陳 楓，楊慈榮，張 圳，陳 飛，劉 霞

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系臨床藥學(xué)教研室, 上海 200433；2.92730 部隊(duì)92 分隊(duì)，海南 三亞 572000）

0 前言

肥胖是一種慢性代謝性疾病，是指由于能量攝入超過消耗，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過多或分布異常而造成體重增加的一種疾病。肥胖會提高 2 型糖尿病、高血壓、血脂異常、心血管疾病和某些癌癥的發(fā)病率[1-3]，降低生活質(zhì)量并增加死亡風(fēng)險。減肥手術(shù)是最有效的減肥方法[4]，但手術(shù)有潛在的風(fēng)險和限制，且無法滿足全球范圍內(nèi)患者的醫(yī)療需求。改善飲食結(jié)構(gòu)、生活方式以及增加身體活動等短期行為干預(yù)也不足以達(dá)成長期減肥的目的[5]。因此，藥物治療是中、重度肥胖患者以及有并發(fā)癥的輕度肥胖患者的首要治療選擇[6]。

多年來，減肥藥物有著坎坷曲折的研發(fā)歷程，獲批數(shù)量有限且許多已經(jīng)上市的藥物最終因心血管問題等不良反應(yīng)而撤市，如鹽酸氯卡色林（5-羥色胺2C 受體激動劑）、西布曲明（抑制去甲腎上腺素和5-羥色胺再攝取）等。因此，全球各大藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)對減肥藥物的批準(zhǔn)一直非常嚴(yán)格。目前，全球共有8 種上市的減肥藥物，包括賽利司他（脂肪酶抑制劑）、奧利司他（脂肪酶抑制劑）、復(fù)方芬特明-托吡酯（腎上腺素受體激動劑與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體拮抗劑）、復(fù)方納曲酮-安非他酮（腎上腺素吸收抑制劑與多巴胺攝取抑制劑）、二甲雙胍（單磷酸腺苷活化蛋白激酶激動劑）、芐非他明（腎上腺素受體激動劑）以及最新批準(zhǔn)的利拉魯肽和司美格魯肽（GLP-1 受體激動劑）。然而，這些上市減肥藥物的耐受性和安全性也受到挑戰(zhàn)，如奧利司他會導(dǎo)致嚴(yán)重的脂肪瀉；利拉魯肽價格昂貴，存在惡心等胃腸道反應(yīng)，不易推廣。匱乏的減肥藥物市場亟需基于新靶點(diǎn)的全新減肥藥物以應(yīng)對肥胖日益嚴(yán)峻的發(fā)病形勢。

ORM（Orosomucoid），也稱為α1 酸性糖蛋白（AGP），是肝臟急性期反應(yīng)蛋白[7]。ORM 在人體中有2 種亞型（ORM1 和ORM2），小鼠中有3 個亞型（ORM1、ORM2 和ORM3），大鼠中僅有1 種型。在人和小鼠體內(nèi)，ORM1 的組成水平遠(yuǎn)高于ORM2（5 倍），并且只有ORM1 可以被急性期刺激誘導(dǎo)。ORM 具有轉(zhuǎn)運(yùn)藥物、調(diào)節(jié)免疫、維持毛細(xì)血管屏障等功能[8]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，ORM 具有能量代謝的調(diào)節(jié)作用，循環(huán)中的ORM 可以作用于下丘腦的瘦素受體，激活JAK2-STAT3 通路，抑制攝食、降低體重、改善胰島素抵抗[9]。本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步以O(shè)RM為靶點(diǎn)，篩選到了一個靶向上調(diào)內(nèi)源性O(shè)RM 的全新小分子化合物HMS-01，在瘦素缺陷的ob/ob 肥胖小鼠和高脂喂食的肥胖小鼠上，均展示了良好的減肥效果，在國家重大新藥創(chuàng)制資助下，已經(jīng)進(jìn)入到臨床前研究階段。這些研究均提示，ORM 是一個治療肥胖的全新潛在靶點(diǎn)[9], 靶向上調(diào)內(nèi)源性O(shè)RM 的小分子有可能發(fā)展為新型減肥藥物。

然而，新的減肥藥物研發(fā)面臨高投入、低回報的困境，傳統(tǒng)新藥研發(fā)需要消耗10～15 年的時間，以及約25 億美元的投入，而達(dá)到Ⅲ期臨床試驗(yàn)最后階段的藥物中有 50% 最終無法被批準(zhǔn)上市[10]，每一次失敗都會消耗大量的時間與資源。藥物重定位是一種藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的策略，旨在重新評估已經(jīng)開發(fā)或研究的藥物，以尋找其在新的疾病領(lǐng)域或治療應(yīng)用中的潛在價值。該策略的目的是最大化已有藥物的利用，降低新藥開發(fā)的時間和成本。本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有ORM1 啟動子上游2 000 個堿基對序列的熒光素酶報告基因，由于ORM 主要由肝臟合成，通過血液分泌至全身發(fā)揮作用，于是選用AML12 小鼠正常肝細(xì)胞構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)LV-ORM1 啟動子-LUC-PURO 的細(xì)胞株，從而建立了一個以O(shè)RM 為靶點(diǎn)的藥物篩選平臺和評價體系，用于高通量篩選上市藥物庫中靶向ORM 的藥物，為藥物重定位發(fā)現(xiàn)潛在減肥藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及載體

AML12 小鼠正常肝細(xì)胞、HEK-293T 上皮細(xì)胞、載體pGL4.20[luc2/Puro] 與pHBLV-CMV-MCSEF1-puro、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G 和psPAX2均為實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（天根生化科技有限公司）；ORM1 啟動子基因序列來自NCBI 數(shù)據(jù)庫（NC_000070.7）。

1.2 主要儀器

Veriti? 96 孔快速熱循環(huán)儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；移液器、低溫高速臺式離心機(jī)（EPPENDORF 公司，德國）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀、多功能水平電泳槽（上海天能科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器總公司）；全波長多功能酶標(biāo)儀（BMG，德國）。

1.3 主要試劑

PCR 引物和基因合成（生工生物工程股份有限公司）；RNA 提取試劑盒RNAeasy?動物RNA 抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶KpnI、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、限制性內(nèi)切酶AgeI、限制性內(nèi)切酶ApaI、限制性內(nèi)切酶ClaI、限制性內(nèi)切酶BamHI、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3 000試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；高保真聚合酶phanta Max-Super-Fidlity DNA polymerase（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；PCR 試劑盒2X Pro Taq 預(yù)混液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型 qPCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；瓊脂糖凝膠 DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）；HB-infusionTM無縫克隆試劑盒（漢恒生物科技有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑polybrene（Sigma，美國）；Firefly-Glo 螢光素酶報告基因檢測試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；FDA 上市藥物庫（陶術(shù)生物科技有限公司）；測序由賽業(yè)生物科技有限公司完成。

1.4 基因組RNA 提取

提取小鼠新鮮的肝組織，使用RNAeasy?動物RNA 抽提試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用作PCR 模板，保存于-20 ℃冰箱。

1.5 ORM1 啟動子目的基因的獲得和擴(kuò)增

根據(jù)同源重組引物設(shè)計(jì)原則和參考小鼠ORM1（NC_000070.7）基因組序列設(shè)計(jì)引物（選取起始位點(diǎn)上游2 000 個堿基對），采用同源重組法設(shè)計(jì)引物，上游引物加入KpnI 酶切位點(diǎn)，下游引物加入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，引物序列見表1。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的基因。

表1 ORM1 啟動子基因引物序列

1.6 報告基因質(zhì)粒pGL4.20-ORM1 啟動子的構(gòu)建及擴(kuò)增

將PCR 產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pGL4.20 [luc2 Puro]（插入位點(diǎn)選擇AgeI 與ApaI）于37 ℃雙酶切5 h，用同源重組酶將目的片段與載體質(zhì)粒連接。使用DH5α 感受態(tài)細(xì)胞將重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，接種于含有嘌呤霉素抗性的固體平板，用涂布器將重組質(zhì)粒涂抹均勻，倒置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～16 h。將篩選出來的陽性克隆進(jìn)行測序，隨后進(jìn)行菌液擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提純化。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度檢測和A260/280 檢測，把質(zhì)粒保存于-20 ℃冰箱。構(gòu)建成功的重組載體命名為 pGL4.20-ORM1 啟動子。根據(jù)Lipofectamine 3 000 試劑盒說明書，分別將pGL4.20-ORM1 啟動子和pGL4.20 轉(zhuǎn)染至AML12小鼠正常肝細(xì)胞中，使用地塞米松（DXMS）來驗(yàn)證報告基因的有效性和可行性。

1.7 慢病毒表達(dá)載體LV-ORM1 啟動子-LUC-PURO的構(gòu)建及擴(kuò)增

以pGL4.20-ORM1 啟動子重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的基因。

表2 LV-ORM1 啟動子-LUC-PURO 基因引物序列

將PCR 產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pHBLV-CMV-MCSEF1-PURO（插入位點(diǎn)選擇ClaI 與BamHI）于37 ℃雙酶切5 h，用同源重組酶將目的片段與載體質(zhì)粒連接。使用DH5α 感受態(tài)細(xì)胞將重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，接種于含有嘌呤霉素抗性的固體平板，用涂布器將重組質(zhì)粒涂抹均勻，倒置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～16 h。將篩選出來的陽性克隆，送賽業(yè)生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序成功之后，進(jìn)行菌液擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提純化。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度檢測和A260/280 檢測，把質(zhì)粒保存于-20 ℃冰箱。構(gòu)建成功的重組載體命名為LV-ORM1 啟動子-LUCPURO。同樣方法構(gòu)建LV-LUC-PURO 作為對照載體。

1.8 慢病毒包裝及濃縮純化及滴度檢測

1.8.1 包裝

提前傳代HEK-293T 細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，將慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G 10 μg、psPAX2 5 μg和LV-ORM1 啟動子-LUC-PURO 10 μg 以及轉(zhuǎn)染試劑75 μl 混勻后靜置，在室溫下溫育15 min 后緩慢滴加至293T 細(xì)胞中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后16 h 更換含10 % 胎牛血清 FBS的新鮮完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后 48 h 和72 h，分別收集兩次病毒上清液（48 h 收集后置換新鮮完全培養(yǎng)基），將兩次收集的上清液混合，進(jìn)行離心濃縮和病毒管分裝，-80°C 冰箱保存。

1.8.2 病毒滴度檢測

將生長狀態(tài)良好的HEK-293T 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至 1×105個/ml, 加入96 孔板，100 μl/孔，為每個病毒準(zhǔn)備6 個孔。放入37°C 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將病毒進(jìn)行3 倍梯度稀釋，共6 個稀釋度，接種于293T 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。在觀察結(jié)果前6 h 需更換新鮮10% FBS 完全培養(yǎng)基，從孔中吸出80 μl 培養(yǎng)基，然后加入80 μl 新鮮10 % FBS 完全培養(yǎng)基，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h 后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，熒光或活細(xì)胞百分比在10%～50% 的孔計(jì)算病毒滴度。目的病毒命名為LV-ORM1 啟動子-LUC-PURO。同樣方法，陰性對照病毒命名為LVLUC-PURO。

1.9 LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選及建立

將AML12 小鼠正常肝細(xì)胞在含有10% FBS、1% ITS（10 μg/ml 胰島素+5.5 μg/μl 轉(zhuǎn)鐵蛋白+5 ng/ml硒）、1% 雙抗以及40 ng/ml DXMS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。AML12 細(xì)胞在10 cm 培養(yǎng)皿中細(xì)胞長滿以后，用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞后稀釋成密度為1.5×105個/ml 的細(xì)胞懸液，接種于6 孔板，每孔2 ml，使得第2 天細(xì)胞的融合率在60% 左右，利于感染。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組LV-ORM1 啟動子-LUCPURO 和陰性對照組LV-LUC-PURO，為促進(jìn)病毒的感染效率，首先，感染時棄原有培養(yǎng)基，添加含5% FBS 的新鮮培養(yǎng)液2 ml，其次，添加助感染試劑polybrene，使其最終濃度為7 μg/ml。設(shè)置2 個（10/20）感染復(fù)數(shù)（MOI）組，感染24 h 后換新鮮完全培養(yǎng)基。在感染48 h 后，觀察慢病毒顆粒感染效率，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光比例以確定最佳感染效率，最終選定MOI=20 的分組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

待細(xì)胞融合率達(dá)60% 時，用嘌呤毒素（0.8 μg/ml）濃度處理48 h，然后換新鮮的嘌呤毒素培養(yǎng)基繼續(xù)處理，細(xì)胞密度超過80%時則進(jìn)行傳代處理，后續(xù)每隔2～3 d 更換含嘌呤毒素培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過反復(fù)挑取抗藥性細(xì)胞后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，命名為LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO。同樣方法，陰性對照細(xì)胞株命名為LV-AML12-LUCPURO。

1.10 qPCR 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中熒光素基因的表達(dá)水平

使用TRIzol 試劑提取組織總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT分析目的基因的相對表達(dá)量，引物序列見表3。

表3 qPCR 引物設(shè)計(jì)序列

1.11 熒光素酶報告分析

使用二甲基亞砜（DMSO）和DXMS 來驗(yàn)證LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO 作為藥物篩選工具的有效性和可行性。將LV-AML12-ORM1啟動子-LUC-PURO 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株培養(yǎng)于96 孔黑色側(cè)壁透明底板，用10 μmol/L DXMS 處理12 h，同時用0.1% DMSO 作為溶劑對照組。參照熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，加入80 μl 檢測溶液，細(xì)胞充分裂解后在酶標(biāo)儀中檢測熒光素發(fā)光值。

為了評估本高通量細(xì)胞篩選平臺的精確性和穩(wěn)定性，使用Z′因子作為度量標(biāo)準(zhǔn)，Z′因子是高通量篩選中常用來評估和驗(yàn)證的主要統(tǒng)計(jì)參數(shù)之一：

式中σDMSO和σDXMS分別為陰性對照組和陽性對照組的標(biāo)準(zhǔn)差，μDMSO和μDXMS分別為陰性對照組和陽性對照組的平均值。若0.5＜Z′≤1，則認(rèn)為此篩選模型具有良好的精確性與穩(wěn)定性。

1.12 藥物篩選

基于對美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物庫的篩選，選用陶術(shù)生物的FDA 上市藥物庫，篩選可靶向升高ORM 的藥物。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件 GraphPad Prism 9 進(jìn)行作圖和分析。兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 報告基因載體pGL4.20-ORM1 啟動子的鑒定及驗(yàn)證

測序結(jié)果表明ORM1 的啟動子基因插入正確，如圖1 所示，序列信息無誤。根據(jù)Lipofectamine 3 000 試劑盒說明書轉(zhuǎn)染AML12 細(xì)胞，使用熒光素酶報告基因試劑盒和酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值，如圖2 所示，熒光素成功導(dǎo)入報告基因pGL4.20-ORM1 啟動子中，并且可以被DXMS激活，證明該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性可用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建。

圖1 pGL4.20-ORM1 啟動子重組質(zhì)粒圖譜

圖2 報告基因載體pGL4.20 與pGL4.20-ORM1 啟動子熒光值檢測結(jié)果

2.2 qPCR 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中熒光素基因的表達(dá)水平

采用qPCR 分別對穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株LV-AML12-LUCPURO 與LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO進(jìn)行熒光素 mRNA 水平檢測，如圖3 所示，其中，熒光素基因在LV-AML12-ORM1 啟動子-LUCPURO 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中的相對表達(dá)量是對照組LVAML12-LUC-PURO 的104.06 倍。

圖3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株LV-AML12-LUC-PURO 與LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO 的熒光素 mRNA 表達(dá)情況

2.3 熒光素酶活力的測定

使用熒光素酶報告基因試劑盒和酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值，如圖4 所示。DXMS 的發(fā)光值是DMSO對照組的4.95 倍。通過計(jì)算數(shù)據(jù)得Z′=0.77，說明此篩選平臺可以作為一種高通量篩選的穩(wěn)定方法。

圖4 陰性對照組DMSO 與陽性對照組DXMS 熒光值檢測結(jié)果

2.4 藥物篩選結(jié)果

通過對陶術(shù)生物的FDA 上市藥物庫1 470 種化合物篩選，以30 μmol/L 的較高濃度初篩，將熒光值比率＞1.5 的135 種化合物作為初步命中的化合物，如圖5 所示。這135 種藥物中包含40 種糖皮質(zhì)激素類藥物，但由于長期服用糖皮質(zhì)激素易出現(xiàn)向心性肥胖，這與減肥的初衷相悖，所以將這些藥物排除。之后將剩余的95 種藥物進(jìn)行30、10、1 μmol/L 濃度的復(fù)篩，避免單一濃度篩選實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性。根據(jù)復(fù)篩結(jié)果，42 種化合物呈現(xiàn)出量效關(guān)系的趨勢，如圖6 所示，這些化合物的類別可分為抗腫瘤藥（圖6A）、抗生素（圖6B）、抗炎藥（圖6C）、抗病毒藥（圖6D）以及其他藥物（圖6E～G）。

圖5 初篩1 470 種化合物作用于LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的相對熒光值

圖6 復(fù)篩42 種化合物作用于LV-AML12-ORM1 啟動子-LUC-PURO 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的相對熒光值(μmol/L)

3 討論

本課題組基于藥物重定位的方法，通過構(gòu)建帶有ORM 啟動子的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株作為高通量篩選平臺，Z′因子的值為0.77，證明此細(xì)胞篩選平臺可作為一種高通量篩選的穩(wěn)定方法。經(jīng)過初篩和復(fù)篩后，篩選出42 種小分子藥物，這些藥物可能是潛在的以O(shè)RM 作為靶點(diǎn)并能發(fā)揮減肥作用的藥物。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院和上海中醫(yī)藥大學(xué)通過合作研究這種高通量化合物篩選發(fā)現(xiàn)的方式，成功發(fā)現(xiàn)舒尼替尼作為一種新的激活褐色脂肪組織（BAT）的小分子，是治療肥胖等相關(guān)代謝性疾病的潛在藥物[11]。

本課題組下一步將對這42 種小分子藥物進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，擬使用各個藥物臨床實(shí)驗(yàn)的安全范圍內(nèi)的劑量，在高脂飲食（HFD）小鼠模型中給藥，觀察藥物能否顯著抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，肝臟組織和血清中ORM 的含量是否被上調(diào)，以及在ORM 敲除的肥胖小鼠上觀察藥物的效應(yīng)是否消除，從而確定其ORM 靶點(diǎn)效應(yīng)。

綜上所述，本課題組為ORM 靶向藥物提供了一個快速細(xì)胞篩選平臺，并從FDA 上市藥物庫中篩選出了靶向上調(diào)ORM 的潛在治療肥胖的藥物，為下一步減肥作用的觀察奠定了基礎(chǔ)。對這些藥物及其潛在機(jī)制的研究可能會為減肥藥物的發(fā)現(xiàn)和脂肪功能的新調(diào)節(jié)途徑提供新的線索。