【摘 要】目的：探討過表達SIRT4對人骨肉瘤細胞惡性生物學行為及對成骨分化的調(diào)控作用，以及過表達SIRT4對線粒體能量代謝的影響。方法：構建穩(wěn)定過表達SIRT4 的U2OS、MG63 骨肉瘤細胞株，通過qRT-PCR 和Western blot 檢測SIRT4 的mRNA和蛋白表達水平；CCK-8、克隆形成實驗、EDU555染色法及檢測細胞增殖；裸鼠脛骨成瘤實驗檢驗成瘤能力；流式細胞術檢測細胞周期；DAPI染色及Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡；細胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色和茜素紅S染色分別檢測細胞的早期和晚期成骨分化；葡萄糖檢測試劑盒測定培養(yǎng)基及細胞內(nèi)葡萄糖含量；乳酸檢測試劑盒測定培養(yǎng)基及細胞內(nèi)乳酸含量；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒檢測細胞總ATP含量；四甲基羅丹明酯染色（tetramethylrhodamine ethylester perchlorate，TMRE）測定試劑檢測線粒體膜電位。結果：過表達SIRT4組細胞增殖、遷移及侵襲能力降低，裸鼠脛骨成瘤的瘤體體積減小，凋亡細胞增多；過表達SIRT4組細胞的G0/G1期占比明顯增多，S期占比明顯減少；過表達SIRT4組細胞ALP染色、茜素紅S染色鈣鹽結節(jié)明顯增多；過表達SIRT4組培養(yǎng)基中的葡萄糖較對照組消耗減少，細胞中的葡萄糖含量較對照組減少；過表達SIRT4組細胞中的乳酸含量較對照組減少，培養(yǎng)基中的乳酸較對照組產(chǎn)生減少；過表達SIRT4組細胞的總ATP較對照組更低；過表達SIRT4組的線粒體膜電位較對照組更低。結論：在U2O和MG63細胞中，過表達SIRT4抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲以及成瘤能力，促進骨肉瘤細胞凋亡以及早晚期成骨分化，調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞能量代謝。

【關鍵詞】骨肉瘤；SIRT4；惡性生物學行為；成骨分化；能量代謝

【中圖分類號】R114 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-11-02

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，常發(fā)生在青少年中，新輔助化療的應用使骨肉瘤患者的生存率有了一定的提升，低級別骨肉瘤患者的5年生存率約為90%[1]，而骨肉瘤轉(zhuǎn)移性患者的5年總體生存率為35.5%[2]。目前骨肉瘤的病因尚未完全闡明，通過研究骨肉瘤的潛在發(fā)病機制，可能為臨床治療提供新的治療策略。

有研究指出能量代謝在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到不可或缺的作用[3]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)過表達糖異生關鍵酶基因（fructose-1，6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）和敲低3-磷酸甘油酸脫氫酶（3-phosphoglycerindehydrogenase，PHGDH）可以改變骨肉瘤糖代謝微環(huán)境，促進成骨分化，逆轉(zhuǎn)惡性生物學行為。sirtuin 4（SIRT4）主要位于線粒體中，一些證據(jù)表明SIRT4是能量代謝和腫瘤發(fā)生之間的“橋梁蛋白”[4]，SIRT4除了具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶、NAD+依賴性脫乙酰酶活性，還可以通過ADP-核糖基化、脫甲?；⒚撘阴；{(diào)節(jié)底物蛋白的功能[5-6]，這些酶的活性也使SIRT4能夠參與能量代謝過程，如促進胰島素的分泌、協(xié)同糖酵解抑制劑參與糖酵解過程[7]、抑制谷氨酸脫氫酶調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝[8]、參與DNA損傷反應[9]等，SIRT4已被證實在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤細胞增殖、分化、凋亡和能量代謝中發(fā)揮著重要作用[10-11]；在前列腺癌的研究中，過表達SIRT4抑制前列腺癌細胞的遷移、侵襲能力和增殖，誘導細胞凋亡，同時抑制谷氨酰胺的代謝[11]；同時有多項研究指出SIRT4 可以協(xié)同化療藥物，例如SIRT4可以增強結直腸癌細胞對5-FU和奧沙利鉑的化學敏感度[12]；SIRT4能增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性[13]等。本研究采用低表達SIRT4的骨肉瘤細胞株U2OS和MG63為研究對象，構建穩(wěn)定過表達SIRT4 的人骨肉瘤細胞株，以研究過表達SIRT4 對骨肉瘤細胞株U2OS 和MG63 惡性生物學行為、成骨分化及能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

骨肉瘤細胞株U2OS由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院黃增益教授贈予，骨肉瘤細胞株MG63由本實驗室保存；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；105 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；過表達SIRT4 慢病毒購自擎科生物；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、胰蛋白酶消化液、DAPI 染料、結晶紫染液、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、茜素紅S 染液、Beyo‐ClickTMEdU 555 細胞增殖檢測試劑盒、Triton-X100、抗熒光淬滅封片液、一抗稀釋液及封閉液、葡萄糖檢測試劑盒以及ATP檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 熒光染料購自abclonal 生物科技有限公司；CCK-8試劑購自米鼠（西安）生物科技有限公司；鼠抗人SIRT4單克隆抗體購自proteintech武漢三鷹生物技術有限公司，鼠抗β-actin 單克隆抗體、山羊抗鼠二抗購自成都正能生物技術有限責任公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；全蛋白提取試劑盒、乳酸（lactate，LD）測試盒以及Annexin VAPC/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；四甲基羅丹明酯染色（tetramethylrhodamineethylester perchlorate，TMRE）測定試劑購自Medchemex‐press公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物購自北京六合華大基因科技股份有限公司，引物序列見表1。

1.2 細胞培養(yǎng)

將U2OS、MG63細胞用含有10%胎牛血清及青霉素/鏈霉素（1X）的DMEM 高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后進行過表達SIRT4慢病毒和空白對照病毒轉(zhuǎn)染。

實驗設置2組，每次實驗重復次數(shù)至少3次以上：①陰性對照組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒；②SIRT4過表達組，轉(zhuǎn)染SIRT4過表達慢病毒。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測SIRT4 mRNA表達水平 篩選過表達SIRT4的慢病毒U2OS和MG63穩(wěn)定株篩選后，提取各組細胞總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過q-PCR 檢測各組細胞中SIRT4 mRNA表達水平。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測SIRT4和Id1的蛋白的表達 篩選過表達SIRT4的慢病毒U2OS和MG63穩(wěn)定株篩選后，提取各組細胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度并定量，再配制10% SDS-PAGE以分離目的蛋白。先用90 mV電壓15～20 min電泳，后轉(zhuǎn)130 mV電壓30 min電泳分離蛋白，將分離后的蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉30 min后洗膜；然后加入SIRT4 鼠抗人單克隆抗體（1∶40 000）、Id1（inhibitor ofDNA binding 1）兔抗人單克隆抗體（1∶1 000）、β-actin單克隆抗體（1∶10 000），4 ℃反應過夜；回收一抗后，繼續(xù)用TBST洗膜，隨后加入山羊抗鼠抗原（1∶5 000）、山羊抗兔抗原（1∶5 000），室溫反應2 h后TBST洗膜，最后ECL發(fā)光顯影。采用ImageJ軟件分析各組蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達水平通過目的蛋白與β-actin的比值來表示。

1.3.3 細胞克隆形成實驗、CCK-8、Edu555細胞增殖檢測法以及裸鼠脛骨成瘤實驗檢測細胞的增殖能力 1.3.3.1 細胞克隆形成實驗 細胞按5×102個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)到大多數(shù)單個克隆細胞數(shù)目大于50%為止，克隆完成后用4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗加入結晶紫染料，室溫避光孵育20 min，最后PBS洗滌3次后拍照。

1.3.3.2 CCK-8法 取2組骨肉瘤細胞按2.5×103個/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2 的孵箱中培養(yǎng)，于細胞貼壁0 h、24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1.5 h，最后用酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度（absorbance，A）值。

1.3.3.3 Edu555細胞增殖檢測法 細胞鋪板48 h后進行檢測，加入1×Edu工作液孵育3.5 h進行標記，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定30 min，去除固定液后PBS清洗，再用0.3%的Triton-X100通透15 min，后用PBS洗3次，再用Edu555工作液每個孔200 μL室溫避光敷育30 min，然后PBS洗3次，DAP染色15 min后用PBS清洗，最后用抗熒光淬滅封片液進行封片，使用共聚焦顯微鏡進行圖片拍攝。

1.3.3.4 裸鼠脛骨成瘤實驗 將MG63 2 組骨肉瘤細胞離心收集后計數(shù)，用無菌PBS 重懸細胞將細胞濃度調(diào)整為2×107 個/mL，用碘伏消毒后經(jīng)裸鼠膝關節(jié)注射60 μL的細胞懸液至脛骨骨膜內(nèi)，每周觀察腫瘤大小，4周后處死裸鼠，分離腫塊，拍照記錄。

1.3.4 DAPI染色法、Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測細胞的凋亡 1.3.4.1 DAPI染色法 細胞貼壁24 h后進行染色，4%多聚甲醛固定30 min后，用PBS清洗，加入DAPI染料室溫避光孵育，最后PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.4.2 Annexin V-APC/7-AAD 雙染法 用不含EDTA 的胰蛋白酶溶液消離心收集細胞沉淀，加入500 μL BlindBuffer輕輕吹勻成單細胞懸液，再加入5 μL AnnexinV-APC和5 μL7-ADD染液，輕輕吹勻，室溫避光染色10 min，最后進行流式細胞儀檢測。

1.3.5 劃痕法、Transwell檢測細胞侵襲、遷移能力 1.3.5.1 劃痕法 待細胞密度長到95%以上后用200 μL的Tip頭垂直均勻用力劃痕，PBS清洗后加入基礎培養(yǎng)，在0 h、24 h、48 h后鏡下觀察細胞劃痕愈合情況。劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%1.3.5.2 Transwell遷移實驗 將細胞離心計數(shù)，調(diào)節(jié)濃度為1×105個/mL，然后在Transwell chamber上室中加入100 μL無血清細胞懸液，下室加入500 μL 10% 血清的完全培養(yǎng)基，24 h加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后加入結晶紫染色，最后PBS清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5.3 Transwell 侵襲實驗 Transwell chamber 下室加入60 μL稀釋基質(zhì)膠，放入孵育箱中至基質(zhì)膠凝固，將細胞離心計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105個/mL，后上室中加入100 μL無血清細胞懸液，在下室中加入500 μL 10%血清的完全培養(yǎng)基，24 h后PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min后用PBS清洗，加入結晶紫染色，最后PBS輕洗用棉簽輕拭去上室細胞，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞周期 加入胰酶（不含EDTA）消化收集細胞離心，用PBS 洗滌后加入75% 乙醇4 ℃固定24 h，PBS洗滌后離心，加入500 μL細胞周期試劑，振蕩混勻，室溫避光放置30 min，最后流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.3.7 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色檢測細胞成骨分化能力 1.3.7.1 ALP染色法 細胞用含4%FBS、10 mmol/L β-磷酸甘油、0.1 μmol/L地塞米松、0.1 g/mL VitC的成骨培養(yǎng)基處理2周后，4%多聚甲醛室溫避光固定，再用堿性磷酸酶顯色緩沖室溫避光染色后拍照。

1.3.7.2 茜素紅S染色法 細胞經(jīng)過上述成骨培養(yǎng)基處理30 d后，4%多聚甲醛避光固定，再用茜素紅S染液室溫避光染色后拍照。

1.3.8 過表達SIRT4對骨肉瘤U2OS、MG63細胞能量代謝的影響 1.3.8.1 葡萄糖消耗量檢測 細胞鋪板24 h 后每孔加入200 μL裂解液，將細胞刮下離心收集，取上清液待測，每個EP 管中分別加入5 μL 標準品和樣品，再依次加入185 μLGlucose Assay Reagent，PCR儀上95 ℃ 8 min循環(huán)至4 ℃后，每管取180 μL液體至96孔板中，測定630 nm的A值，再用BCA試劑盒測樣品的蛋白濃度，最后按照說明方法計算葡萄糖消耗量。

1.3.8.2 乳酸生成量檢測 細胞鋪板24 h后離心，300 W超聲破碎收集上清液備用，EP管中分別加入20 μL的樣品與標準品、1 mL的酶工作液和200 μL的顯色劑混勻，37 ℃水浴箱反應10 min后加入2 mL終止液終止反應，每管吸出250 μL液體至潔凈的96孔板中，測定530 nm的A值；再用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度，最后按照說明方法計算乳酸生成量。

1.3.8.3 ATP檢測 細胞鋪板24 h后離心收集上清液備用，在避光的96孔板中依次加入100 μL ATP檢測工作液、20 μL樣品和標準品混勻，用化學發(fā)光儀測定RLU值，再用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度，最后按照說明方法計算細胞中ATP含量。

1.3.8.4 線粒體膜電位檢測 細胞鋪板24 h 加入稀釋的TMRE染料敷育30 min，再加入1X的Hoechest敷育20 min后用PBS清洗，最后加入DMEM，用共聚焦顯微鏡拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用 GraphPad Prism 9.4.1統(tǒng)計學軟件進行分析，采用t檢驗或單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 過表達SIRT4上調(diào)U2OS、MG63細胞中SIRT4的表達，抑制Id1的表達

Western blot檢測結果顯示SIRT4在骨肉瘤U2OS、MG63細胞中的表達均低于正常成骨細胞Hfob1.19（圖1A）（Plt;0.01、Plt;0.001），故以U2OS、MG63細胞為研究對象，過表達SIRT4進行實驗。實時熒光定量PCR檢測結果（圖1B）顯示，與對照組相比，過表達SIRT4中U2OS、MG63細胞的SIRT4mRNA表達水平明顯升高（Plt;0.001）；Western blot檢測結果（圖1C、D）顯示在過表達SIRT4的U2OS、MG63細胞的SIRT4蛋白表達水平升高（Plt;0.05）；Id1的蛋白表達水平降低（Plt;0.05）。這些結果表明，轉(zhuǎn)染SIRT4過表達慢病毒后，可明顯上調(diào)U2OS、MG63細胞中SIRT4的mRNA及蛋白表達水平，而上調(diào)的SIRT4則可以抑制Id1的表達。

2.2 過表達SIRT4可抑制骨肉瘤U2OS、MG63細胞增殖

細胞克隆形成實驗結晶紫染色結果（圖2A）顯示，過表達SIRT4 組U2OS、MG63 細胞克隆形成數(shù)較對照組減少；CCK-8 結果（圖2B）顯示，在0 h、24 h、48 h 時各處理組間A450 nm 值無明顯差異，在72 h時，過表達SIRT4組的A450 nm 值明顯小于對照組（Plt;0.01）；EDU染色（圖2C）結果顯示，過表達SIRT4組U2OS、MG63細胞增殖數(shù)較NC組明顯減少；裸鼠脛骨成瘤（圖2D）結果表明MG63過表達組細胞的瘤體明顯小于對照組。以上表明過表達SIRT4 可以抑制骨肉瘤U2OS、MG63細胞的增殖。

2.3 過表達SIRT4促進骨肉瘤U2OS、MG63細胞凋亡

DAPI染色（圖3A）顯示過表達SIRT4組U2OS、MG63細胞凋亡數(shù)目明顯多于對照組（Plt;0.05）；Annexin V-APC/7-AAD 雙染法流式細胞術結果（圖3B）顯示，與對照組相比較，過表達SIRT4 組細胞的凋亡率增高（Plt;0.05、Plt;0.01）。這些結果顯示，過表達SIRT4促進骨肉瘤U2OS、MG63細胞的凋亡。

2.4 過表達SIRT4抑制骨肉瘤U2OS、MG63細胞的遷移能力

劃痕實驗（圖4A）顯示，劃痕后24 h 及48 h，過表達SIRT4組劃痕愈合速度較NC組明顯減慢，48 h過表達SIRT4組劃痕愈合率明顯低于NC 組（Plt;0.01、Plt;0.001）；Transwell實驗（圖4B）顯示，過表達SIRT4組細胞的穿膜數(shù)明顯低于對照組細胞數(shù)。以上結果顯示，過表達SIRT4能夠抑制骨肉瘤U2OS、MG63細胞的遷移能力。

2.5 過表達SIRT4 抑制骨肉瘤U2OS、MG63 細胞的侵襲能力

基質(zhì)膠Transwell實驗結果（圖4C）顯示，過表達組的穿膜細胞數(shù)明顯低于對照組穿膜細胞數(shù)。結果提示，過表達SIRT4抑制骨肉瘤U2OS、MG63細胞的侵襲能力。

2.6 過表達SIRT4對骨肉瘤U2OS、MG63細胞周期的影響

流式細胞周期實驗結果（圖5）顯示，過表達SIRT4組細胞的G0/G1 期占比明顯增多，S期占比明顯減少（Plt;0.01、Plt;0.001）。這一結果提示，過表達SIRT4可以將細胞周期阻滯在G1期影響細胞分裂，從而影響U2OS、MG63的增殖。

2.7 過表達SIRT4促進骨肉瘤U2OS、MG63細胞的成骨分化能力

堿性磷酸酶染色結果（圖6A）顯示，過表達SIRT4組染色較對照組陽性率明顯上升；茜素紅S染色結果（圖6B）顯示，過表達SIRT4組與對照組相比鈣鹽沉積明顯增多。以上結果顯示，過表達SIRT4能夠促進骨肉瘤U2OS、MG63細胞的早期和晚期成骨分化。

2.8 過表達SIRT4對骨肉瘤U2OS、MG63細胞能量代謝的影響

檢測U2OS和MG63細胞的葡萄糖含量和培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量（圖7A），證明過表達SIRT4組所消耗的葡萄糖較對照組減少（Plt;0.05、Plt;0.01、Plt;0.001）；檢測U2OS 和MG63細胞的乳酸含量和培養(yǎng)基中的乳酸含量（圖7B），發(fā)現(xiàn)過表達SIRT4 組所產(chǎn)生的乳酸較對照組減少（Plt;0.05、Plt;0.01）；檢測U2OS和MG63細胞中的ATP（圖7C），發(fā)現(xiàn)過表達SIRT4組產(chǎn)生的ATP較對照組更少（Plt;0.01）；通過TMRE染色檢測線粒體膜電位（圖7D），發(fā)現(xiàn)過表達SIRT4組的平均熒光強度較對照組更低（Plt;0.05）。以上結果提示，過表達SIRT4可能通過影響U2OS、MG63骨肉瘤細胞的能量代謝來逆轉(zhuǎn)骨肉瘤的惡性生物學行為。

3 討 論

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年[14]，最常見的原發(fā)部位是長骨（例如股骨遠端）、脛骨近端和肱骨近端干骺端[15-17]。新輔助化療的出現(xiàn)使得無遠處轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的5年生存率約70%，而伴隨遠處轉(zhuǎn)移5年生存率則低至30%[18]。有研究指出能夠通過抑制JAK2/STAT3和WNT/β-catenin信號通路抑制骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移[19]；通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路抑制骨肉瘤的發(fā)展[20]；激活STING/IRF3/IFN-β通路誘導骨肉瘤的免疫浸潤[21]。骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個極其復雜的過程，因此發(fā)現(xiàn)骨肉瘤新的治療靶點勢在必行。

SIRT4是一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性蛋白去乙?；?，主要位于線粒體中，在線粒體代謝和其他過程中發(fā)揮作用，比如谷氨酸代謝和糖代謝[5]。最近大量的研究已經(jīng)證實了SIRT4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義[22-24]；在胰腺癌、胰腺導管腺癌、腎母細胞瘤、伯基特淋巴瘤的研究中表明，SIRT4可以抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲，促進凋亡，同時通過影響線粒體調(diào)節(jié)細胞的能量代謝[10，25-27]。與其他發(fā)現(xiàn)一致，本研究結果表明SIRT4可以抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移等惡性生物學行為，同時本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞過表達SIRT4后Id1被抑制；而本課題組前期發(fā)現(xiàn)敲低Id1可以逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞的惡性生物學行為[28]。SIRT4可能通過抑制Id1逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞的惡性生物學行為并促進其成骨分化。Id1又名分化抑制因子，它可以抑制細胞分化，促進細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞周期等[29-30]；在結腸癌和肺細胞癌的研究中表明Id1促進腫瘤細胞增殖和淋巴結轉(zhuǎn)移[31]，同時在肺細胞癌中敲低Id1影響糖酵解的關鍵酶[32]；所以SIRT4通過調(diào)節(jié)Id1影響骨肉瘤細胞的惡性生物學行為的具體機制還需進一步探索。

越來越多的研究表明，能量代謝與腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展有著密切的關系。例如通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）活性降低線粒體膜電位，促進肺癌細胞凋亡[33]；通過影響細胞的糖酵解可以抑制肝細胞癌的惡性進展[34]，以及通過抑制能量代謝聯(lián)合抗腫瘤藥物來發(fā)揮抗腫瘤作用[35]，并且近期有研究表明通過抑制骨肉瘤細胞的糖酵解可以抑制骨肉瘤的進展[36]；本研究發(fā)現(xiàn)過表達SIRT4后骨肉瘤細胞的葡萄糖的消耗和乳酸分泌減少。葡萄糖的消耗主要涉及糖酵解和三羧酸循環(huán)。有研究指出SIRT4可以抑制丙酮酸脫氫酶[37]，而丙酮酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶，所以SIRT4可能通過抑制三羧酸循環(huán)來抑制骨肉瘤細胞的惡性生物學行為；因此本研究檢測了骨肉瘤細胞的總ATP和線粒體膜電位，結果表明骨肉瘤細胞的總ATP含量和線粒體膜電位均降低。ATP主要通過糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生，線粒體是ATP主要產(chǎn)生部位，本研究結果中線粒體膜電位與ATP檢測結果一致。本研究結果表明過表達SIRT4可以影響人骨肉瘤細胞的能量代謝，而SIRT4是否通過抑制Id1調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的能量代謝影響惡性生物學行為有待進一步研究。

綜上所述，過表達SIRT4抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲，抑制骨肉瘤細胞體內(nèi)成瘤能力，促進骨肉瘤細胞凋亡及早晚期成骨分化，調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞能量代謝。而SIRT4能否通過抑制Id1調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的能量代謝進而影響惡性生物學行為還需進一步研究，從而為骨肉瘤的治療提供新的思路和方法。

參考文獻

[1] Cho WH，Song WS，Jeon DG，et al. Differential presentations，clinical

courses，and survivals of osteosarcomas of the proximal humerus

over other extremity locations[J]. Ann Surg Oncol，2010，17（3）：702-708．

[2] Cole S，Gianferante DM，Zhu B，et al. Osteosarcoma：a Surveillance，

Epidemiology，and End Results program-based analysis from

1975 to 2017[J]. Cancer，2022，128（11）：2107-2118．

[3] Hanahan D，Weinberg RA. Hallmarks of cancer：the next generation[

J]．Cell，2011，144（5）：646-674．

[4] Zhu YM，Yan YF，Principe DR，et al. SIRT3 and SIRT4 are mitochondrial

tumor suppressor proteins that connect mitochondrial metabolism

and carcinogenesis[J]. Cancer Metab，2014，2：15．

[5] Haigis MC，Mostoslavsky R，Haigis KM，et al. SIRT4 inhibits glutamate

dehydrogenase and opposes the effects of calorie restriction in pancreatic

beta cells[J]. Cell，2006，126（5）：941-954．

[6] Laurent G，German NJ，Saha AK，et al. SIRT4 coordinates the balance

between lipid synthesis and catabolism by repressing malonyl CoA

decarboxylase[J]. Mol Cell，2013，50（5）：686-698．

[7] Huang GY，Cheng J，Yu FD，et al. Clinical and therapeutic significance

of sirtuin-4 expression in colorectal cancer[J]. Oncol Rep，2016，

35（5）：2801-2810．

[8] Jeong SM，Xiao CY，F(xiàn)inley LW，et al. SIRT4 has tumor-suppressive

activity and regulates the cellular metabolic response to DNA damage

by inhibiting mitochondrial glutamine metabolism[J]. Cancer Cell，2013，

23（4）：450-463．

[9] Wan W，Li YN，Zhou CY，et al. SIRT4 expression in laryngeal

squamous cell carcinoma[J]. Pharmazie，2020，75（12）：646-650．

[10] Jeong SM，Lee AN，Lee J，et al. SIRT4 protein suppresses tumor

formation in genetic models of Myc-induced B cell lymphoma[J]. J Biol

Chem，2014，289（7）：4135-4144．

[11] Cai GH，Ge ZH，Xu YQ，et al. SIRT4 functions as a tumor sup‐

pressor during prostate cancer by inducing apoptosis and inhibiting glutamine

metabolism[J]. Sci Rep，2022，12（1）：12208．

[12] Zhu YY，Wang GY，Li XB，et al. Knockout of SIRT4 decreases

chemosensitivity to 5-FU in colorectal cancer cells[J]. Oncol Lett，2018，

16（2）：1675-1681．

[13] Xing JL，Li J，F(xiàn)u L，et al. SIRT4 enhances the sensitivity of ERpositive

breast cancer to tamoxifen by inhibiting the IL-6/STAT3 signal

pathway[J]. Cancer Med，2019，8（16）：7086-7097．

[14] Delgrosso E，Scocozza F，Cansolino L，et al. 3D bioprinted osteosarcoma

model for experimental boron neutron capture therapy （BNCT）

applications：preliminary assessment[J]. J Biomed Mater Res B Appl

Biomater，2023，111（8）：1571-1580．

[15] Brown HK，Schiavone K，Gouin F，et al. Biology of bone sarcomas

and new therapeuticdevelopments[J]. Calcif Tissue Int，2018，102（2）：

174-195．

[16] Dong ZH，Liao ZP，He YL，et al. Advances in the biological functions

and mechanisms of miRNAs in the development of osteosarcoma

[J]. Technol Cancer Res Treat，2022，21：15330338221117386．

[17] Xie DL，Wang ZQ，Li J，et al. Targeted delivery of chemotherapeutic

agents for osteosarcoma treatment[J]. Front Oncol，2022，12：

843345．

[18] Panez-Toro I，Mu?oz-García J，Vargas-Franco JW，et al. Advances

in osteosarcoma[J]. Curr Osteoporos Rep，2023，21（4）：

330-343．

[19] Huang H，Han Y，Chen ZJ，et al. ML264 inhibits osteosarcoma

growth and metastasis via inhibition of JAK2/STAT3 and WNT/β

-catenin signalling pathways[J]. J Cell Mol Med，2020，24（10）：5652-

5664．

[20] Zhu WT，Zeng XF，Yang H，et al. Resveratrol loaded by folatemodified

liposomes inhibits osteosarcoma growth and lung metastasis

via regulating JAK2/STAT3 pathway[J]. Int J Nanomed，2023，18： 2677-

2691.

[21] Wu W，Zhang ZH，Jing DD，et al. SGLT2 inhibitor activates the

STING/IRF3/IFN-β pathway and induces immune infiltration in osteosarcoma[

J]. Cell Death Dis，2022，13（6）：523．

[22] Zhao S，Wang JM，Yan J，et al. BAG3 promotes autophagy and

glutaminolysis via stabilizing glutaminase[J]. Cell Death Dis，2019，10

（4）：284．

[23] Yal??n GD，Colak M. SIRT4 prevents excitotoxicity via modulating

glutamate metabolism in glioma cells[J]. Hum Exp Toxicol，2020，39

（7）：938-947．

[24] Cui Y，Bai YB，Yang JN，et al. SIRT4 is the molecular switch mediating

cellular proliferation in colorectal cancer through GLS mediated

activation of AKT/GSK3β/CyclinD1 pathway[J]. Carcinogenesis，2021，

42（3）：481-492．

[25] Hu QS，Qin Y，Ji SR，et al. UHRF1 promotes aerobic glycolysis

and proliferation via suppression of SIRT4 in pancreatic cancer[J]. Cancer

Lett，2019，452：226-236．

[26] Ping DN，Pu XF，Ding GP，et al. Sirtuin4 impacts mitochondrial

homeostasis in pancreatic cancer cells by reducing the stability of AlkB

homolog 1 via deacetylation of the HRD1-SEL1L complex[J]. Biochim

Biophys Acta Gene Regul Mech，2023，1866（2）：194941．

[27] Wang YM，Guo YM，Gao JZ，et al. Tumor-suppressive function of

SIRT4 in neuroblastoma through mitochondrial damage[J]. Cancer

Manag Res，2018，10：5591-5603．

[28] 仇 超，康 權，迭小紅，等. Id1基因?qū)θ斯侨饬黾毎麗盒阅?/p>

轉(zhuǎn)向成骨分化的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2016，38（4）：344-349．

Qiu C，Kang Q，Die XH，et al. Effect of Id1 gene on reversing malignant

biological behaviors and inducing osteogenic differentiation of human

osteosarcoma cells[J]. J Third Mil Med Univ，2016，38（4）：344-349．

[29] Roschger C，Cabrele C. The Id-protein family in developmental

and cancer-associated pathways[J]. Cell Commun Signal，2017，15（1）：7.

[30] Singh SK，Singh S，Gadomski S，et al. Id1 ablation protects hematopoietic

stem cells from stress-induced exhaustion and aging[J]. Cell

Stem Cell，2018，23（2）：252-265.

[31] Lin ZK，Liu Y，Xu T，et al. STAT3-mediated promoter-enhancer

interaction up-regulates inhibitor of DNA binding 1（ID1） to promote

colon cancer progression[J]. Int J Mol Sci，2023，24（12）：10041．

[32] Sharma BK，Kolhe R，Black SM，et al. Inhibitor of differentiation

1 transcription factor promotes metabolic reprogramming in hepatocellular

carcinoma cells[J]. FASEB J，2016，30（1）：262-275．

[33] Xu X，Hou YQ，Lin SM，et al. Sodium selenite inhibits proliferation

of lung cancer cells by inhibiting NF-κB nuclear translocation and

down-regulating PDK1 expression which is a key enzyme in energy metabolism

expression[J]. J Trace Elem Med Biol，2023，78：127147．

[34] Xing BY，Shen CY，Yang QL，et al. miR-144-3p represses hepatocellular

carcinoma progression by affecting cell aerobic glycolysis via

FOXK1[J]. Int J Exp Pathol，2023，104（3）：117-127．

[35] Kimura K，Chun JH，Lin YL，et al. Tetra-O-methyl-nordihydroguaiaretic

acid inhibits energy metabolism and synergistically induces

anticancer effects with temozolomide on LN229 glioblastoma tumors

implanted in mice while preventing obesity in normal mice that

consume high-fat diets[J]. PLoS One，2023，18（5）：e0285536．

[36] Weng YP，Duan WH，Yu XC，et al. MicroRNA-324-3p inhibits

osteosarcoma progression by suppressing PGAM1-mediated aerobic glycolysis[

J]. Cancer Sci，2023，114（6）：2345-2359．

[37] Mathias RA，Greco TM，Oberstein A，et al. Sirtuin 4 is a lipoamidase

regulating pyruvate dehydrogenase complex activity[J]. Cell，2014，

159（7）：1615-1625．

（責任編輯：李青穎）