吳超+朱衛(wèi)豐+嵇琴+周瑩+章明+黃鑫+彭淑紅

[摘要] 探討女貞子對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）活性的影響及可能的DNA甲基化機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用女貞子的水提物按2.0 g·kg^-1和6.0 g·kg^-1灌胃大鼠30 d，處死大鼠后，取肝臟測(cè)定COX活性、COX的亞基之一COX4I1蛋白濃度、測(cè)定Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因mRNA表達(dá)水平、TET1和DNMT3A的蛋白水平以及檢測(cè)Cox4i1DNA甲基化頻率。結(jié)果顯示女貞子低劑量和高劑量能顯著性升高COX的活性和COX4I1的濃度（P<0.05）；有降低TET1蛋白和DNMT3A的蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)；但未顯著改變Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因mRNA表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，女貞子高劑量組甲基化頻率有降低的趨勢(shì)但未達(dá)到顯著水平。該研究表明：女貞子對(duì)大鼠肝臟的COX酶活性有促進(jìn)作用，其可能通過(guò)促進(jìn)COX4I1的蛋白量增加實(shí)現(xiàn)；女貞子對(duì)DNMT3A的蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，其可能是Cox4i1DNA甲基化頻率有降低趨勢(shì)的原因。女貞子對(duì)于DNMT3A和TET1的蛋白表達(dá)可能有同向調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制仍不明確。

[關(guān)鍵詞] 女貞子； 能量代謝； COX4； COX4I1； DNMT3A； TET1

[Abstract] The study aims to investigate the effect of Ligustri Lucidi Fructus on cytochrome c oxidase（COX） activity in rat hepatic tissues and explore its possible mechanism of DNA methylation. Male SD rats received aqueous extract of Ligustri Lucidi Fructus （2.0，6.0 g·kg^-1） by intragastric administration for 30 d. After the rats were sacrificed， hepatic tissues of rats were taken to detect COX activity， protein concentration of COX4I1， TET1 and DNMT3A protein levels， mRNA expression levels of Cox4i1， Dnmt3a and Tet1， and determine the DNA methylation frequency of Cox4i1.Results showed that both low and high doses of Ligustri Lucidi Fructus could significantly increase COX activity and concentration of COX4I1（P<0.05）， with a decreasing tendency of both TET1 protein and DNMT3a protein expression； however， mRNA expression levels of Cox4i1， Dnmt3a and Tet1 were not significantly changed by Ligustri Lucidi Fructus. In addition， DNA methylation frequency of Cox4i1 in high dose group showed a declining tendency as compared with the blank control group， but without significant difference.These results indicated that Ligustri Lucidi Fructus had promotive effect on hepatic COX activity in rats， which may be achieved by increasing protein content of COX4I1. Moreover， a decreased tendency of DNMT3A protein could be one of the reasons for the lower trend of Cox4i1 methylation rate. In addition， Ligustri Lucidi Fructus may regulate the expression levels of DNMT3A and TET1 in the same direction and its mechanism is not clear.

[Key words] Ligustri Lucidi Fructus； energy metabolism； COX4； COX4I1； DNMT3A； TET1

女貞子為木犀科植物女貞Ligustum lucidum的干燥成熟果實(shí)，其性涼，《本草綱目》記載其具有養(yǎng)陰氣，平肝火的作用。很多研究結(jié)果都表明寒涼藥有抑制能量代謝的作用[1-3]。線粒體氧化磷酸化是機(jī)體能量ATP生成的主要方式之一，而細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）是線粒體呼吸鏈的末端組分，也是氧化磷酸化的重要組成部分。DNA甲基化是新興學(xué)科——表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，是目前研究最為深入的一種表觀遺傳修飾機(jī)制，也是調(diào)控基因表達(dá)的一種重要的修飾方式。本文首先探討了女貞子對(duì)大鼠肝臟COX的活性以及其重要調(diào)節(jié)亞基COX4I1蛋白量的影響，然后從DNA甲基化角度探索女貞子對(duì)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的影響，并研究了COX調(diào)節(jié)亞基基因Cox4i1的DNA甲基化水平以及mRNA水平，以期從DNA甲基化水平探討女貞子干預(yù)COX酶活性的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物及試劑

女貞子購(gòu)自江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)品批號(hào)1307007，產(chǎn)于江西，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定。細(xì)胞色素c氧化酶活性測(cè)定試劑盒（GENMED，批號(hào)11-42413-12）；細(xì)胞色素c氧化酶4亞基1檢測(cè)試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，批號(hào)L20141023573）；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20130926）；RNA保護(hù)液（天根生化科技有限公司，批號(hào)M1705）；RNA提取試劑盒（Promega公司，批號(hào)20130601）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，批號(hào)000096365）；熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，批號(hào)AK2901）；DNA提取試劑盒（Promega公司，批號(hào)0000105207）；DNA甲基化試劑盒（Epigenetics公司，批號(hào)ZRC176927）；GoTaq酶（Promega公司，批號(hào)000076225）；EastePTM凝膠及PCR回收試劑盒（批號(hào)20140201）；Peasy-T3 cloning Kit（全式金公司，批號(hào)I30807）；TET1（Y14）一抗（Santa Cruz Biotechnolog.Inc，批號(hào)SC-163446），二抗兔抗山羊（中杉金橋，批號(hào)2B-2306）；DNMT3A（H-295）一抗（Santa Cruz Biotechnolog.Inc，批號(hào)SC-20703），二抗山羊抗兔（中杉金橋，批號(hào)2B-2301）；β-actin（中杉金橋，批號(hào)：一抗TA-09，二抗2B-2305）。所用引物通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件oligo6自行設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1，均由上海生工合成。

藥物制備：藥物水提液由本實(shí)驗(yàn)室制備。取女貞子藥材1.2 kg加入10倍量雙蒸水，浸泡60 min，置于煎藥壺中煎藥，于沸騰后煎60 min，用紗布趁熱濾出藥液，殘?jiān)偌尤?倍量雙蒸水，于沸騰后煎煮60 min。合并2次藥液，濃縮后制成含生藥量2.9 kg·L^-1（用藥前稀釋），-20 ℃放置備用。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，200～250 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。

1.3 儀器

SpectraMaxPlus384全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀；Tissuelyser-24全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信科技）；SIGMA3-18K高速低溫離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；熒光定量PCR儀（ABI stepone plus）；梯度PCR儀（ABI Veriti）；HH-600電熱恒溫水浴鍋（金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠）；微量移液器（Eppendorf）；ChemiDoc XRS⁺化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）；SUB02水平電泳儀（北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；渦旋混勻器（IKA VORTEX2）；JD1000-3千分之一電子秤（沈陽(yáng)龍騰）；IMS-70制冰機(jī)（常熟雪科）；G154TW型高壓滅菌器（美國(guó)致微儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

大鼠30只，按體重隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組、女貞子低劑量組、女貞子高劑量組，每組10只。各組動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d之后開(kāi)始灌胃給藥，灌胃容積為10 mL·kg^-1，每天1次，共給藥30 d。每天給藥劑量：女貞子低劑量生藥2 g·kg^-1，女貞子高劑量生藥6 g·kg^-1，空白對(duì)照組給予等容量的蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)取材

于實(shí)驗(yàn)第30天，末次灌胃后禁食不禁水12 h，將大鼠麻醉，取出肝臟后迅速按照順序分成若干份，將提RNA的組織裝入RNA保護(hù)液中，其余肝臟組織分別用錫箔紙包好，迅速放入液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠肝臟COX4I1濃度測(cè)定

準(zhǔn)確稱量一定量肝臟組織（約0.2 g），按質(zhì)量體積比加9倍生理鹽水，制成10%的勻漿，2 000 r·min^-1離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行肝臟COX4I1濃度的測(cè)定。

2.4 大鼠肝臟COX活性測(cè)定

準(zhǔn)確稱量一定量肝臟組織（約0.2 g），按質(zhì)量體積比加9倍生理鹽水，制成10%的勻漿，2 000 r·min^-1離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行肝臟COX活性的測(cè)定，組織蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

2.5 SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因的表達(dá)

2.5.1 mRNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取肝臟組織30～100 mg，按照Promega RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的純度和濃度。所提取的RNA于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成。

2.5.2 Cox4i1，Dnmt3a，Tet1和β-actin擴(kuò)增效率的檢測(cè)和基因表達(dá)量檢測(cè) 參照Kenneth[4] 的方法及文獻(xiàn)[2]。

2.6 Western blot檢測(cè)DNMT3A和TET1蛋白表達(dá)的影響

2.6.1 提取和測(cè)定蛋白濃度 常規(guī)方法提取肝臟和骨骼肌組織總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。

2.6.2 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜 5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜數(shù)次。分別加入一抗，放置于4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天，洗膜后加入1∶1萬(wàn)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（中杉金橋），室溫孵育1 h，洗膜數(shù)次。將膜放入顯色液中（TECAN），室溫下孵育1 min。放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影。β-actin一抗是1∶2 000，二抗是抗鼠1∶1萬(wàn)，DNMT3A一抗是1∶1 000，二抗是抗兔1∶2萬(wàn)，TET1一抗是1∶100，二抗是抗山羊1∶3萬(wàn)。

2.6.3 分析 顯色后用Quantity one分析軟件分析條帶灰度，以目的基因的條帶灰度與內(nèi)參β-actin的灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

2.7 重亞硫酸鹽法檢測(cè)基因Cox4i1 DNA甲基化頻率

2.7.1 DNA提取及重亞硫酸鹽處理和純化回收 取10～20 mg肝臟組織按Promega DNA提取試劑盒提取DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定DNA的純度和濃度。提取后的DNA按照Epigenetics甲基化試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟得到甲基化DNA產(chǎn)物。

2.7.2 擴(kuò)增和純化回收 第一次PCR體系25 μL，甲基化DNA模板1.5 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水9 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 10 min，變性每次循環(huán)94 ℃ 1 min，退火60 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，后延伸72 ℃ 10 min。第2次PCR體系25 μL，第1次PCR的DNA產(chǎn)物2 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1N下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水8.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性每次循環(huán)94 ℃ 1 min，65 ℃ 30 s每次循環(huán)降1 ℃及延伸72 ℃ 30 s，共10個(gè)循環(huán)。再變性每次循環(huán)94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共19個(gè)循環(huán)，后延伸72 ℃ 10 min，之后得到擴(kuò)增后甲基化DNA產(chǎn)物，之后按照Transgen DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟切膠回收。

2.7.3 藍(lán)白斑篩選和大腸桿菌質(zhì)粒提取 將連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細(xì)胞中于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色菌落挑到加了氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。之后按試劑盒說(shuō)明提取大腸桿菌質(zhì)粒。

2.7.4 質(zhì)粒測(cè)序 質(zhì)粒送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。資料經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用±s表示。藥物組與對(duì)照組間的差異比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)法。

3 結(jié)果

3.1 女貞子對(duì)大鼠肝臟COX活性的影響

與對(duì)照組相比，女貞子低劑量和高劑量組的COX的活性均有升高趨勢(shì)，其中低劑量女貞子組的COX活性顯著增加（P<0.05），見(jiàn)圖1。

3.2 女貞子對(duì)大鼠肝臟COX4I1濃度的影響

與對(duì)照組相比，女貞子低劑量和高劑量組的COX4I1的濃度均有所升高，并達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見(jiàn)圖2。

3.3 女貞子對(duì)Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因表達(dá)量的影響

低劑量和高劑量女貞子對(duì)大鼠肝臟Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因表達(dá)量與對(duì)照組相比，差異不明顯，見(jiàn)圖3。

3.4 女貞子對(duì)DNMT3A和TET1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，女貞子低劑量和高劑量組的DNMT3A的蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，TET1的蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖4，表2。

3.5 女貞子對(duì)cox4i1基因DNA甲基化頻率的影響

與對(duì)照組比較，高劑量女貞子組甲基化水平有所下降，見(jiàn)圖5（P=0.089）。

4 討論

線粒體是機(jī)體能量代謝的主要部位，是能量ATP的生成、利用及產(chǎn)熱作用發(fā)揮的主要場(chǎng)所。線粒體通過(guò)2條主要的呼吸鏈進(jìn)行氧化磷酸化而產(chǎn)生ATP，為機(jī)體提供能量。細(xì)胞色素c氧化酶（COX），也稱復(fù)合體IV，它是線粒體2條呼吸鏈的共有末端組分，催化了電子從細(xì)胞色素c到氧原子的傳遞，該反應(yīng)與質(zhì)子從線粒體機(jī)制泵入膜間隙偶聯(lián)，因此電子的傳遞有助于能量?jī)?chǔ)存于化學(xué)梯度中。它是線粒體氧化磷酸化的限速酶，在整個(gè)能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。而COX4是細(xì)胞色素最大的核編碼亞基。該亞基與其他一些核編碼亞基（除了Va，Vb和

VIb）位于COX酶的跨膜螺旋區(qū)。哺乳動(dòng)物COX4包括COX4I1和COX4I2。本研究發(fā)現(xiàn)女貞子低劑量灌胃30 d之后能顯著提高正常大鼠肝臟COX4I1的濃度和COX活性，然而編碼該蛋白的Cox4i1的mRNA水平并沒(méi)有顯著變化。一般認(rèn)為如果COX活性升高，則電子傳遞鏈將會(huì)受到干擾，會(huì)引起ATP合成上升，造成產(chǎn)熱增加，似乎違背女貞子寒涼藥抑制能量代謝。但是考慮到給藥是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，恒溫動(dòng)物必定有一個(gè)自我調(diào)節(jié)的過(guò)程，可能COX4I1蛋白量的增加就是為機(jī)體產(chǎn)生更多的熱能以維持體溫的相對(duì)恒定。Cox4i1的mRNA水平并未受到女貞子的影響，這說(shuō)明女貞子可能對(duì)COX4I1蛋白的合成過(guò)程有一定的影響，而對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄水平影響不顯著。另外，也可能是給藥過(guò)程偏長(zhǎng)，在給藥早期Cox4i1的mRNA水平有顯著增加，從而使其蛋白水平增加，由于蛋白的半衰期要比mRNA長(zhǎng)，所以在最后mRNA并未顯示顯著性變化，而蛋白有顯著性改變。因此在以后的試驗(yàn)中采取多時(shí)間點(diǎn)取材檢測(cè)，觀察藥物的時(shí)效性，可能更好反映中藥的藥效同時(shí)有益于研究藥物的作用機(jī)制。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要方式，是一種可逆的基因修飾，對(duì)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[5-6]。已報(bào)道與能量代謝有關(guān)的一些基因受到了DNA甲基化的調(diào)控。這些基因有：脂肪酸合成酶基因、NADH脫氫酶（泛醌）1β亞復(fù)合物6[NADH dehydrogenase （ubiquinone）1beta-subcomplex 6，NDUFB6]基因，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物α亞基2（pyruvate dehydrogenase complex alpha subunit 2，PDHA2）基因，COX7A1基因，肝臟X受體α（liver X-receptor alpha）基因，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1alpha，PGC-1α）基因，leptin基因等[7-10]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四季三黃膠囊（主要由黃芩、黃柏、梔子、大黃等成分組成）可能通過(guò)提高動(dòng)脈粥樣硬化（As）小鼠血清DNA甲基化水平和DNMTs水平，從而達(dá)降低血清甘油三酯（TG）水平，穩(wěn)定As斑塊的作用[11]。通常情況，基因組的高甲基化導(dǎo)致基因的沉默，而低甲基化促進(jìn)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中女貞子高劑量組與對(duì)照組相比Cox4i1基因甲基化水平有所下降，但是未達(dá)到顯著水平（P=0.089），這可能與統(tǒng)計(jì)樣本偏少有關(guān)（由于經(jīng)費(fèi)限制，每組只選3個(gè)樣本用于BSP克隆測(cè)序）。另外該基因的mRNA水平也未出現(xiàn)顯著性改變，這說(shuō)明對(duì)于Cox4i1基因甲基化水平的改變還不足于影響到其表達(dá)量的變化。盡管女貞子對(duì)DNA甲基化酶基因Dnmt3a和去甲基化酶基因Tet1的mRNA水平并沒(méi)有顯著影響，但是DNMT3A蛋白和TET1蛋白表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，這說(shuō)明女貞子可能對(duì)Dnmt3a和Tet1基因的翻譯水平有一定的調(diào)控作用，也同時(shí)表明女貞子可能通過(guò)某種機(jī)制同向調(diào)控了這2種蛋白的表達(dá)；而女貞子給藥組是Cox4i1基因甲基化水平有所下降，提示有下調(diào)趨勢(shì)的甲基化轉(zhuǎn)移酶可能對(duì)于Cox4i1基因的甲基化頻率有一定的降低作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究表明女貞子給藥30 d對(duì)正常大鼠肝臟的COX酶活性有促進(jìn)作用，其可能通過(guò)促進(jìn)COX4I1的蛋白量升高實(shí)現(xiàn)；而該蛋白量的增加可能不是通過(guò)調(diào)控Cox4i1的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)；同時(shí)，有降低趨勢(shì)的甲基化酶可能對(duì)于Cox4i1甲基化頻率有一定的作用；然而，實(shí)驗(yàn)也顯示女貞子對(duì)大鼠肝臟DNA甲基化酶DNMT3A的蛋白量和去甲基化酶TET1蛋白都有降低趨勢(shì)，這說(shuō)明女貞子對(duì)于這2種蛋白有同向調(diào)控的作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步明確。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]