摘要：為提高腐乳發(fā)酵劑的發(fā)酵效率，該研究在豆腐坯上接入單一菌種、混合菌種發(fā)酵劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化腐乳前酵工藝并研究腐乳發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)變化。結(jié)果表明，混合菌種發(fā)酵效果顯著優(yōu)于單一菌種發(fā)酵，而混合發(fā)酵劑A（少孢根霉、毛霉40899、保加利亞乳桿菌）的發(fā)酵效果優(yōu)于混合發(fā)酵劑B（少孢根霉、毛霉40899、酵母菌、保加利亞乳桿菌），混菌發(fā)酵腐乳最佳前酵工藝條件為接種濃度10⁶ CFU/mL、接種量3%、少孢根霉∶毛霉40899∶保加利亞乳桿菌為1∶1∶1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間3 d，此時(shí)腐乳蛋白酶活力最高，為231.2 U/g，感官評(píng)分為83分。在后酵完成時(shí)，混合發(fā)酵劑A的硬度最小，彈性最大，內(nèi)聚性和膠黏性最小。混合菌種發(fā)酵腐乳經(jīng)工藝優(yōu)化后，毛坯菌絲粗壯有光澤，生長(zhǎng)旺盛，蛋白酶活力高于單一菌種發(fā)酵腐乳。該研究為開發(fā)復(fù)合發(fā)酵劑、提高腐乳產(chǎn)品質(zhì)量提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：混合菌種；腐乳前酵；蛋白酶活力；質(zhì)構(gòu)

中圖分類號(hào)：TS214.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）01-0061-07

Optimization of Pre-Fermentation Process of Sufu Fermented by Mixed Bacteria and Its Texture Analysis

LIU Bei-ning， ZHANG Chen-rui， TIAN Juan， LIU Qin-ming， PI Yu-ran， HU Yong-jin^*

（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract： In order to improve the fermentation efficiency of sufu fermentation agents， in this study， the single bacterium and mixed bacteria fermentation agents are added onto tofu blank， and orthogonal test is designed based on single factor test to optimize the pre-fermentation process of sufu and study the texture change of sufu during fermentation. The results show that the mixed bacteria fermentation effect is significantly better than the single bacterium fermentation， and the fermentation effect of the mixed fermentation agent A （Rhizopus oligosporus， Mucor 40899， Lactobacillus bulgaricus） is better than the mixed fermentation agent B （Rhizopus oligosporus， Mucor 40899， Saccharomyces cerevisiae， Lactobacillus bulgaricus）. The optimal pre-fermentation process conditions of mixed bacteria fermentation of sufu are as follows： inoculation concentration is 10⁶ CFU/mL， inoculation amount is 3%， Rhizopus oligosporus∶Mucor 40899∶Lactobacillus bulgaricus is 1∶1∶1， fermentation temperature is 30℃ and fermentation time is 3 d. At this time， the protease activity of sufu is the highest of 231.2 U/g， and the sensory score is 83 points. When the post-fermentation is completed， the mixed fermentation agent A has the smallest hardness， the greatest elasticity， and the smallest cohesion and adhesion. After process optimization of sufu fermented by mixed bacteria， the mycelia of the blank is thick， shiny and vigorous， and the protease activity is higher than that of sufu fermented by single bacterium. This study has provided a certain theoretical basis for the development of composite fermentation agent and the improvement of sufu product quality.

Key words： mixed bacteria; pre-fermentation of sufu; protease activity; texture

收稿日期：2024-08-29

基金項(xiàng)目：科技人才與平臺(tái)計(jì)劃（202105AF150049）；云南省高校食品微生物資源與利用重點(diǎn)試驗(yàn)室（云教發(fā)[2018]135號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：劉貝寧（2001—），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。

*通信作者：胡永金（1971—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學(xué)。

腐乳是我國(guó)特有的大豆發(fā)酵食品^[1]，又稱乳腐、毛豆腐、臭豆腐或霉豆腐^[2]，以其風(fēng)味醇厚濃香、滋味鮮美、口感細(xì)膩的特點(diǎn)^[3]而深受消費(fèi)者喜愛。豆腐經(jīng)發(fā)酵后，其中的蛋白質(zhì)和淀粉被微生物酶分解成氨基酸、肽和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，賦予了腐乳獨(dú)特的風(fēng)味。按照傳統(tǒng)加工工藝在露天環(huán)境中生產(chǎn)的腐乳易被有害微生物污染，難以控制質(zhì)量^[4]。腐乳的理化性質(zhì)、質(zhì)地和感官特性均會(huì)受到微生物的影響^[5]。根據(jù)其發(fā)酵所用的微生物，可將其分為毛霉型腐乳和根霉型腐乳^[6]。毛霉是腐乳發(fā)酵中最常用且用量最大、占比最高的發(fā)酵菌，在生產(chǎn)過程中能釋放出活力高的蛋白酶及其他有益酶系。毛霉型腐乳前酵期主要是以毛霉為主，多種微生物協(xié)同參與發(fā)酵的過程。在該過程中，微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下迅速生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)生大量種類繁多的酶，在蛋白酶的作用下大豆蛋白降解成多肽、游離氨基酸等，在增強(qiáng)腐乳營(yíng)養(yǎng)、充實(shí)口感的同時(shí)賦予其獨(dú)特純正的風(fēng)味^[7]，為后酵做好充足的準(zhǔn)備。根霉耐高溫，在接近40℃的環(huán)境下仍能生長(zhǎng)，常用于在夏季生產(chǎn)腐乳^[8]。而酵母菌和保加利亞乳桿菌協(xié)同發(fā)酵主要用于增香提味。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)腐乳營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和單菌種改良生產(chǎn)工藝等的研究較多，但對(duì)于雙菌種或者多菌種混合發(fā)酵腐乳的研究較少。因此，本研究在雙菌種發(fā)酵腐乳的基礎(chǔ)上，加入對(duì)風(fēng)味具有突出貢獻(xiàn)的酵母菌和保加利亞乳桿菌協(xié)同發(fā)酵，并監(jiān)測(cè)腐乳發(fā)酵過程中的質(zhì)構(gòu)變化，分析比較不同混合發(fā)酵劑在腐乳前酵中主要蛋白酶活力的變化情況，為優(yōu)化腐乳前酵工藝、提升腐乳品質(zhì)、改善腐乳風(fēng)味提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

毛霉40899：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；少孢根霉、酵母菌、保加利亞乳桿菌：云南省高校食品微生物資源與利用重點(diǎn)試驗(yàn)室保存菌種。

大豆油、白酒、食鹽、花椒面、辣椒面、十三香：購(gòu)于昆明市喜馬特超市。

1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；福林酚、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酪氨酸（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

BCM-1000A超凈工作臺(tái) 蘇州安泰技術(shù)有限公司；Eppendorf Research Plus單道可調(diào)量程移液槍（100～1 000μL/20～200μL） 南京貝登醫(yī)療股份有限公司；9053A烘箱 上海實(shí)研電爐有限公司；HHPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LX-B高壓蒸汽滅菌鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；725N分光光度計(jì) 南京曉曉儀器設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐乳生產(chǎn)工藝流程

選豆→浸泡→磨漿→濾漿→煮漿→點(diǎn)漿→蹲腦→壓榨→劃坯→擺籠→接種→培菌→倒籠→涼花→搓毛→腌坯→裝壇→加入輔料→后酵產(chǎn)品。

1.4.2 菌種活化

將毛霉40899、少孢根霉、酵母菌接入PDA培養(yǎng)基中，毛霉40899、酵母菌于28℃搖床培養(yǎng) 2 d，取活化液于PDA培養(yǎng)基中活化3次；少孢根霉于32℃搖床培養(yǎng)2 d，取活化液于PDA培養(yǎng)基中活化3次，備用；在MRS培養(yǎng)基中活化保加利亞乳桿菌。

1.4.3 混合發(fā)酵劑的制備

取0.1 mL活化后的菌液于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上涂布、培養(yǎng)，用接種環(huán)刮取新長(zhǎng)出的菌種于無菌生理鹽水中，配制成一定濃度的混合發(fā)酵劑，將少孢根霉、毛霉40899、保加利亞乳桿菌混合菌命名為混合發(fā)酵劑A、將少孢根霉、毛霉40899、酵母菌、保加利亞乳桿菌混合菌命名為混合發(fā)酵劑B。

1.4.4 腐乳前酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

按照腐乳前酵的生產(chǎn)工藝流程，將菌液均勻接種于豆腐坯每個(gè)面后恒溫培養(yǎng)，分別考察混合菌種比例（混合發(fā)酵劑A：少孢根霉∶毛霉40899∶保加利亞乳桿菌分別為5∶3∶1、2∶2∶1、1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶5；混合發(fā)酵劑B：少孢根霉∶毛霉40899∶酵母菌∶保加利亞乳桿菌分別為5∶3∶2∶1、4∶2∶2∶1、1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶4、1∶2∶3∶5）、毛霉40899、少孢根霉、混合發(fā)酵劑A、B的接種濃度（10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸ CFU/mL）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%，豆腐質(zhì)量）、發(fā)酵溫度（24，26，28，30，32，34，36℃）、發(fā)酵時(shí)間（1，2，3，4，5 d）對(duì)蛋白酶活力的影響。

1.4.5 蛋白酶活力的測(cè)定

毛坯蛋白酶活力參照GB/T 23527—2009進(jìn)行測(cè)定。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.018 6x－0.036 2，R²=0.999。

1.4.6 毛坯感官評(píng)價(jià)

毛坯的感官評(píng)價(jià)是考核腐乳前酵過程中菌絲生長(zhǎng)程度能否形成菌絲衣包裹住腐乳、保證腐乳后酵過程中坯體完整的重要指標(biāo)，為使前酵工藝達(dá)到最佳效果，特在優(yōu)化試驗(yàn)中加入毛坯進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1^[9]。

1.4.7 混合發(fā)酵劑前酵工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，混合發(fā)酵劑前酵工藝以菌種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為變量，以蛋白酶活力和感官評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L₉（3³）正交試驗(yàn)，優(yōu)化混合菌種前酵工藝，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

1.4.8 腐乳感官評(píng)價(jià)

腐乳的感官評(píng)價(jià)參照楊智慧等^[10]、沈子林等^[11]的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)并稍作改動(dòng)。邀請(qǐng)10名本專業(yè)具有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

1.4.9 單一菌種、混合菌種發(fā)酵腐乳的質(zhì)構(gòu)測(cè)定

對(duì)前酵樣品及制備的腐乳定時(shí)取樣測(cè)定質(zhì)構(gòu)。分別于12 h（Q1）、24 h（Q2）、36 h（Q3）、48 h（Q4）、60 h（Q5）、72 h（Q6）、15 d（H1）、30 d（H2）、45 d（H3）、60 d（H4）、75 d（H5）、90 d（H6）對(duì)混合發(fā)酵劑A、B發(fā)酵的腐乳進(jìn)行隨機(jī)取樣。Q代表發(fā)酵前，H代表發(fā)酵后。

采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段2 cm×2 cm×2 cm的坯體（混合發(fā)酵劑A發(fā)酵、混合發(fā)酵劑B發(fā)酵）進(jìn)行質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定^[12]，測(cè)試條件和參數(shù)：TPA二次下壓；探頭型號(hào)P/36R；測(cè)前速度5.00 mm/s；測(cè)中速度1.00 mm/s；測(cè)后速度5.00 mm/s；下壓距離3 cm；觸發(fā)力5 g；采集速率200 pps，每個(gè)樣品測(cè)定3次，主要參數(shù)及定義見表4。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Excel 2018、Origin 9.0進(jìn)行制表、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種、混合菌種發(fā)酵腐乳前酵工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 混合菌種比例對(duì)腐乳前酵的影響

由圖1可知，混合發(fā)酵劑A發(fā)酵腐乳前酵過程中蛋白酶活力隨著保加利亞乳桿菌比例的上升而上升，原因是乳酸菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生各類有機(jī)酸和其他化合物，使坯體呈現(xiàn)微酸性環(huán)境，有利于根霉、毛霉的生長(zhǎng)，催化大豆蛋白降解，從而體現(xiàn)出較高的酶活^[13]。當(dāng)少孢根霉∶毛霉40899∶保加利亞乳桿菌為1∶1∶1時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最高值，但保加利亞乳桿菌的比例持續(xù)上升，其繁殖代謝產(chǎn)生的大量乳酸不僅不會(huì)協(xié)同毛霉、根霉發(fā)酵，而且會(huì)抑制這兩種菌，導(dǎo)致蛋白酶活力呈下降趨勢(shì)。

由圖2可知，混合發(fā)酵劑B蛋白酶活力隨著少孢根霉比例的下降而上升，當(dāng)少孢根霉∶毛霉40899∶酵母菌∶保加利亞乳桿菌為4∶2∶2∶1時(shí)蛋白酶活力最高，可能是該菌種比例有利于菌種間協(xié)同共生^[14]。說明根霉和毛霉是腐乳前酵產(chǎn)蛋白酶的主要菌群，乳酸菌和酵母菌協(xié)同完成前酵，當(dāng)后兩者比例不斷上升逐漸占據(jù)主導(dǎo)發(fā)酵地位時(shí)，其代謝產(chǎn)生的酸類、醇類對(duì)根霉、毛霉的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生多重抑制，而毛霉、根霉的代謝產(chǎn)物也對(duì)乳酸菌和酵母菌產(chǎn)生抑制，在雙向抑制的作用下，微生物不能正常生長(zhǎng)，影響了代謝物的分泌，蛋白酶活力迅速降低。

2.1.2 單一菌種、混合菌種發(fā)酵腐乳不同工藝對(duì)前酵的影響

由圖3可知，接種濃度低時(shí)微生物數(shù)量偏低，毛坯單位面積上的酶數(shù)量較少，故蛋白酶活力偏低。蛋白酶活力隨著接種濃度的上升而逐漸升高，混合發(fā)酵劑A在10⁶ CFU/mL時(shí)達(dá)到最高值，為230.9 U/g。當(dāng)達(dá)到較高酶解率時(shí)，盡管接種濃度有所增加，但能夠在豆腐坯上正常生長(zhǎng)繁殖的微生物數(shù)量基本達(dá)到飽和，單位時(shí)間內(nèi)蛋白酶活力不再有明顯提高。

由圖4可知，當(dāng)接種量為3%時(shí)，微生物能較好地利用底物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，混合發(fā)酵劑B蛋白酶活力達(dá)到最大值，混合發(fā)酵劑A、毛霉40899、少孢根霉蛋白酶活力在接種量為4%時(shí)達(dá)到最大值。接種量過大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致微生物數(shù)量超出其最佳生長(zhǎng)階段的適宜范圍，而營(yíng)養(yǎng)組分有限，只能滿足菌體自身生長(zhǎng)發(fā)育，不利于蛋白酶等代謝物的分泌^[15]，可能導(dǎo)致原料中的各類成分被過度分解利用，使得蛋白酶活力不升反降^[16]，尤其是菌種較多的混合發(fā)酵劑B，不同菌種之間的競(jìng)爭(zhēng)能力不同，多種菌種共同爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，蛋白酶活力下降幅度明顯^[17-18]。

由圖5可知，在24～36℃，混合發(fā)酵劑A的蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，少孢根霉和保加利亞乳桿菌屬于嗜溫菌^[19]，30℃時(shí)混合發(fā)酵劑A的蛋白酶活力達(dá)最高值；混合發(fā)酵劑B的蛋白酶活力也先上升后下降，28℃時(shí)達(dá)到最高值。這可能是因?yàn)榫N的生長(zhǎng)對(duì)溫度的要求較高，特別是混合菌種，在適宜溫度范圍內(nèi)才能快速生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生大量的蛋白酶。過低和過高的溫度也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而降低微生物分泌的產(chǎn)酶量^[20]。超過最適溫度，細(xì)胞功能急劇下降甚至死亡，部分酶失活，溫度越高，死亡和變性失活越明顯，導(dǎo)致發(fā)酵難以進(jìn)行。

由圖6可知，毛霉40899和少孢根霉生長(zhǎng)繁殖迅速，可快速利用豆腐坯的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化，發(fā)酵3 d時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最高值，但隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)增加，微生物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少^[21]，菌體過度生長(zhǎng)繁殖，易老化衰退，代謝廢物增多，導(dǎo)致蛋白酶活力下降。

綜上，單一菌種發(fā)酵腐乳前酵工藝中，少孢根霉生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)酶能力強(qiáng)、適應(yīng)溫度域廣，因此，選擇少孢根霉進(jìn)行腐乳后發(fā)酵研究。但由于在最適溫度下，菌株生長(zhǎng)代謝快，孢子量大，菌絲致密^[22]，易老化變黃，搓毛后，坯體呈黑褐色，影響腐乳整體感官。因此，本研究選擇與最適生長(zhǎng)溫度下蛋白酶活力差異不大的32℃進(jìn)行少孢根霉的后發(fā)酵研究。

在混合菌種發(fā)酵腐乳前酵工藝中，其最高蛋白酶活力均高于單一菌種前酵腐乳，原因是多菌種復(fù)配后，代謝合成的化合物使微生物生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生了變化，菌群之間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，有利于菌種繁殖產(chǎn)酶^[23]，混合發(fā)酵劑A在不同工藝條件下均比混合發(fā)酵劑B表現(xiàn)出更高的蛋白酶活力。后酵風(fēng)味的形成是通過前酵累積的酶系不斷催化分解，生成一系列呈香呈味物質(zhì)，獲得最佳發(fā)酵效果的過程，因此，選擇蛋白酶活力最高的混合發(fā)酵劑A進(jìn)行后發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 混合發(fā)酵劑前酵工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，控制混合發(fā)酵劑A接種濃度為10⁶ CFU/mL、接種量為3%，對(duì)其進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

由表 5可知，各因素對(duì)蛋白酶活力影響的主次順序?yàn)榫N比例＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間，而發(fā)酵時(shí)間為影響感官評(píng)分的主要因素。綜合顯著性影響得出，混合發(fā)酵劑A最佳前酵工藝為A₂B₂C₂，由于不在正交試驗(yàn)表內(nèi)，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由表 6可知，混合發(fā)酵劑A發(fā)酵腐乳前酵工藝中，菌種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響顯著。

由表7可知，混合發(fā)酵劑A發(fā)酵腐乳前酵工藝經(jīng)優(yōu)化后蛋白酶活力高，感官評(píng)分較好，菌絲有光澤、長(zhǎng)勢(shì)良好，坯體完整不缺角，具有淡淡的發(fā)酵香氣，可用于后酵試驗(yàn)。

2.3 腐乳發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)的變化

2.3.1 腐乳發(fā)酵過程中硬度、膠黏性和咀嚼性的變化

少孢根霉、毛霉40899在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生大量菌絲，包裹住坯體，使其具有一定的抗形變能力，此外，微生物代謝繁殖釋放少量熱能^[24]，加速了水分揮發(fā)，導(dǎo)致前酵階段腐乳的硬度不斷增加。食鹽的加入導(dǎo)致坯體中的水分析出，硬度大幅上升^[25]。H1～H6階段，腐乳中的蛋白質(zhì)、多肽、脂肪等經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化分解，生成小分子物質(zhì)及呈香呈味物質(zhì)，坯體變軟，內(nèi)部質(zhì)地更加細(xì)膩，硬度更小。發(fā)酵完成時(shí)混合發(fā)酵劑A、B的硬度最低，為500 g，說明混合菌種之間的協(xié)同作用更有利于物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，能夠改善腐乳的硬度，使腐乳的質(zhì)地更加潤(rùn)滑，口感更加細(xì)膩。

膠黏性表示硬度和內(nèi)聚性的乘積^[26]，反映破碎食物時(shí)所需要的能量，其與樣品分子內(nèi)部的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或交聯(lián)有關(guān)^[27]。前酵過程中膠黏性隨著微生物的代謝分泌和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而不斷增大。后酵過程中蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不斷被破壞，進(jìn)一步分解成小分子的多肽和水溶性蛋白，硬度隨之降低，分子鍵型發(fā)生變化，膠黏性也降低，腐乳更容易破碎。后酵完成時(shí)，混合發(fā)酵劑A的膠黏性較低，為 133.25 N。

咀嚼性是硬度、內(nèi)聚性、彈性三者的乘積^[28]，其受硬度變化的影響最大。兩種方式發(fā)酵腐乳的咀嚼性均為前酵過程中基本保持不變，后酵時(shí)隨著食鹽、白酒等輔料的加入迅速增加，在乳酸菌所分泌的脂肪水解酶和蛋白水解酶的長(zhǎng)時(shí)間作用下^[5]，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)鏈、蛋白質(zhì)-脂肪鏈、蛋白質(zhì)-淀粉鏈斷裂嚴(yán)重，分子間作用力降低，難以保持網(wǎng)絡(luò)組織結(jié)構(gòu)，因此咀嚼性逐漸下降。發(fā)酵完成時(shí)，混合發(fā)酵劑A的咀嚼性為74.1 N，混合發(fā)酵劑B的咀嚼性較低，為65.07 N。

2.3.2 腐乳發(fā)酵過程中彈性和內(nèi)聚性的變化

彈性是變形材料在去除變形力后恢復(fù)到未變形狀態(tài)的速率^[29]。前酵時(shí)，以蛋白酶為主的各類酶作用于豆腐坯上，由于酶解作用，腐乳的凝膠網(wǎng)絡(luò)空間瓦解，蛋白質(zhì)、脂肪、多糖碎片層疊堆積，彈性也隨之減小^[30]。隨著輔料的加入，腐乳的彈性回升，原因可能是水分滲出增大了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形變空間，形變程度更大，彈性有所回升。后酵完成時(shí)，混合發(fā)酵劑A的彈性最大，為0.55，混合發(fā)酵劑B的彈性為0.44。

內(nèi)聚性代表組成樣品內(nèi)部結(jié)合鍵的強(qiáng)度，反映了樣品抵抗受損并保持完整的能力^[31]。研究表明，內(nèi)聚性與樣品分子內(nèi)部的蛋白分子結(jié)構(gòu)和鍵型有關(guān)^[32]。前酵階段相比于后酵階段，內(nèi)聚性下降幅度更小，原因是雖然后酵期酶活受到一定的抑制，但作用于蛋白的時(shí)間長(zhǎng)，催化分解更充分。由于微生物和酶系的作用，后酵期大豆蛋白、多肽分解較徹底，因此發(fā)酵完成時(shí)內(nèi)聚性較低，混合發(fā)酵劑A的內(nèi)聚性較混合發(fā)酵劑B低。

2.4 腐乳的感官評(píng)分

混合發(fā)酵劑A發(fā)酵的腐乳坯體為亮紅色，剖面呈淡黃色，色澤锃亮。腐乳質(zhì)地柔軟，咸淡適中，口感細(xì)膩綿長(zhǎng)，輔料與發(fā)酵獨(dú)特的香味相協(xié)調(diào)，香氣純正誘人，有助于增進(jìn)食欲，感官評(píng)分較高。

3 結(jié)論

混合發(fā)酵劑A前酵的最優(yōu)工藝為接種濃度10⁶ CFU/mL、接種量3%、菌種比例1∶1∶1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間3 d，該工藝條件下蛋白酶活力為231.2 U/g，感官評(píng)分為83分。在后酵完成時(shí)，混合發(fā)酵劑A的彈性最大，其酶解作用更完全；對(duì)于內(nèi)聚性和膠黏性而言，混合發(fā)酵劑A均最小，蛋白質(zhì)降解得更徹底。混合菌種協(xié)同作用有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，混合菌種發(fā)酵的腐乳蛋白酶活力和感官評(píng)分均明顯高于單一菌種發(fā)酵的腐乳。

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