張鷹楠，侯 成，許子藝，盧光照，魯 瑩，張 翮

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室, 上海 200433；2.中國人民解放軍71282 部隊, 河北 保定 071000）

氟馬西尼（flumazenil）是苯二氮?類受體拮抗劑，臨床上常用來逆轉(zhuǎn)由苯二氮?類藥物麻醉或過量使用后所致的中樞鎮(zhèn)靜作用[1-4]，在軍事應(yīng)用方面，可用來拮抗鎮(zhèn)靜藥物帶來的“宿醉”等副作用，提高作業(yè)效能。目前，氟馬西尼市售劑型為注射劑，為解決注射給藥不便、疼痛不適的問題，提高使用者順應(yīng)性，開發(fā)一種便捷安全的制劑顯得尤為重要?；仡櫦韧芯?，氟馬西尼已被證明經(jīng)鼻腔[5,6]、舌下[7,8]、口服[9]及直腸[10]等給藥途徑均有治療效果。本研究開發(fā)氟馬西尼舌下片，實現(xiàn)軍事條件下作業(yè)人員高效、安全促醒。

氟馬西尼因難溶于水，直接制備成舌下片會影響其被舌下黏膜吸收及藥效發(fā)揮。本研究以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料，將氟馬西尼制備成包合物后再制備舌下片，以此改善氟馬西尼的溶解度及溶出度。此外，還研究了氟馬西尼舌下片在比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)過程，并進行生物利用度評價，以期為進一步臨床研發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器、試藥及實驗動物

1.1 主要儀器

藥物透皮擴散試驗儀（TPY-2，上海黃海藥檢儀器有限公司）；質(zhì)譜儀（QTRAP?5500，日本島津公司）；TDP 單沖壓片機（ZPS016，上海天祥·健臺制藥機械有限公司）；雙向磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R206D，上海申生科技有限公司）；真空干燥箱（VD53，德國Binder 公司）；高效液相色譜儀（UltiMate 3000，美國Thermo 公司）；色譜柱（SB-C18，美國Agilent 公司）；色譜柱（XSelect?HSS T3，美國Waters 公司）。

1.2 藥品與試劑

氟馬西尼注射液（5 ml:0.5 mg，宜昌人福藥業(yè)）；氟馬西尼原料藥（99%，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；內(nèi)標物甲苯磺丁脲（純度99%，美國Sigma 公司）；羥丙基-β-環(huán)糊精（法國Roquette 公司）；PVPK30（重慶斯泰克瑞登梅爾公司）；乳糖（荷蘭DFE 公司）；甘露醇（法國Roquette 公司）；硬脂富馬酸鈉（德國JRS 公司）；乙腈、乙酸銨均為質(zhì)譜純；實驗用水為去離子水。

1.3 實驗動物

比格犬12 只，雄性，體重7～9 kg，由北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 氟馬西尼舌下片的制備

2.1.1 氟馬西尼包合物（F-羥丙基-β-環(huán)糊精）的制備

以摩爾比2∶1 稱取適量羥丙基-β-環(huán)糊精與氟馬西尼，加入90%乙醇溶液，超聲使其溶解。將混合溶液置于45 ℃連續(xù)攪拌2 h。取混合溶液進行旋蒸，在40 ℃進行干燥，得到白色固體狀包合物。

2.1.2 氟馬西尼含量測定方法

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：水（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0）-甲醇-四氫呋喃（80∶13∶7）；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；檢測波長:230 nm；進樣量：20 μl。

（2）溶液配制?？瞻兹芤海壕芊Q取羥丙基-β-環(huán)糊精適量于容量瓶中，加入適量流動相，振搖使其溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得空白溶液。

對照品溶液：精密稱取氟馬西尼10 mg，置于100 ml 容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解后定容，制得質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml 的氟馬西尼溶液。

供試品溶液：精密稱取F-羥丙基-β-環(huán)糊精適量于容量瓶中，加入適量流動相，振搖使其溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

（3）專屬性。分別取制備的空白溶液、對照品溶液、供試品溶液各20 μl，參照“色譜條件”項下進樣，進行樣品專屬性考察（圖1）。A 為羥丙基-β-環(huán)糊精的HPLC 圖譜，無特征吸收峰；B 為氟馬西尼的HPLC 圖譜，有吸收峰，出峰時間為8.240 min，C 為F-羥丙基-β-環(huán)糊精的HPLC 圖譜，有吸收峰，出峰時間為8.247 min。表明該方法測定F-羥丙基-β-環(huán)糊精的專屬性良好。

圖1 氟馬西尼HPLC 分析的專屬性圖譜

（4）線性。分別精密吸取“溶液配制”項下對照品溶液適量，放置于容量瓶中，加流動相稀釋定容，配制6.25、12.5、25、50、75、100 μg/ml 的氟馬西尼系列標準品溶液，進樣分析。以峰面積（A）為縱坐標，氟馬西尼濃度（C/μg·ml-1）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A=0.738 0C-0.171 9，r=0.999 9。結(jié)果表明，氟馬西尼濃度在 6.25～100 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，定量下限為6.25 μg/ml。

（5）精密度及準確度考察。分別取“線性”項下低（6.25 μg/ml）、中（25 μg/ml）、高（100 μg/ml）3 個濃度的氟馬西尼溶液各6 份，進樣分析，連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度（以RSD 表示）。根據(jù)隨行回歸方程計算各樣品中氟馬西尼的實測質(zhì)量濃度，以實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度相比較，考察準確度（表1）。結(jié)果表明，該方法精密度、準確度良好，符合生物樣本分析要求。

表1 氟馬西尼日內(nèi)、日間精密度與準確度( ±s,n=6)

表1 氟馬西尼日內(nèi)、日間精密度與準確度( ±s,n=6)

樣品濃度 （ρB/μg·ml-1）日內(nèi)日間實測濃度 （ρB/μg·ml-1） 準確度（%） 精密度RSD（%） 實測濃度 （ρB/μg·ml-1） 準確度（%） 精密度RSD（%）6.256.27±0.12100.321.916.32±0.05101.120.84 2525.19±0.46100.761.8525.26±0.34101.041.36 10099.85±0.3999.850.3999.74±1.2899.741.28

2.1.3 氟馬西尼及包合物體外溶出度試驗

取氟馬西尼和F-HP-β-CD（相當于氟馬西尼10 mg），按照溶出度測定法（2020 年版《中國藥典》四部通則0931 溶出度測定法第二法漿法），選用100 ml 去離子水為溶出介質(zhì)，溫度設(shè)定為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于1、2、5、10、15、30 min時取樣過濾，并補充相同體積、相同溫度的空白溶出介質(zhì)。取續(xù)濾液稀釋后， 參照“ 色譜條件”項下，利用HPLC 法進行濃度測定，計算各時間點溶出度，并與原料藥進行比較。

如圖2 所示，5 min 時 F-羥丙基-β-環(huán)糊精的溶出度大于95%，而氟馬西尼30 min 溶出度約30%。表明氟馬西尼與羥丙基-β-環(huán)糊精包合能提高藥物的溶出度，進而提高生物利用率，為后續(xù)氟馬西尼舌下片制備提供了基礎(chǔ)。

圖2 氟馬西尼及包合物體外溶出曲線

2.1.4 氟馬西尼舌下片制備

稱取處方量F-HP-β-CD、乳糖、甘露醇、硬脂富馬酸鈉，過100 目篩備用。將輔料（除硬脂富馬酸鈉外）與F-HP-β-CD 等量遞增混勻。加入適量10% PVPK30的 90% 乙醇溶液制成軟材，過16 目篩制粒，40℃烘干2 h。加硬脂富馬酸鈉，混勻，單沖壓片機制成片劑。每片含氟馬西尼0.2 mg。

2.1.5 氟馬西尼舌下片體外溶出度試驗

取氟馬西尼舌下片3 批次（批號：20220615-1、20220615-2、20220615-3），按照溶出度測定法，選用50 ml 去離子水為溶出介質(zhì)，溫度設(shè)定在（37±0.5） ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于5、15、30、60 min取樣過濾。其余同“2.1.3” 項操作。如表2 所示，氟馬西尼舌下片15 min 內(nèi)可完全溶出。

表2 氟馬西尼舌下片的溶出度檢查結(jié)果( ±s,n=6)

表2 氟馬西尼舌下片的溶出度檢查結(jié)果( ±s,n=6)

溶出度（%）5 min15 min30 min60 min 20 220 615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20 220 615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20 220 615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39批號

2.2 LC-MS/MS 測定比格犬體內(nèi)氟馬西尼血藥濃度方法

2.2.1 色譜質(zhì)譜條件

（1）色譜柱。XSelect HS T3（2.1 mm×50 mm，2.5 μm）；柱溫：15 ℃；流動相： A 相為水（含1 mmol/L 乙酸銨），B 相為乙腈；梯度洗脫：0.01～1.30 min, 30%B； 1.30～1.80 min, 30%～95%B；1.80～1.81 min，95%B；1.81～2.20 min，30%B；流速：0.6 ml/min；進樣量：8 μl。

（2）質(zhì)譜條件。正離子電噴霧離子化（ESI）方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：5.5 kV；源溫度：500℃；霧化氣為60 psi；輔助加熱氣為60 psi；氣簾氣為40 psi；離子對、去簇電壓、碰撞室出口電壓及碰撞能量等參數(shù)見表3。

表3 質(zhì)譜條件

2.2.2 血漿樣品處理

取100 μl 血漿樣品到EP 管中，加入600 μl 內(nèi)標液（200 ng/ml 甲苯磺丁脲的乙腈溶液）。渦旋混勻1 min，13 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min。取上清液適當稀釋后放置于進樣瓶中， 8 μl 進樣檢測。

2.2.3 專屬性考察

在上述提取條件及色譜、質(zhì)譜條件下，測定空白血漿、含內(nèi)標溶液的血漿樣品、含氟馬西尼的血漿樣品以及給藥后比格犬血漿樣品，記錄色譜圖見圖3。結(jié)果表明，氟馬西尼和內(nèi)標甲苯磺丁脲保留時間分別為1.63 min 和1.94 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

圖3 氟馬西尼及內(nèi)標物甲苯磺丁脲專屬性圖譜

2.2.4 標準曲線及定量限

比格犬空白血漿中精密加入不同濃度的氟馬西尼對照品溶液5 μl，配制濃度分別為0.2、0.5、1、2、10、50、100、200 ng/ml 的系列對照品血漿樣品，按照“ 2.2.2” 項下方法操作，記錄峰面積。以氟馬西尼濃度C為橫坐標，氟馬西尼與內(nèi)標物的峰面積比值（AF/ATOL）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為AF/ATOL=0.008 3C+0.000 9，r=0.998 1。氟馬西尼在 0.2～200 ng/ml 濃度范圍線性關(guān)系良好。本法測定血漿中氟馬西尼的最低定量限為0.2 ng/ml。

2.2.5 精密度與準確度

用空白比格犬血漿配制低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）3 個濃度的對照品血漿樣品各6 份，按照“2.2.2”項下方法操作，連續(xù)測定3 d，隨行標曲計算其濃度，算得血漿樣品測定方法的精密度和準確度，結(jié)果如表4 所示。數(shù)據(jù)表明該方法精密度、準確度良好，符合生物樣本分析要求。

表4 氟馬西尼日內(nèi)、日間精密度與準確度( ±s,n=6)

表4 氟馬西尼日內(nèi)、日間精密度與準確度( ±s,n=6)

樣品濃度（ρB/ng·ml-1）日內(nèi)日間實測濃度（ρB/ng·ml-1）準確度（%）精密度RSD(%)0.60.60±0.02 95.35 3.090.59±0.03 96.70 9.99 66.10±0.23 101.72 3.856.25±0.28 104.20 4.42 160167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38精密度RSD(%)實測濃度（ρB/ng·ml-1）準確度（%）

2.2.6 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿平行配制氟馬西尼、內(nèi)標物甲苯磺丁脲低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）濃度樣品各6 份，按照“ 2.2.2”項下方法預(yù)處理并進樣分析，記錄峰面積A1；取空白血漿按“2.2.2”項下方法預(yù)處理后，加入低、中、高濃度氟馬西尼及內(nèi)標物甲苯磺丁脲后進樣分析，記錄峰面積A2；用甲醇配制含氟馬西尼及內(nèi)標物甲苯磺丁脲低、中、高濃度溶液，進樣分析，記錄峰面積A3。A1與A2比值為提取回收率；A2與A3比值為基質(zhì)效應(yīng)（表5）。實驗結(jié)果表明，低、中、高濃度氟馬西尼提取回收率為86.12 %～87.43 %，基質(zhì)效應(yīng)為105.87 %～106.28 %。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均在80 %～120 %，RSD 均＜15%，符合生物樣本分析要求。

表5 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)( ±s,n=6)

表5 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)( ±s,n=6)

氟馬西尼樣品濃度（ρB/ng·ml-1）提取回收率（%）RSD（%）0.687.43±2.492.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.672.77 105.99±6.61 6.03 16086.12±3.703.85 106.28±3.97 3.73 RSD（%）基質(zhì)效應(yīng)（%）

2.2.7 穩(wěn)定性

取空白血漿加入氟馬西尼標準品溶液，配制成低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）濃度的血漿樣品，每個濃度平行6 份，按“2.2.2”項下操作，分別考察其室溫放置4 h、反復(fù)凍融3 次以及-20 ℃放置30 d 的穩(wěn)定性，結(jié)果見表6。表明在上述條件下樣品均穩(wěn)定。

表6 氟馬西尼室溫放置4 h、凍融及長期凍存穩(wěn)定性( ±s,n=6)

表6 氟馬西尼室溫放置4 h、凍融及長期凍存穩(wěn)定性( ±s,n=6)

放置條件樣品濃度（ρB/ng·ml-1） 回收率（%） RSD（%）室溫4 h0.698.33±1.023.51 6 99.67±1.633.71 160106.25±5.263.09反復(fù)凍融3次0.695.52±1.031.08 6 99.36±2.253.52 160102.71±3.822.32-20 ℃放置30 d0.697.72±1.322.73 6 101.37±1.253.44 160105.48±3.693.87

2.3 比格犬體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.3.1 給藥及取樣

采用雙周期雙交叉實驗設(shè)計方案。將12 只比格犬隨機分為2 組，分別給予氟馬西尼舌下片（0.2 mg）和注射劑（0.1 mg），清洗期為1 周。給藥前禁食12 h，自由飲水。于給藥后10 min、20 min、30 min、45 min、1.0 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2.0 h 、2.5 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h 由腿靜脈取血2 ml，置于肝素鈉采血管中，12 000 r/min 離心10 min ，取上層血漿按“2.2.2”項下方法處理后測定。

2.3.2 藥動學(xué)研究

比格犬給予氟馬西尼舌下片與氟馬西尼注射液后，血藥濃度-時間曲線如圖4。用WinNonlin 7.0藥動學(xué)軟件對所測數(shù)據(jù)進行非房室模型分析，得到主要藥動學(xué)參數(shù)見表7。

表7 氟馬西尼舌下和靜注給藥的藥動學(xué)參數(shù)( ±s，n=12)

表7 氟馬西尼舌下和靜注給藥的藥動學(xué)參數(shù)( ±s，n=12)

氟馬西尼注射劑（0.1 mg）t1/2（t/h）0.78±0.250.58±0.08 tmax （t/h）0.58±0.240.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml-1）6.36±2.1410.96±2.62 AUClast （h·ng·ml-1）8.86±2.838.41±2.15 MRTlast （t/h）1.23±0.250.66±0.08 Vz （L/kg）3.21±1.680.89±0.21 CL [L/（h·kg）]2.83±1.021.09±0.25 F（%）52.68-觀測參數(shù)氟馬西尼舌下片（0.2 mg）

圖4 氟馬西尼舌下和靜注給藥的血藥濃度-時間曲線圖( ±s,n=12)

舌下片和注射劑的峰濃度分別為（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml，兩者達峰時間分別為（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h ，AUClast分別為（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml-1；根據(jù)數(shù)據(jù)擬合計算得到主要藥動學(xué)參數(shù)，并計算出氟馬西尼舌下片的絕對生物利用度，結(jié)果如表7。計算得出氟馬西尼舌下片絕對生物利用度約為52.68 %。

3 討論

本課題首先制備了氟馬西尼-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，實驗表明，包合物能顯著改善氟馬西尼的溶解性能和溶出度，促進藥物透膜吸收，在此基礎(chǔ)上將包合物進一步制成氟馬西尼舌下片。溶出度測定結(jié)果表明，舌下片在5 min 時的累積溶出度已超過60%，15 min 內(nèi)可完全溶出。

實驗建立了LC-MS 法測定比格犬血漿中氟馬西尼濃度，經(jīng)過方法學(xué)驗證，該方法適用于氟馬西尼在比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究。藥動學(xué)實驗結(jié)果表明，氟馬西尼舌下片在比格犬體內(nèi)的舌下黏膜吸收迅速， 30 min 左右達峰值（Cmax=6.36 ng/ml）。氟馬西尼舌下片絕對生物利用度為52.68 %，而根據(jù)既往研究報道，氟馬西尼口服給藥生物利用度僅為16%[11]，說明將氟馬西尼與HP-β-CD 包合后制備成舌下片給藥能夠顯著提高其透舌下黏膜吸收以及生物利用度。另據(jù)文獻報道[12]，靜脈注射0.1～0.2 mg 氟馬西尼注射液可有效拮抗苯二氮?類藥物鎮(zhèn)靜催眠作用，比較氟馬西尼注射劑（0.1 mg）及氟馬西尼舌下片（0.2 mg）藥動學(xué)參數(shù)，二者AUClast值無顯著性差異，且舌下片在達峰后血藥濃度始終高于注射劑，表明氟馬西尼舌下片可持續(xù)有效拮抗鎮(zhèn)靜催眠藥物。