴和數(shù)據(jù)分析難度大，在肉類產(chǎn)業(yè)中的推廣應(yīng)用受到限制。此外，HSI和紅外光譜雖然以其無損、快速檢測的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量評(píng)估，但它們的購置成本較高，數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，且容易受到環(huán)境因素的影響，從而限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。未來的研究應(yīng)著眼于降低技術(shù)成本，提高其在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中的應(yīng)用可行性，特別是開發(fā)小型化、集成化的設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線監(jiān)測，從而更有效地保障食品安全。

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收稿日期：2024-09-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（32470009）；國家科技重大專項(xiàng)（2024ZD1000603）

第一作者簡介：熊穎涵（2000—）（ORCID： 0009-0006-1170-0661），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ獭?/p>

E-mail： 2366797273@qq.com

*通信作者簡介：孫群（1967—）（ORCID： 0000-0002-4372-8865），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c微生物技術(shù)。

E-mail： qunsun@scu.edu.cn