杜江源，張?zhí)m林，蔡同凱，曹永兵

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管病研究所, 上海 200082；2.上海市同濟醫(yī)院, 上海 200065；3.海軍軍醫(yī)大學(xué), 上海 200433）

針對非小細胞肺癌（NSCLC）的靶向藥EGFRTKIs，自第一代問世以來發(fā)展迅速，目前第四代已在臨床研發(fā)階段。但由于新的耐藥突變的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致其應(yīng)用受限。因此如何克服EGFR-TKIs耐藥問題和尋找可改善肺癌靶向治療耐藥的藥物已成當務(wù)之急。植物來源的單體成分種類繁多，應(yīng)用前景巨大。毒胡蘿卜（Thapsia garganicaL.，傘形科毒胡蘿卜屬）是于地中海西部沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種開花植物，一直被作為止痛劑應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。毒胡蘿卜素是從該植物中分離的單體化合物，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）的誘導(dǎo)劑，近年也被用于抗腫瘤和抗病毒研究。吉非替尼作為第一代EGFR-TKIs，副作用小，有效率高。本研究旨在探討毒胡蘿卜素和吉非替尼聯(lián)合用藥對人肺腺癌耐藥細胞株P(guān)C9/GR耐藥性的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

吉非替尼（純度99.94%，HY-50 895）、毒胡蘿卜素（純度99.95%，HY-13 433）、CCK8 試劑（HYK0301-500T）均購自美國MCE 公司；胎牛血清（F8318-500ML）和DMEM 培養(yǎng)基（D6429-500ML）購自美國Sigam Aldrich 公司；胰酶（25 200-072）購自美國Gibco 公司；凋亡試劑盒（559 763）購自美國BD 公司； ATF-6 抗體（#65880）、IRE1α 抗體（#3294）均購自美國CST 公司；羊抗兔二抗（AS003）購自abclonal；PVDF 膜購自Millipore；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。人肺腺癌細胞（PC9）由同濟醫(yī)院惠贈，PC9/GR 細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。

圖1 吉非替尼對PC9 和PC9/GR 細胞增殖率的影響

圖2 毒胡蘿卜素對PC9 和PC9/GR 細胞增殖的影響

圖3 不同濃度的毒胡蘿卜素聯(lián)合吉非替尼對PC9/GR 增殖的影響

1.2 方法

1.2.1 細胞株及細胞培養(yǎng)

PC9 細胞使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中含10%的胎牛血清、100 U/ml 的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。PC9/GR 細胞使用上述培養(yǎng)基維持培養(yǎng)并額外含800 ng/ml 的吉非替尼。

1.2.2 CCK8 法檢測細胞增殖

檢測細胞對吉非替尼的耐藥性：分別取對數(shù)生長期的PC9 和PC9/GR 細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為40 000/ml，接種于96 孔板，每孔100 μl細胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育過夜。吸棄96 孔板上清液，加入含藥培養(yǎng)基（PC9 細胞中吉非替尼濃度分別為0、1、5、10、20、40、80、250、500、1 000 nmol/L；PC9/GR 細胞中吉非替尼的濃度分別為0、1、10、100、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000、40 000 nmol/L），同時設(shè)對照組，每組設(shè)4 個復(fù)孔。72 h 時吸棄上清液，再加入含CCK8 的DMEM，0.5 h后用酶標儀檢測A450。

檢測毒胡蘿卜素對細胞增殖的影響：分別取對數(shù)生長期的PC9 和PC9/GR 細胞同上述處理鋪96 孔板，貼壁后加入濃度為0.1、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L 的毒胡蘿卜素，同時設(shè)對照組，每組設(shè)4 個復(fù)孔。72 h 時使用CCK8 法檢測A450。

檢測毒胡蘿卜素對PC9/GR 細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)：取PC9/GR 對數(shù)生長期的細胞同上述處理鋪96 孔板，設(shè)12 組，加入吉非替尼的濃度分別為0、4.5、4.5、4.5、4.5、4.5、0、9、9、9、9、9 μmol/L，毒胡蘿卜素的濃度分別為0、0、0.1、1、10、100、 0、0、0.1、1、10、100 nmol/L。72 h 時用CCK8 法檢測A450。

檢測毒胡蘿卜素對PC9/GR 細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)：取PC9/GR 對數(shù)生長期的細胞同上述處理鋪96 孔板，設(shè)兩組，為吉非替尼單藥組和聯(lián)合用藥組：其中單藥組設(shè)7 個小組，加入吉非替尼的濃度分別為0、1、10、102、103、104、105μmol/L；聯(lián)合用藥組設(shè)7 個小組，每小組加入10 nmol/L 的毒胡蘿卜素，同時加入濃度分別為0、1、10、102、103、104、105nmol/L 的吉非替尼。72 h 時用CCK8 法檢測A450。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（RF）=逆轉(zhuǎn)前的IC50值/逆轉(zhuǎn)后的IC50值。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的PC9/GR 鋪6 孔板，每孔3×105個細胞，孵育過夜，吸棄上清液，加入含藥培養(yǎng)基（對照組為9 μmol/L 的吉非替尼組，實驗組為9 μmol/L 的吉非替尼組+10 nmol/L 的毒胡蘿卜素聯(lián)合用藥組），孵育72 h 后，收集上清液及貼壁細胞，按說明書加入膜聯(lián)蛋白（Annexin V-PE），室溫孵育20 min 后，再加入7-AAD，5 min 后，收集細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 蛋白印跡法檢測PC9/GR 細胞ERS 相關(guān)蛋白IRE1α、ATF-6 的表達

取對數(shù)生長期的PC9/GR 鋪6 孔板，每孔3×105個細胞，孵育過夜，吸棄上清液，加入含藥培養(yǎng)基（每孔吉非替尼濃度依次為0、0、4.5、4.5、9、9 μmol/L，毒胡蘿卜素濃度依次為0、10、0、10、0、10 nmol/L），培養(yǎng)72 h，去上清液，收集細胞蛋白，BCA 法測量樣品中總蛋白濃度。蛋白變性后取蛋白樣品，使用蛋白印跡法檢測IRE1α、ATF-6蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性者采用單因素方差分析的單向分類方差分析（ANOVA），對取得的數(shù)據(jù)兩兩比較使用 LSD 檢驗。以P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吉非替尼對PC9 和PC9/GR 細胞株的IC50 值

吉非替尼對人肺腺癌細胞株P(guān)C9 和PC9/GR的IC50值經(jīng)計算分別為0.101 9 μmol/L（圖1A）和8.912 μmol/L（圖1B），按公式計算耐藥倍數(shù)為87.5（本課題中PC9 和PC9/GR 細胞株的IC50值分別以0.1 μmol/L 和9 μmol/L 進行實驗）。

2.2 CCK8 法檢測毒胡蘿卜素對細胞增殖的影響

毒胡蘿卜素對人肺腺癌細胞株P(guān)C9 和PC9/GR的增殖均有抑制作用，呈劑量依賴性。當毒胡蘿卜素濃度為10 nmol/L 時，對PC9 和PC9/GR 的抑制率分別為14.7%（圖2A）和4.11%（圖2B）。毒胡蘿卜素濃度為10 nmol/L 時對PC9 細胞的增殖顯示較弱的抑制作用，而對PCR/GR 細胞增殖的作用與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。抑制率（IR）＝（1-藥物組A值/對照組A值）×100%。本課題中，毒胡蘿卜素的工作濃度選擇10 nmol/L 或者圍繞10 nmol/L進行設(shè)計。

2.3 毒胡蘿卜素對PC9/GR 耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

相比于吉非替尼單獨用藥，毒胡蘿卜素（濃度依次為0、0.1、1、10、100 nmol/L）和吉非替尼（4.5 μmol/L或9 μmol/L）聯(lián)合用藥72 h 時，PC9/GR 的細胞增殖率在10 nmol/L 和100 nmol/L 時顯著下降，并且具有統(tǒng)計學(xué)差異性（圖3A、B）。

在不同濃度（0、1、10、102、103、104、105nmol/L）的吉非替尼聯(lián)合10 nmol/L 的毒胡蘿卜素作用后，PC9/GR 的細胞增殖率相比吉非替尼單獨用藥（吉非替尼組濃度依次為0、1、10、102、103、104、105nmol/L）也出現(xiàn)了下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。計算得出吉非替尼單獨用藥的IC50值為11.039 μmol/L，聯(lián)合用藥后其IC50值為3.584 μmol/L，其RF 為3.15。

圖4 不同濃度的吉非替尼與毒胡蘿卜素聯(lián)合用藥對PC9/GR 增殖的影響

2.4 藥物作用對PC9/GR 細胞凋亡的影響

與對照組（圖5A）、吉非替尼單獨作用（圖5B）、毒胡蘿卜素單獨作用（圖5）相比，聯(lián)合用藥（圖5）后PC9/GR 細胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均相應(yīng)增加，并且具有統(tǒng)計學(xué)差異（圖5）。說明毒胡蘿卜素在一定程度上可以改善PC9/GR 細胞的耐藥性。

圖5 吉非替尼、毒胡蘿卜素及兩者聯(lián)合用藥對PC9/GR 細胞凋亡的影響

2.5 Western blotting 法檢測藥物作用對細胞PCR/GR中ATF-6 和IRE1α 蛋白表達的影響

圖6 毒胡蘿卜素、吉非替尼及兩者聯(lián)合用藥對PC9/GR 細胞中ATF-6 和IRE1α 蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與吉非替尼組1 或2 相比，藥物作用后聯(lián)合用藥組1 或聯(lián)合用藥組2 中PC9/GR 細胞的ATF-6 及IRE1α 蛋白表達均上調(diào)（圖6A），并且有統(tǒng)計學(xué)差異（圖6B、C）。ATF-6 和IRE1α 均是ERS 的指標蛋白，說明PC9/GR 細胞在藥物聯(lián)合作用后發(fā)生了ERS。

3 討論

肺癌是當今世界最常見、致死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康[1]。NSCLC 是最常見的病理類型，約占所有比例的85%[2]。約70%的NSCLC 患者在確診時已處于晚期，失去了手術(shù)的機會。近年來，NSCLC 的分子靶向治療發(fā)展迅速，靶向藥EGFR-TKIs 不斷更新，成為放化療和免疫治療之外的重要治療手段之一。

截止目前，EGFR-TKIs 已從第1 代發(fā)展至第3 代[3]，且有多款第4 代靶向藥已進入臨床實驗階段。然而由于抗腫瘤耐藥性，患者使用靶向藥一定時間后不可避免的會出現(xiàn)耐藥[4]。于是尋找能夠克服腫瘤耐藥的藥物及方法已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域中亟待解決的問題。由于中草藥植物的毒副作用小且療效明確，故從中尋找能夠克服腫瘤耐藥的成分已經(jīng)成為一種趨勢。毒胡蘿卜素是從地中海菊屬植物中提取的單體成分[5]，作為常用的ERS 的誘導(dǎo)劑，毒胡蘿卜素在科研中有著廣泛的應(yīng)用[6]。也有文獻報道其有抗腫瘤活性[7]，同時對冠狀病毒、合胞病毒、甲型流感病毒等有較強的抑制作用[8]。本研究中使用的吉非替尼耐藥細胞株P(guān)C9/GR 經(jīng)CCK8 實驗證明其對吉非替尼具有耐藥性。實驗結(jié)果顯示，吉非替尼對PC9 的IC50值為0.101 9 μmol/L（圖1A），對PC9/GR 的IC50值為8.912 μmol/L（圖1B），耐藥倍數(shù)為87.6。當毒胡蘿卜素濃度為 10 nmol/L時，對PCR/GR 細胞增殖的作用與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，故該濃度的毒胡蘿卜素未顯示出對PCR/GR 的細胞增殖的抑制作用（圖2B），故本課題中毒胡蘿卜素選擇10 nmol/L 作為實驗濃度。而提高毒胡蘿卜素的濃度，其對PC9/GR 細胞抑制率也增加，表明毒胡蘿卜素本身對于肺腺癌細胞PC9/GR具有抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥中當毒胡蘿卜素濃度為大于或等于10 nmol/L 時，PCR/GR 細胞的增殖相比吉非替尼單獨用藥受到了更強的抑制，并具有顯著性差異（圖3A、B）。本課題同時使用不同濃度的吉非替尼聯(lián)合10 nmol/L 的毒胡蘿卜素共同作用于PC9/GR 細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有聯(lián)合用藥組相比于吉非替尼單獨用藥組，均對PC9/GR 細胞的生長產(chǎn)生抑制作用。分別計算吉非替尼單藥和聯(lián)合用藥對PC9/GR 細胞的IC50值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥的IC50值降低（圖4），逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.15。說明10 nmol/L 的毒胡蘿卜素可以有效改善PC9/GR 對吉非替尼的耐藥。

腫瘤細胞的耐藥性嚴重影響著患者的預(yù)后。耐藥突變、自噬、腫瘤免疫微環(huán)境都是腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的因素[9]。由于耐藥突變，EGFR-TKIs 治療已經(jīng)陷入了研究人員開發(fā)新藥物與腫瘤細胞產(chǎn)生新耐藥突變的循環(huán)之中。近年來，因自噬異常與腫瘤發(fā)生和進展、細胞死亡及抗腫瘤治療療效相聯(lián)系而受到廣泛關(guān)注[10]。但是抑制自噬只能延緩EGFRTKI 耐藥的產(chǎn)生，并不能有效解決耐藥的問題[11]。因此，耐藥問題亟待找到新的解決方法。體內(nèi)低氧、低糖等惡劣環(huán)境會導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生ERS，并啟動未折疊蛋白反應(yīng)從而讓細胞重新恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。ERS 過度可啟動細胞凋亡。因此，ERS 也與肺癌治療息息相關(guān)[12]。毒胡蘿卜素作為研究ERS 常用的激動劑，是一種特異性的肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP 酶抑制劑，能夠使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+量減少、未折疊蛋白增多，引起ERS[13]。本研究中通過細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，和單獨用藥相比，毒胡蘿卜素聯(lián)合吉非替尼聯(lián)合用藥可以進一步促進PC9/GR 細胞的凋亡（圖5B、D 和E）。通過蛋白印跡實驗證實，聯(lián)合用藥相比吉非替尼單獨用藥，PC9/GR 細胞中ATF-6（圖6A、B）和IRE1α 蛋白（圖6A、C）的表達均上調(diào)，表明聯(lián)合用藥后PC9/GR 細胞處于ERS 狀態(tài)。這是毒胡蘿卜素有效改善PC9/GR對吉非替尼耐藥的可能原因之一。

綜上所述，體外實驗證實毒胡蘿卜素低濃度下可以有效促進PC9/GR 的ERS，高濃度下對肺癌細胞具有直接殺傷作用，說明毒胡蘿卜素本身具有抗腫瘤活性，本課題同時證實，毒胡蘿卜素能增強吉非替尼對PC9/GR 的殺傷作用。其可能的機制是，在抗腫瘤藥物和ERS 狀態(tài)的雙重壓力下，肺腺癌耐藥細胞株P(guān)C9/GR 對靶向藥吉非替尼的敏感性增加。因此，毒胡蘿卜素有望成為解決非小細胞肺癌靶向治療耐藥的潛在藥物之一，但其中的機制仍需進一步的探索。