【摘 要】目的：挖掘椎間盤退變（ intervertebral disc degeneration，IDD）及其相關(guān)疼痛癥狀的新MicroRNA生物標志物并探索相關(guān)分子機制。方法：從已發(fā)表的文獻和全基因組關(guān)聯(lián)研究 （genome-wide association studies，GWAS）Catlog數(shù)據(jù)庫中獲取MicroRNA、背部疼痛和坐骨神經(jīng)痛的GWAS數(shù)據(jù)，從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus ，GEO）數(shù)據(jù)庫中下載IDD相關(guān)的MicroRNA和mRNA表達數(shù)據(jù)。利用孟德爾隨機化和生物信息學分析挖掘關(guān)鍵MicroRNA，并基于GeneMANIA數(shù)據(jù)庫探索其靶基因的生物學功能。結(jié)果：孟德爾隨機化分析結(jié)果表明，has-miR-204-5p與背部疼痛（GCST90018797，OR=0.9761）和坐骨神經(jīng)痛（GCST90044614，OR=0.8957）均具有明顯的因果效應。同時，生物信息學分析結(jié)果顯示，has-miR-204-5p在IDD組織中明顯低表達，其3個靶基因Ⅲ型膠原蛋白α1鏈（collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1），核糖體蛋白側(cè)柄亞基P1（ribosomalprotein lateral stalk subunit P1，RPLP1）和轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor 4，TCF4）在IDD組織中異常高表達。此外，生物學功能富集分析揭示，3個靶基因主要富集在膠原蛋白、核糖體和Wnt信號通路等與IDD密切相關(guān)的生物學功能上。結(jié)論：HasmiR-204-5p是一種可靠的IDD生物標志物，在IDD及其相關(guān)疼痛癥狀中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】椎間盤退變；孟德爾隨機化；生物信息學；has-miR-204-5p

【中圖分類號】R681.5 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-03-22

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是一種消耗大量醫(yī)療資源的慢性退行性疾病[1]。IDD導致的椎間盤結(jié)構(gòu)變化和脊柱不穩(wěn)定，是背部疼痛、外周神經(jīng)壓迫癥狀以及椎管狹窄發(fā)生的主要原因[2]。根據(jù)流行病學調(diào)查顯示，坐骨神經(jīng)痛（腰椎外周神經(jīng)壓迫癥狀）在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為1%～5%，其終生患病率高達43%，而80%的人一生中至少會受到1次腰痛的影響，這些現(xiàn)象不僅導致了嚴重的醫(yī)療負擔還嚴重影響人們的生活質(zhì)量[3-5]。雖然許多腰痛和坐骨神經(jīng)痛患者的疼痛癥狀在早期接受治療的數(shù)周內(nèi)明顯減輕[6]。但是，1項報告顯示，45%的腰痛和坐骨神經(jīng)痛患者1年后的殘疾狀況沒有明顯改善[7]，同時34%患者的癥狀在2年后轉(zhuǎn)化為慢性疼痛[8]。遺憾的是，目前IDD的病理生理機制尚不完善，并且缺少有效的診斷標志物。

MicroRNA 是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，主要通過與其靶基因的互補3’非翻譯區(qū)來抑制該基因的表達。大多數(shù)MicroRNA在物種間具有高度保守性，同時其表達也具有空間、時間、組織和細胞類型特異性[9-10]。大量證據(jù)表明，MicroRNA通過介導髓核細胞的增殖、凋亡以及細胞外基質(zhì)重組，在IDD中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。研究顯示，has-miR-21在IDD組織中表達上調(diào)會導致髓核細胞的異常增殖和細胞簇形成進而導致IDD的發(fā)生發(fā)展[12]。另1項研究表明has-miR-155可以通過下調(diào)細胞凋亡關(guān)鍵蛋白（Caspase3 ，CASP3）和磷酸化Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（fas associated via death domain，F(xiàn)ADD）來抑制髓核細胞凋亡，但該MicroRNA 在IDD組織的髓核細胞中明顯下降[13]。此外，椎間盤細胞外基質(zhì)重組也是IDD發(fā)生的重要原因，研究顯示has-miR-377與該過程密切相關(guān)[14]。總之，挖掘并探索MicroRNA 在IDD 中的生物學功能，可以提供更多IDD相關(guān)分子機制的理論依據(jù)，并為IDD的診斷和精準治療帶來契機。

隨著多學科的交叉融合以及測序技術(shù)的進步，基于計算機科學和測序數(shù)據(jù)，研究者們對疾病的病理生理學機制有了更為深入的了解。孟德爾隨機化是一種因果推斷方法，通過遺傳變異評估暴露因素（疾病、基因/蛋白表達、代謝產(chǎn)物和腸道菌群等）與臨床結(jié)局之間的因果效應[15]。該方法可以在很大程度上避免大多數(shù)混雜因素對結(jié)局的影響，因此被廣泛應用[16]。本研究獲取MicroRNA、IDD及其相關(guān)疼痛癥狀的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide associationstudies，GWAS）數(shù)據(jù)和微陣列芯片數(shù)據(jù)，利用孟德爾隨機化和生物信息學分析，挖掘出1個新的MicroRNA（has-miR-204-5p），揭示了IDD 的一種新的病理生理機制，為后續(xù)的精準治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從1篇已發(fā)表的文獻中獲取75種MicroRNA 的順式表達數(shù)量性狀位點（cis-expression quantitative trait locus，ciseQTL）GWAS數(shù)據(jù)[17]；從GWAS Catalog數(shù)據(jù)庫中下載背部疼痛（GCST90018797）和腰椎外周神經(jīng)壓迫癥狀（坐骨神經(jīng)痛，GCST90044614）的GWAS數(shù)據(jù)。從GEO數(shù)據(jù)庫（（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載IDD組織的MicroRNA（GSE116726）和mRNA（GSE23130）微陣列芯片數(shù)據(jù)，并對其進行背景矯正，標準化和探針注釋。

1.2 孟德爾隨機化分析

為篩選出合適的工具單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP），本研究進行了如下操作：①選擇與MicroRNA表達量明顯相關(guān)的SNP（Plt;1×10-5）；②去除cis-eQTL中的SNP連鎖不平衡，閾值設(shè)為：r2lt;0.3，kb=500；③剔除F 統(tǒng)計值小于10 的弱工具變量避免發(fā)生偏倚；④使用IEUOpenGWAS project數(shù)據(jù)庫（https：//gwas.mrcieu.ac.uk）剔除與結(jié)局具有顯著相關(guān)性的混淆因素。

為評估MicroRNA與IDD相關(guān)疼痛癥狀間的因果效應，本研究采用雙樣本孟德爾隨機化分析，以逆方差加權(quán)法（inverse-variance weighted，IVW）作為分析的主要指標。同時，結(jié)合MR-Egger法、加權(quán)中位數(shù)（weighted median）、加權(quán)模型（weighted mode）和簡單模型（simple mode）算法對結(jié)果進行補充。在某一MicroRNA 結(jié)果中，當5 種算法的效應方向不一致時，則該MicroRNA不納入后續(xù)分析。隨后，基于Cochran’s Q 檢驗評估變量間異質(zhì)性以及MR-Egger-Intercept檢驗和MR-PRESSO檢驗評估變量間水平多效性，旨在對分析結(jié)果進行敏感性分析。

1.3 關(guān)鍵MicroRNA和靶基因的鑒定

首先，對GCST90018797 和GCST90044614 的孟德爾隨機分析結(jié)果中的明顯MicroRNA取交集。然后，使用LimmaR包對GSE116726數(shù)據(jù)集進行正常樣本和IDD樣本間的MicroRNA差異表達分析，并將閾值設(shè)為：|LogFC|gt;1.5 和Plt;0.05。接著，使用multiMiR R 包探索差異MicroRNA 的靶基因，該軟件包整合了來源于miRecords，miRTarBase，and Tar‐Base數(shù)據(jù)庫中MicroRNA及其靶向靶基因的相關(guān)數(shù)據(jù)，為探索MicroRNA在疾病中的分子機制提供了極大便利。同時，這些數(shù)據(jù)均從已發(fā)表的文獻中收集整理，具有可靠性。隨后，對GSE23130進行差異表達分析，相關(guān)閾值與上述一致。最后，將MicroRNA靶基因和差異表達基因進行交叉分析，旨在挖掘出關(guān)鍵靶基因。

1.4 關(guān)鍵靶基因的生物學功能富集分析

基于GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫（https：//genemania.org/），對關(guān)鍵靶基因和20個與其密切相關(guān)的基因進行生物功能富集分析并構(gòu)建蛋白互作（ protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 統(tǒng)計學方法

本研究主要基于R軟件（V 4.3.2）進行分析，相關(guān)圖形由ggplot2 R包進行繪制。除外特殊說明。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)鍵MicroRNA的鑒定

孟德爾隨機化分析結(jié)果顯示，6種MicroRNA對背部疼痛（GCST90018797）具有因果效應，5種MicroRNA對坐骨神經(jīng)痛（GCST90044614）具有因果效應（圖1），這些結(jié)果均通過了敏感性分析，具有可靠性。其中，2 種MicroRNA（hasmiR-125b-5p和has-miR-204-5p）在2個數(shù)據(jù)集中均有因果效應（圖2A）。但是，因果效應散點圖顯示has-miR-125b-5p 在2 個數(shù)據(jù)集中具有不同的因果效應，同時其在GCST90044614結(jié)果中的5種因果效應評估算法也不具有一致性，遂予以剔除（圖2B）。因此，has-miR-204-5p被鑒定為關(guān)鍵MicroRNA，并且在緩解IDD 相關(guān)疼痛癥狀中發(fā)揮作用。

2.2 關(guān)鍵靶基因的鑒定

GSE116726差異分析結(jié)果顯示，has-miR-204-5p在IDD組織中明顯低表達（圖3A），而在其891個靶基因中，有3個基因（Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈（collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1），核糖體蛋白側(cè)柄亞基P1（ribosomal protein lateralstalk subunit P1，RPLP1）和轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor 4，TCF4）在GSE23130數(shù)據(jù)集中的IDD組織中明顯高表達（圖3B～D）。這些證據(jù)顯示，has-miR-204-5p 在IDD 組織的低表達會導致COL3A1，RPLP1和TCF4的表達上升，進而導致IDD及其相關(guān)疼痛癥狀的發(fā)生。

2.3 關(guān)鍵靶基因的生物學功能富集分析

GeneMANIA數(shù)據(jù)庫主要基于物理學相互作用（physical"interactions）、共表達（co-expression）、預測（predicted）、共定位（co-localization）、通路（pathway）、基因相互作用（geneticinteractions）和共享蛋白結(jié)構(gòu)域（shared protein domains）等方式篩選出與目標基因密切相關(guān)的20個基因并進行生物學功能富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，COL3A1主要富集在膠原蛋白上，RPLP1主要富集在核糖體上，而TCF4主要參與Wnt信號通路的調(diào)控（圖4A～C）。

3 討 論

近年來，盡管經(jīng)過大量的臨床和基礎(chǔ)研究，IDD的相關(guān)機制仍不清楚，阻礙了該疾病治療策略的發(fā)展。本研究首次利用MicroRNA的cis-eQTL數(shù)據(jù)進行與背部疼痛和坐骨神經(jīng)痛的孟德爾隨機化分析，發(fā)現(xiàn)has-miR-204-5p與IDD相關(guān)疼痛癥狀呈負相關(guān)，并且分析結(jié)果均通過了異質(zhì)性和水平多效性檢驗，證實了研究結(jié)果的可靠性。同時，生物信息學分析結(jié)果顯示IDD組織中has-miR-204-5p的表達降低會導致COL3A1，RPLP1和TCF4的表達水平升高。這些證據(jù)揭示了一種IDD及其相關(guān)疼痛癥狀發(fā)生的新機制。

COL3A1 編碼的Ⅲ型膠原蛋白主要存在于皮膚、血管、肺和腸道等可伸展結(jié)締組織中，與包括IDD在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)，如腎病、主動脈瘤、埃勒斯-當洛斯綜合征和腫瘤[18-21]。研究表明，Ⅲ型膠原蛋白在IDD組織中的表達上調(diào)約3.25倍[22]，并且在髓核和纖維環(huán)也觀察到其表達的增加[23]。同時，也有證據(jù)顯示，COL3A1在IDD組織中明顯高表達，并且與腰痛密切相關(guān)[2，24]。正常情況下，椎間盤細胞外基質(zhì)處于一種平衡狀態(tài)，但這種平衡在IDD中被打破，主要表現(xiàn)為膠原蛋白類型改變和蛋白聚糖含量減少，最終導致組織完整性喪失和相關(guān)癥狀出現(xiàn)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在IDD 組織中，has-miR-204-5p 的低表達會導致COL3A1 的表達上調(diào)。這可能促使Ⅲ膠原蛋白的異常增加，進而影響椎間盤細胞外基質(zhì)的平衡狀態(tài)，最終導致IDD的進展。但這一復雜的分子機制仍不明確，值得后續(xù)深入探索。

RPLP1編碼的蛋白是核糖體60S大亞基的重要結(jié)構(gòu)成分，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中扮演著至關(guān)重要的角色，并且在腫瘤領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[26-27]。RPLP1在IDD 組織中的高表達表達可能會導致核糖體功能異常并影響膠原蛋白、基質(zhì)金屬酶、組織蛋白酶等椎間盤高度相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平，進而導致IDD的發(fā)生發(fā)展，其相關(guān)機制需在后續(xù)的研究中進行探索和驗證。

TCF4編碼的轉(zhuǎn)錄因子4在人體組織中廣泛表達，并且在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。同時，該基因與精神分裂癥、?？怂箖?nèi)皮性角膜營養(yǎng)不良、原發(fā)性硬化性膽管炎和腫瘤等疾病密切相關(guān)[28]。研究表明，TCF4是Wnt信號通路轉(zhuǎn)導過程中的重要蛋白，其功能受損會導致Wnt 信號傳導抑制[29]。Wnt信號通路與IDD密切相關(guān)，是該領(lǐng)域研究最多的信號通路之一。研究表明，Wnt信號通路的激活會抑制髓核細胞增殖、促進髓核細胞衰老和凋亡以及降解髓核細胞外基質(zhì)，最終導致IDD的發(fā)生和進展[30]。結(jié)合之前研究和本研究的結(jié)果，本研究提出了一個假設(shè)：IDD組織中has-miR-204-5p下調(diào)導致TCF4表達上升，激活Wnt信號通路，最終導致IDD的發(fā)生發(fā)展。因此，has-miR-204-5p/TCF4/Wnt 信號軸，很可能是一種新的IDD發(fā)病機制，這為后續(xù)研究提供了一個全新的理論依據(jù)，非常值得后續(xù)深入研究。

當然，本研究存在著一定的局限性。首先，由于樣本量較少，存在著個體間差異，這需要后續(xù)的大規(guī)模隊列驗證。其次，本研究未進行基礎(chǔ)實驗驗證，后續(xù)需要予以補充以加強研究結(jié)果的可靠性。

總之，本研究基于孟德爾隨機化和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)has-miR-204-5p在IDD組織中明顯低表達會介導COL3A1，RPLP1和TCF4的表達水平異常升高，最終導致IDD及其相關(guān)疼痛癥狀的發(fā)生。這一證據(jù)揭示了一種新的IDD發(fā)生發(fā)展機制，為后續(xù)研究提供了參考。

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（責任編輯：周一青）