摘要：琥珀酸在食品中有廣泛的用途，但琥珀酸發(fā)酵往往受制于還原力不平衡的問(wèn)題。相比于其他常用于平衡還原力的酶，亞磷酸脫氫酶催化產(chǎn)物為磷酸鹽，對(duì)后續(xù)琥珀酸的分離純化影響較小。文章克隆了來(lái)源于施氏假單胞菌的亞磷酸脫氫酶（編碼基因?yàn)閜txD），比較ptxD在載體和基因組上表達(dá)對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響，同時(shí)研究了亞磷酸鹽添加量對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，在ptxD表達(dá)條件下，亞磷酸鹽在5～15 mmol/L范圍內(nèi)添加并未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制性，且在10 mmol/L時(shí)展現(xiàn)出較高的糖耗速率和琥珀酸得率?；蚪M上表達(dá)ptxD的工程菌 WS105（WS100，iclR：：pJ23119-ptxd）能積累79.38 g/L琥珀酸，較載體上表達(dá)ptxD的工程菌WS104（WS100/puc19-pJ23119-ptxd）提升了4.87%，較出發(fā)菌株WS100提升了13.81%。WS105副產(chǎn)物乙酸含量顯著下降，濃度為2.76 g/L，較WS100、WS104分別降低了42.38%、29.41%，表明亞磷酸脫氫酶的表達(dá)能有效促進(jìn)琥珀酸產(chǎn)量的提高。

關(guān)鍵詞：琥珀酸；亞磷酸脫氫酶；還原力平衡

中圖分類號(hào)：TS201.25 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）01-0210-06

Effect of Phosphite Dehydrogenase Expression on Succinic Acid Fermentation in Escherichia coli

LIU Li¹， CHEN Wei-qi¹， ZOU Shi-yao¹， WANG Jin-hua^{1，2，3}， GAO Wa^{1，2，3}， WANG Yong-ze^{1，2，3*}

（1.School of Bioengineering and Food Science， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China;2.Key Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China; 3.Collaborative Innovation Center of Industrial Fermentation Co-constructed by Ministry of Education and Hubei Province， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Succinic acid has a wide range of uses in food， but succinic acid fermentation is often limited by the problem of unbalanced reducing power. Compared with other enzymes commonly used for balancing reducing power， the catalytic product of phosphite dehydrogenase is phosphate， which has little effect on the subsequent separation and purification of succinic acid. In this paper， a phosphite dehydrogenase （encoding gene is ptxD） from Pseudomonas schszei is cloned， the effects of ptxD expression in vectors and genomes on succinic acid fermentation are compared， and the effect of phosphite addition amount on fermentation is also studied. The results show that under the condition of ptxD expression， the addition of phosphite within the range of 5～15 mmol/L does not exhibit any inhibitory effect on cell growth， and at 10 mmol/L， it exhibits a higher sugar consumption rate and succinic acid yield. The engineering strain WS105 （WS100， iclR：：pJ23119-ptxd） expressing ptxD on the genome can accumulate 79.38 g/L succinic acid， which is 4.87% higher than the engineering strain WS104 （WS100/puc19-pJ23119-ptxd） expressing ptxD on the vector， and 13.81% higher than that of the starting strain WS100. The content of acetic acid， a by-product of WS105， significantly decreases and the concentration is 2.76 g/L， which is 42.38% and 29.41% lower than WS100 and WS104 respectively， indicating that the expression of phosphite dehydrogenase can effectively promote the increase of succinic acid production.

Key words： succinic acid; phosphite dehydrogenase; reducing power balance

收稿日期：2024-07-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31501677）；企業(yè)合作項(xiàng)目（2021433）

作者簡(jiǎn)介：劉利（1993—），女，碩士，研究方向：生物醫(yī)藥。

*通信作者：王永澤（1976—），男，副教授，博士，研究方向：微生物代謝與發(fā)酵。

琥珀酸又名丁二酸，是一種重要的C4平臺(tái)化合物，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域。在食品行業(yè)中，琥珀酸常被制成琥珀酸二鈉，能強(qiáng)化食品的鮮味，添加在啤酒、醋、醬油等產(chǎn)品中能發(fā)揮重要的增強(qiáng)風(fēng)味作用^[1-3]，同時(shí)還可降低食品的加工成本^[4]。此外，琥珀酸衍生物辛烯基琥珀酸酯可用作乳化增稠劑，增加色拉油調(diào)味品的穩(wěn)定性^[5]。在醫(yī)藥行業(yè)，琥珀酸與代謝性心血管疾病及穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)，還能調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫功能^[6-7]。

目前琥珀酸主要由發(fā)酵法合成，相對(duì)于其他有機(jī)酸發(fā)酵，影響琥珀酸合成的關(guān)鍵因素是胞內(nèi)還原力平衡。實(shí)現(xiàn)還原力平衡常用的脫氫酶有醇脫氫酶（ADH）、甲酸脫氫酶（FDH）、葡萄糖脫氫酶（GDH）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）等^[8]，這些酶平衡還原力時(shí)往往存在需要額外添加碳源及產(chǎn)生毒副產(chǎn)物的問(wèn)題。如醇脫氫酶（ADH）作用需要額外添加乙醇，添加量高時(shí)會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用，所產(chǎn)生的乙醛也易使酶失活^[9]。葡萄糖脫氫酶（GDH）催化時(shí)需要添加葡萄糖，所產(chǎn)生的葡萄糖酸也會(huì)對(duì)后續(xù)分離產(chǎn)生影響^[10]。甲酸脫氫酶（FDH）可將甲酸轉(zhuǎn)化成二氧化碳，增加NADH供給^[11-12]，采用該酶催化時(shí)后續(xù)分離容易，但所生成的CO₂仍然會(huì)導(dǎo)致催化環(huán)境的酸化，所添加的甲酸底物對(duì)很多微生物具有一定毒性^[13-14]。

亞磷酸脫氫酶（編碼基因?yàn)閜txD）是一種NAD⁺依賴的酶，可以將亞磷酸鹽（Pt）轉(zhuǎn)化成磷酸鹽（Pi），同時(shí)可將NAD⁺還原成NADH ^[15]。亞磷酸鹽價(jià)格便宜，再生過(guò)程中亞磷酸緩沖液很容易轉(zhuǎn)化成磷酸緩沖液，對(duì)酶的活性幾乎沒(méi)有影響，且亞磷酸脫氫酶催化時(shí)pH值范圍更廣^[15]，此外，沒(méi)有亞磷酸脫氫酶的微生物無(wú)法產(chǎn)生磷酸鹽，因此ptxD的表達(dá)還能防止發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中雜菌的污染，ptxD已被引入至裂殖酵母、釀酒酵母^[16]和枯草芽孢桿菌^[17]中來(lái)對(duì)抗微生物污染。對(duì)于大腸桿菌而言，目前研究主要集中于將其作為宿主，用于ptxD基因的克隆和酶學(xué)性質(zhì)上的研究^[18-19]，目前仍缺乏ptxD作為一個(gè)還原力平衡因子在大腸桿菌上的應(yīng)用。

本研究以高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌E.coli WS100為出發(fā)菌株，通過(guò)ptxD的表達(dá)來(lái)補(bǔ)充強(qiáng)化琥珀酸發(fā)酵所需要的還原力。一方面，克隆來(lái)源于施氏假單胞菌的亞磷酸脫氫酶（編碼基因?yàn)閜txD），并比較載體及基因組上表達(dá)ptxD這兩種方式對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響；另一方面，研究亞磷酸鹽濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和琥珀酸產(chǎn)量的影響。通過(guò)內(nèi)部因子即ptxD基因的表達(dá)和環(huán)境因子亞磷酸鹽濃度的探究，共同促進(jìn)還原力的平衡和琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)量，為大腸桿菌還原力平衡探索出一條切實(shí)可行的路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

DNA Marker、PCR Master Mix：Fermentas公司；氨芐青霉素、卡那霉素：Zhejiang Mersco Industry amp; Trade Co.， Ltd.；L-阿拉伯糖：Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、酵母粉、葡萄糖（分析純）、NaCl和瓊脂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂。

搖瓶種子培養(yǎng)基：NBS培養(yǎng)基^[20]，葡萄糖20 g/L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：NBS培養(yǎng)基，將其中磷酸鹽替換成不同物質(zhì)的量濃度的亞磷酸二鈉鹽（0，5，10，15 mmol/L），葡萄糖 40 g/L，MgCO₃ 40 g/L，少許玻璃珠。

上罐種子培養(yǎng)基：NBS培養(yǎng)基，酵母粉2 g/L，葡萄糖40 g/L，MgCO₃ 25 g/L。

上罐發(fā)酵培養(yǎng)基：NBS培養(yǎng)基，酵母粉10 g/L，葡萄糖 100 g/L。當(dāng)菌株中有ptxD基因時(shí)，將NBS培養(yǎng)基中磷酸鹽替換成10 mmol/L亞磷酸二鈉鹽。

1.1.3 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）WS100（ΔldhA、ΔadhE、ΔpflB、ΔpoxB、ΔackA）^[21]。pKD4、pET28a、pUC19由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 引物

1.2 方法

1.2.1 ptxD基因的克隆及其在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá)

pET28a（+）-ptxD質(zhì)粒構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物Pet-1和Pet-2通過(guò)反向PCR方式將pET28a線性化；以施氏假單胞菌作為模版，采用引物pp1和pp2擴(kuò)增得到亞磷酸脫氫酶ptxD核酸序列，將ptxD序列和線性化的pET28a載體混合，使用T5 外切酶進(jìn)行處理^[22]，處理產(chǎn)物化轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α，涂布后用菌落PCR方式，利用驗(yàn)證引物Verify-Pet1和Verify-Pet2篩選質(zhì)粒，所篩得質(zhì)粒測(cè)序成功后，將其命名為pET28a（+）-ptxD。

重組蛋白ptxD誘導(dǎo)表達(dá)：將重組質(zhì)粒pET28a（+）-ptxD轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白電泳方法參照文獻(xiàn)[23]的方法。

1.2.2 ptxD基因在pUC19載體及基因組上的表達(dá)

pUC19-pJ23119-ptxD質(zhì)粒構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物 puc-f1 和 puc-f2通過(guò)反向PCR方式將pUC19線性化；以施氏假單胞菌為模板，設(shè)計(jì)引物ptxD-1和ptxD-2，PCR擴(kuò)增ptxD基因的同時(shí)，使ptxD基因帶上pJ23119啟動(dòng)子。將ptxD序列和線性化的pUC19載體混合，使用T5 外切酶進(jìn)行處理^[22]，處理產(chǎn)物化轉(zhuǎn)到DH5α，涂布后用菌落PCR方式，利用驗(yàn)證引物Verify-ptxD1和Verify-ptxD2篩選質(zhì)粒，篩得質(zhì)粒測(cè)序成功后命名為pUC19-pJ23119-ptxD。在質(zhì)粒pUC19-pJ23119-ptxD轉(zhuǎn)化到E.coli WS100 中，得到菌株E.coli WS104。

重組工程菌WS105構(gòu)建：以pKD4為模板，采用引物kk1和kk2擴(kuò)增FRT-Kan-FRT。以pUC19-pJ23119-ptxD為模板，采用引物pp1和pp2擴(kuò)增pJ23119-ptxD片段。采用融合PCR方法將FRT-Kan-FRT和pJ23119-ptxD融合：兩片段以摩爾比1∶1混合，10個(gè)循環(huán)后，取出反應(yīng)管加入引物CS-1和CS-2進(jìn)一步擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，即為同源重組打靶片段。RED同源重組具體方法參考文獻(xiàn)[21]，利用引物Verify-iclr1和Verify-iclr2進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性重組子，再送至生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司測(cè)序，驗(yàn)證重組子的正確性，測(cè)序無(wú)誤后將該陽(yáng)性克隆子繼續(xù)進(jìn)行抗性基因消除，將最終得到的菌株命名為E.coli WS105。

1.2.3 亞磷酸鹽濃度對(duì)ptxD基因表達(dá)的影響

將3株菌株WS100、WS104、WS105分別在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，在平板上挑選單菌落接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)8～12 h。將培養(yǎng)好的菌株以1%的接種量接種至250 mL的種子培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～12 h，種子液以25%接種量接種至200 mL的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，所有發(fā)酵設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.4 ptxD基因表達(dá)對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

將WS100、WS104、WS105大腸桿菌單菌落分別活化數(shù)代后接入種子培養(yǎng)基中，于200 r/min、37 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。當(dāng)種子菌體濃度（OD_{600 nm} ）達(dá)到15左右時(shí)，按10%的接種量接入帶有自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的7 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐條件：3 L上罐發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃、轉(zhuǎn)速300 r/min不通氣發(fā)酵。初始糖含量100 g/L，當(dāng)葡萄糖含量低于1%時(shí)，自動(dòng)流加75%葡萄糖，控制發(fā)酵液葡萄糖濃度為1%。以4 mol/L NaOH和2.4 mol/L NaHCO₃的混合液作為中和劑，通過(guò)自動(dòng)流加方式控制pH值在6.8左右。定時(shí)對(duì)發(fā)酵液取樣，檢測(cè)生物量（OD_{600 nm}）、有機(jī)酸含量^[21]。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物分析

生物量（OD_{600 nm}）：采用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量，波長(zhǎng)選定600 nm。

葡萄糖含量測(cè)定：所取發(fā)酵液樣品在10 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞殘留，收集上清液，用超純水稀釋一定倍數(shù)，使用SBA-40D生物傳感儀進(jìn)行葡萄糖含量測(cè)定。

有機(jī)酸含量測(cè)定：發(fā)酵液按體積比1∶1加入6%的硫酸溶液進(jìn)行處理，處理液漩渦振蕩5 min后，以10 000 r/min離心10 min。離心后的上清液用流動(dòng)相稀釋后，用0.22μm濾膜過(guò)濾備用，使用高效液相色譜儀測(cè)量發(fā)酵液中的有機(jī)酸含量。分析條件：色譜柱Xtimate Sugar-H；流動(dòng)相5 mmol/L H₂SO₄溶液；流速0.5 mL/min；柱溫45℃；檢測(cè)器PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10μL。

有機(jī)酸產(chǎn)量（g/L）=有機(jī)酸含量（g/L）×（取樣時(shí)發(fā)酵液體積（L）/發(fā)酵液初始體積（L））。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a（+）-ptxD、pUC19-pJ23119-ptxD質(zhì)粒的構(gòu)建

pET28a（+）-ptxD、pUC19-pJ23119-ptxD質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖1，其中pUC19-pJ23119-ptxD質(zhì)粒采用pJ23119強(qiáng)組成性啟動(dòng)子，同時(shí)采用ptxD原有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 重組蛋白ptxD誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

誘導(dǎo)后的條帶分子量與蛋白的理論分子量（36.6 kDa）相一致，表明ptxD克隆成功且能在載體pET28a上有效表達(dá)。

2.3 亞磷酸鹽濃度對(duì)ptxD基因表達(dá)的影響

大部分能促進(jìn)輔因子平衡的酶往往需要添加底物，如使用甲酸脫氫酶時(shí)往往添加了甲酸，但甲酸在低濃度下仍能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)^[24]，因此使用酶法平衡還原力時(shí)還需考慮底物添加濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)方面做一些平衡。本文考慮了不同濃度的亞磷酸鹽添加對(duì)琥珀酸發(fā)酵和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，沒(méi)有ptxD基因的出發(fā)菌株WS100在含5～15 mmol/L亞磷酸鹽的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵效果較差（見(jiàn)表2），隨著亞磷酸鹽濃度的增加，生物量從14.08±1.04降低至1.77±0.11，琥珀酸和乙酸未檢出；而ptxD基因在載體和基因組上表達(dá)的工程菌WS104、WS105在所研究的亞磷酸鹽濃度范圍內(nèi)，相對(duì)于各自未添加亞磷酸鹽的對(duì)照，生物量大多變化不顯著，甚至部分有少量提高，在10 mmol/L時(shí)，展現(xiàn)出較高的糖耗速率和琥珀酸得率。表達(dá)ptxD條件下，亞磷酸鹽在5～15 mmol/L范圍內(nèi)并未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制性，可能與ptxD基因在大腸桿菌工程菌中得以有效表達(dá)相關(guān)，大腸桿菌將亞磷酸鹽快速轉(zhuǎn)化成磷酸鹽，在降低亞磷酸鹽對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制的同時(shí)，也平衡了還原力，促進(jìn)了琥珀酸產(chǎn)量的提高。

2.4 ptxD分別在載體和基因組表達(dá)上發(fā)酵結(jié)果對(duì)比

由圖3可知，WS100、WS104、WS105均在發(fā)酵30 h時(shí)OD_{600 nm}值達(dá)到最大，分別為19.6，20.1，21.6。與WS100相比，WS105和WS104菌體生長(zhǎng)更明顯，表明ptxD表達(dá)后有利于菌體生長(zhǎng)。

由表3可知，基因組上表達(dá)ptxD的工程菌WS105（WS100，iclR：：pJ23119-ptxd）能積累79.38 g/L琥珀酸，較載體上表達(dá)ptxD的工程菌WS104（WS100/puc19- pJ23119-ptxd）提升了4.87%，較出發(fā)菌株WS100提升了13.81%。WS105副產(chǎn)物乙酸含量顯著下降，濃度為2.76 g/L，較WS100、WS104分別降低了42.38%、29.41%。

相比于WS104，WS105雖然ptxD拷貝數(shù)較少，但生物量較高，發(fā)酵效果更好，表明pJ23119這種強(qiáng)啟動(dòng)子能在基因低拷貝的情況下滿足基因表達(dá)的需要，WS104不僅基因拷貝數(shù)高，而且配上強(qiáng)啟動(dòng)子往往會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)帶來(lái)一定負(fù)荷而影響發(fā)酵^[25]，且發(fā)酵過(guò)程中還需要添加一定抗生素來(lái)維持相關(guān)質(zhì)粒存在，也進(jìn)一步增加了成本和操作的復(fù)雜性。

3 結(jié)論

本研究探究了亞磷酸脫氫酶對(duì)大腸桿菌琥珀酸發(fā)酵的影響，成功克隆了來(lái)自施氏假單胞菌的ptxD至載體pET28a（+）上，并在BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定分子量為36.6 kDa。進(jìn)一步將ptxD基因在pUC19載體和基因組上表達(dá)，并評(píng)價(jià)了亞磷酸鹽濃度對(duì)ptxD基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，沒(méi)有ptxD基因的出發(fā)菌株WS100在含5～15 mmol/L亞磷酸鹽的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵效果較差，隨著亞磷酸鹽濃度的增加，生物量從14.08±1.04降低至1.77±0.11，琥珀酸和乙酸未檢出；而ptxD基因在載體和基因組上表達(dá)的工程菌WS104、WS105在所研究的亞磷酸鹽濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)和發(fā)酵結(jié)果。基因組上表達(dá)ptxD的工程菌WS105（WS100，iclR：：pJ23119-ptxd）能積累79.38 g/L琥珀酸，較載體上表達(dá)ptxD的工程菌WS104（WS100/puc19-pJ23119-ptxd）提升了4.87%，較出發(fā)菌株WS100提升了13.81%。WS105的副產(chǎn)物乙酸含量顯著下降，濃度為2.76 g/L，較WS100、WS104分別降低了42.38%、29.41%，表明亞磷酸鹽的表達(dá)特別是在基因組上表達(dá)能有效促進(jìn)琥珀酸產(chǎn)量的提高。

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