耿詩涵+單秋月+許夢習(xí)+張譯丹++宋麗麗++侯寧+張聞+張密霞+莊朋偉+張艷軍

[摘要]采用單次腹腔注射野百合堿（MCT）的方法復(fù)制大鼠肺心病模型，芪參益氣滴丸浸膏灌胃給藥6周后，通過HPLC檢測大鼠右心肌組織中的腺苷酸（ATP，ADP，AMP）的含量，進(jìn)而考察芪參益氣滴丸對(duì)肺心病大鼠心肌能量代謝的影響。結(jié)果顯示ATP，ADP，AMP達(dá)到良好分離；ATP，ADP，AMP在考察的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；加樣回收率均在90%～108%；與模型組相比，高劑量給藥組大鼠心肌中ATP的含量顯著性升高，ADP的含量有升高趨勢，AMP含量有下降趨勢。提示芪參益氣滴丸能夠改善心肌組織能量代謝系統(tǒng)。通過HPLC，為測定心肌組織中ATP，ADP，AMP含量提供了一種快速、高效的定性定量分析方法，為生物樣品中能量代謝相關(guān)含量的測定研究提供了參考。

[關(guān)鍵詞]芪參益氣滴丸； 肺心病； 能量代謝； HPLC； 含量測定

慢性肺源性心臟?。ê喎Q肺心病，PHD），屬于中醫(yī)學(xué) “肺脹”、“喘病”、“水腫”等范疇，病機(jī)多為肺、脾、心、腎虧虛，進(jìn)而引起痰、瘀、水潴留。益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)是其基本治法[12]。芪參益氣滴丸（QS）具有益氣通脈、活血止痛的作用，在臨床上主要用于冠心病和心力衰竭，且對(duì)肺心病也有一定的療效，但對(duì)肺心病的治療機(jī)制尚不明確[3]。肺心病后期可出現(xiàn)全心衰，心肌能量代謝底物利用變化，能量消耗增加，游離脂肪酸堆積，抑制糖酵解，使心肌能量代謝進(jìn)一步惡化[45]。有研究表明，QS能通過增加心肌組織中ATP的含量來改善心肌能量代謝[6]。作者推測QS可能通過改善心肌能量代謝的途徑從而對(duì)肺心病起到治療作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究。

1材料

島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；電子分析天平（BT125D，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超聲破碎儀[Biosafer250up，賽飛（中國）有限公司]；超速離心機(jī)（sigma3k15，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；超聲清洗儀（KQ500E，昆山市超聲儀器有限公司）。

QS浸膏（黃芪、丹參、三七、降香，天士力制藥集團(tuán)股份有限公司）；野百合堿（MCT，GR132140225，南京廣潤生物制品有限公司）；色譜純乙腈（500 mL，天津市康科德科技有限公司）；三磷酸腺苷二鈉，二磷酸腺苷二鈉，5′腺嘌呤核苷酸二鈉鹽（批號(hào)20151104，北京索萊寶科技有限公司）；氫氧化鈉，磷酸二氫鉀，氫氧化鉀（500 g，分析純，天津市化學(xué)試劑供銷公司）；高氯酸（天津市化學(xué)試劑供銷公司）。

40只雄性Wistar大鼠，180～200 g，SPF級(jí)，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）20120001。

2方法

21實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

飼養(yǎng)于天津市放射醫(yī)學(xué)研究所，溫度（22±2） ℃，濕度（60±5）%。飼料為標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，自由攝食飲水。

22實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C，n=10），模型組（M，n=10），QS低劑量組（L，n=10），QS高劑量組（H，n=10）。

23肺心病模型的復(fù)制

無水乙醇和生理鹽水（2∶8）混合液將MCT配成1%的溶液備用。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，M，L，H組單次腹腔注射MCT（60 mg·kg-1），C組腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水。

24給藥方法

造模次日起，L組灌服2倍臨床等效劑量的QS浸膏（945 mg·kg-1），H組灌服4倍臨床等效劑量的QS浸膏（189 mg·kg-1），C和M組灌服相應(yīng)體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥6周后進(jìn)行藥效學(xué)研究。

25大鼠心肌組織中ATP，ADP，AMP的測定

251對(duì)照品的制備

稱取ATP對(duì)照品111 mg，ADP對(duì)照品096 mg，AMP對(duì)照品119 mg，分別加蒸餾水定容至1 mL，各取3種儲(chǔ)備液一定量混合后得混標(biāo)溶液，4 ℃避光保存，備用。

252樣品的制備

取大鼠右心肌組織約200 mg，按心肌組織質(zhì)量高氯酸溶液（042 mol·L-1）體積 1∶5加高氯酸溶液，在溶液中剪碎心肌組織，于4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入KOH溶液（05 mol·L-1）調(diào)節(jié)pH在60左右，靜置5 min，同條件下離心10 min，取上清液，過022 μm微孔濾膜，得到樣品溶液[78]。

253色譜條件

Venusil MP C18色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）磷酸鹽緩沖液（B，pH 61），梯度洗脫，0～20 min，0% A，20～30 min，0%～60%A，30～45 min，60%～0%A；柱溫為室溫；流速1 mL·min-1；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。

26統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，應(yīng)用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，ANOVA做不同組之間差異比較，P<005時(shí)為顯著差異。

3結(jié)果

31高效液相色譜法方法學(xué)考察[9]

311專屬性

ATP，ADP，AMP對(duì)照品進(jìn)樣后保留時(shí)間分別為74，92，178 min。

312線性關(guān)系考察

分別將儲(chǔ)備液稀釋2，4，8，16，32，76，900倍，制成系列對(duì)照品溶液。測定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

313檢測限與定量限

將對(duì)照品儲(chǔ)備液用蒸餾水逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測定，4討論

本實(shí)驗(yàn)通過改變不同的色譜條件，以及樣品處理過程中的變量因素，篩選并建立了一種快速測定大鼠心肌組織中ATP，ADP，AMP含量的高效液相色譜方法，并且在此色譜條件下對(duì)ATP，ADP，AMP的檢測進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察。

參照文獻(xiàn)[1012]，采用磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，蒸餾水）為水相，比較有機(jī)相甲醇和乙腈，使用乙腈時(shí)柱壓相對(duì)平穩(wěn)，減少磷酸鹽緩沖液對(duì)高效液相色譜儀的損傷；通過改變兩相的比例，找出樣品出峰的最佳條件?？瞻讟悠分械姆鍨榱鲃?dòng)相梯度改變程度大所致，ATP，ADP，AMP在這個(gè)峰之前出峰，對(duì)樣品分析沒有干擾。比較水相pH為56，61，66時(shí)樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)pH為61時(shí)，ATP，ADP，AMP出峰時(shí)間合理且分離度較好，故調(diào)整水相的pH為61。最佳色譜條件為有機(jī)相采用乙腈；流動(dòng)相梯度0～20 min，0%乙腈；20～30 min，0～60%乙腈；30～45 min，0%乙腈；調(diào)節(jié)水相pH為61。

樣品處理過程中，比較剪心肌組織次數(shù)的不同（200，300，400，500，600次）對(duì)3種成分含量多少的影響，發(fā)現(xiàn)隨著剪切次數(shù)的增加，3種成分的含量逐漸增加，剪心肌500與600次3種成分的含量接近，故處理樣品時(shí)剪切次數(shù)為500；使用超聲勻漿破碎儀將剪碎的心肌組織制成勻漿液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與不使用勻漿破碎儀的相同樣品比較，ATP含量減少，AMP含量增加，提示ATP發(fā)生分解，故不使用超聲破碎勻漿的方法；用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)樣品的pH，比較不同的pH（40，60，83）對(duì)樣品出峰的影響，結(jié)果表明：3種不同pH樣品的出峰時(shí)間與峰面積相似，pH越小，分離度越好，但溶液pH過低會(huì)對(duì)色譜柱造成一定的損害。故最后選用與流動(dòng)相接近的pH 60。

肺心病是由支氣管肺組織或肺動(dòng)脈血管病變，肺血管阻力增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，肺動(dòng)脈高壓，使右心室負(fù)荷增加，長期慢性缺氧，呼吸系統(tǒng)反復(fù)感染，細(xì)菌毒素的作用，逐漸導(dǎo)致右心功能不全，繼而發(fā)展成全心功能衰竭[1314]。心肌能量代謝障礙是肺心病的主要癥狀之一，目前主要通過西藥的支氣管擴(kuò)張劑、抗生素、呼吸興奮劑和抗心力衰竭的藥物聯(lián)合應(yīng)用為主要的緩解辦法，但不能從根本上治療該疾病且具有一定的副作用[15]。芪參益氣滴丸主要由黃芪、丹參、三七、降香4味中藥組成[3]。臨床上主要用于冠心病、心力衰竭、肺心病[16]、擴(kuò)張性心臟病、慢性乙型肝炎、特發(fā)性肺纖維化、化療引起心臟病并發(fā)癥和糖尿病微血管病發(fā)癥等[4]。本研究結(jié)果顯示，通過野百合堿復(fù)制的大鼠肺心病模型，其心肌組織中ATP含量和EC下降，AMP含量升高，提示肺心病大鼠心肌能量代謝障礙；給予芪參益氣滴丸治療可以顯著增加心肌組織ATP含量和EC，降低AMP含量，提示QS可能改變腺苷酸含量，通過改善心肌能量代謝的途徑來治療肺心病。

肺心病是一種常見的的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重者病情發(fā)展至右心衰甚至全心衰，且目前的西醫(yī)臨床治療方法較難治愈。本研究表明心肌能量代謝的改善可能是QS治療肺心病的關(guān)鍵途徑之一，拓寬了QS的治療與臨床應(yīng)用范圍[1718]。同時(shí)本研究建立了一種高效液相色譜方法，可以快速、準(zhǔn)確測定大鼠心肌組織中ATP，ADP，AMP的含量，為生物樣品中能量代謝相關(guān)含量的測定研究提供了參考。

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[收稿日期]20160815

[基金項(xiàng)目]國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2015ZX09501004001002）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（201507003）；北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展專項(xiàng)（JJ201453）