曾棋平，劉建清，楊麗娜，劉志宏，宋洪濤

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院藥學(xué)部, 福建 漳州 363000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校, 福建 泉州 362000；3.聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院藥劑科, 福建 漳州 363000；4.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院藥劑科, 福建 福州 350025）

水飛薊素（SM）是從菊科植物水飛薊[Silybum marianum （L.） Gaertn.]的果實中提取的一種黃酮木脂素類混合物，主要成分為花旗松素（TF）、水飛薊寧（SD）、水飛薊亭（SC）、水飛薊賓（SB）和異水飛薊賓（ISB）[1-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，水飛薊素具有多種藥理活性，除保肝護肝臟作用外[5]，其對腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默癥（AD）也有一定的治療效果[6-8]。然而，水飛薊素在水中的溶解度低，導(dǎo)致其口服生物利用度達不到要求，極大地限制了其臨床應(yīng)用。

磷脂復(fù)合物（PC）是指藥物和磷脂分子在非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)，通過電荷遷移而形成穩(wěn)定的化合物（或絡(luò)合物），形成復(fù)合物后能顯著改變母體藥物的理化性質(zhì)，進而提高藥物的生物利用度[9]。當前，對天然藥物磷脂復(fù)合物的研究已有較多報道，如根皮素磷脂復(fù)合物[10]、鼠李素磷脂復(fù)合物[11]、鞣花酸磷脂復(fù)合物[12]。然而，對SM-PC 的制備工藝研究較少[13]，且針對其體外溶出行為研究主要以水飛薊賓為指標進行評價，難以反映水飛薊素原料藥（SMAPI）中多成分的情況?；诖?，筆者擬采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法[10]優(yōu)化SM-PC 的制備工藝，并對其5 種主要活性成分的體外溶出行為進行考察，以期解決水飛薊素溶解性差、生物利用度低的問題，為后續(xù)水飛薊素的進一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機（上海一恒科技有限公司）；Agilent1200 高效液相色譜系統(tǒng)（DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；DZF-6 051 型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AL204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；RCZ-6BZ 型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；KQ-800KDE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-S24 型電熱恒溫水浴器（上海精密試驗設(shè)備有限公司）。

圖1 SM-PC 溶出度測定HPLC 圖

1.2 試藥

SM-API（遼寧盤錦華成制藥廠，批號：120508，含量48 %）；水飛薊素膠囊（德國馬博士制藥廠，批號：B1101616，規(guī)格140 mg）；TF、SC、SD、SB 和ISB 對照品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度約為98.5%，批號：120115）；大豆卵磷脂（江蘇曼氏生物科技有限公司，批號：130201，其中，磷脂酰膽堿含量約為70 %）；蛋黃卵磷脂（德國Lipoid?公司，批號：120920，其中，磷脂酰膽堿含量約為70 %）；十二烷基硫酸鈉（湖南爾康制藥有限公司）；甲醇為色譜純，乙醇、丙酮、氯仿、磷酸、氫氧化鈉等為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 SM-PC 的制備及復(fù)合率的測定

取SM-API 5.0 g，加入丙酮溶液500 ml，充分攪拌使其溶解，加入大豆磷脂10.0 g，在40 ℃水浴條件下持續(xù)攪拌1 h，反應(yīng)液減壓蒸干，加入500 ml氯仿溶解，將溶液過濾，取續(xù)濾液減壓濃縮至約50 ml，將濃縮液置于45 ℃的條件下真空干燥24 h，鏟下得淡黃色磷脂復(fù)合物，粉碎過80 目篩避光保存。根據(jù)SM-API 不溶于氯仿，而SM-PC 和PC 均易溶解于氯仿，將制備的SM-PC 溶解于氯仿當中，溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，收集沉淀，干燥稱重，計算復(fù)合率，公式如下：

其中，Y為復(fù)合率，W為SM-API 的質(zhì)量，W1為產(chǎn)生沉淀的質(zhì)量。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

Agilent1200 高效液相色譜系統(tǒng)（DAD 檢測器，美國Agilent 公司），色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm ×250 mm ，5 μm），流速為1 ml/min，柱溫40 ℃，檢測波長為288 nm，進樣量為20 μl，以甲醇（A）-0.05 %磷酸（B）為流動相，梯度洗脫（0～4 min，35% A；4～16 min，35% A→40 % A; 16～23 min，40% A→45% A; 23～40 min，45% A→50%A）[2]。

在上述色譜條件下，水飛薊素5 種成分的分離度均＞1.5，結(jié)果見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別取TF、SC、SD、SB 和ISB 對照品適量，用分析天平精密稱定，置于100 ml 量瓶中，加甲醇輕微振搖使溶解，并稀釋至刻度，得濃度為75.0、80.2、74.5、168.0、93.2 μg/ml 的混合對照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 供試品溶液的制備

取SM-PC 適量（含水飛薊素約20 mg），精密稱定，置100 ml 量瓶中，加甲醇輕微振搖使溶解，加65 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系及方法學(xué)考察

精密量取對照品混合液0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、4.0 ml 于10 ml 量瓶中，加65 %甲醇稀釋至刻度，配制成TF 濃度為1.5、3.0、6.0、12.0、15.0、18.0、30.0 μg/ml；SC 濃度為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、19.2、32.1 μg/ml；SD 濃度為1.5、3.0、6.0、11.9、14.9、17.9、29.8 μg/ml；SB 濃度為3.4、6.7、13.4、26.9、33.6、40.3、67.2 μg/ml；ISB 濃度為1.9、3.7、7.5、14.9、18.6、22.4、37.3 μg/ml 的混合對照品溶液，取混合對照品溶液20 μl 進樣，計算峰面積。以進樣濃度X（μg/ml）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，經(jīng)線性回歸得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 水飛薊素5 種有效成分的線性方程

取SM-PC 適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，測得TF、SC、SD、SB 和ISB 峰面積RSD 分別為0.86%、1.12%、0.65%、2.13%、1.87%，表明該方法重復(fù)性良好。 取同一份供試品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h 在 “2.2.1”項下色譜條件進樣測定，測得TF、SC、SD、SB 和ISB 峰面積RSD 為 2.21%、0.98%、1.57%、2.76%、2.12%，表明溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.2.2”項下混合對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定 6 次，測得TF、SC、SD、SB 和ISB 峰面積RSD 分別為 0.88%、0.62%、0.78%、1.05%、0.93%，表明儀器精密度良好?；厥章试囼灲Y(jié)果表明，TF、SC、SD、SB 和ISB 的平均加樣回收率分別為100.55%、99.64%、100.51%、100.13%、104.63%，RSD 分別為0.95%、0.68%、1.15%、1.22%、1.05%。

2.3 SM-PC 處方篩選的單因素考察

2.3.1 反應(yīng)溶劑的影響

固體藥物載體比1∶2，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間1 h，藥物濃度為10 mg/ml，考察反應(yīng)溶劑為無水乙醇、丙酮、甲醇時藥物的復(fù)合率，結(jié)果見表2。

表2 溶劑對復(fù)合率的影響(n=3)

以丙酮為反應(yīng)溶劑的復(fù)合率高于無水乙醇和甲醇，這可能是由于乙醇和甲醇均為質(zhì)子性溶劑，不利于磷脂復(fù)合物的形成。

2.3.2 反應(yīng)時間的影響

固定反應(yīng)溶劑為丙酮，藥物載體比1∶2、反應(yīng)溫度40 ℃，藥物濃度為10 mg/ml，考察反應(yīng)時間為0.5、1、2 、3 h 時藥物的復(fù)合率，結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)時間對復(fù)合率的影響(n=3)

試驗表明，隨著反應(yīng)時間的延長，則復(fù)合率也增大，當反應(yīng)時間大于2 h 后，復(fù)合率受時間影響較小。

2.3.3 反應(yīng)溫度的影響

固定反應(yīng)時間為2 h，反應(yīng)溶劑為丙酮，藥物載體比1∶2，藥物濃度為10 mg/ml，考察磷脂復(fù)合物制備溫度在30、40、50 和60 ℃時的復(fù)合率，結(jié)果見表4。

表4 反應(yīng)溫度對復(fù)合率的影響(n=3)

試驗表明，隨著反應(yīng)溫度的升高，復(fù)合率也增大，在60 ℃時，復(fù)合率達到最高，考慮到磷脂在60 ℃以上時容易變性，因此未做更高溫度的考察。

2.3.4 藥物濃度的影響

固定反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)溶劑為丙酮，反應(yīng)時間為2 h，藥物載體比1∶2，考察藥物濃度為5、10、20、30 mg/ml 的復(fù)合率，結(jié)果見表5。

表5 藥物濃度對復(fù)合率的影響(n=3)

從上表可見，藥物濃度對藥物的復(fù)合率有一定的影響，隨著藥物濃度的增加，水飛薊素磷脂復(fù)合物的復(fù)合率降低。

2.3.5 水飛薊素與大豆磷脂的比例

固定藥物濃度為10 mg/ml，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)溶劑為丙酮，反應(yīng)時間為2 h，考察水飛薊素原料藥與大豆磷脂的比例分別為1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5 時藥物的復(fù)合率，結(jié)果見表6。

表6 反應(yīng)物投料比例對復(fù)合率的影響(n=3)

由上表可以看出，隨著磷脂用量的升高，復(fù)合率也增大，原因可能為磷脂的量增大，對水飛薊素的增溶作用也增大，溶液分子間碰撞形成復(fù)合物的幾率增大，但試驗中我們發(fā)現(xiàn)，磷脂比例為1∶2.5時形成的復(fù)合物較黏稠，不易干燥，故選用藥物載體比為1∶2。

2.3.6 磷脂的種類

固定反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)溶劑為丙酮，反應(yīng)時間為2 h，藥物濃度為10 mg/ml，水飛薊素與磷脂的比例為1:2，考察載體采用蛋黃卵磷脂和大豆卵磷時對復(fù)合率的影響，結(jié)果見表7。

表7 磷脂種類對復(fù)合率的影響(n=3)

由上表可以看出，采用大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂作為載體時，其復(fù)合率并沒有顯著區(qū)別，但采用蛋黃卵磷脂制備得到的SM-PC 較為黏稠，不易干燥，因此選用大豆卵磷脂作為復(fù)合載體。

2.4 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.4.1 試驗設(shè)計

在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇對復(fù)合率影響較大的幾個因素為自變量，即脂藥比（X1）、反應(yīng)濃度（X2）、反應(yīng)溫度（X3），以復(fù)合率（Y1）為因變量，采用三因素、五水平的星點試驗設(shè)計，各因素的水平代碼和具體的試驗操作值見表8，具體的試驗安排見表9。

表8 各因素水平代碼及試驗操作值

表9 試驗設(shè)計及測定結(jié)果(n=3)

2.4.2 模型擬合

根據(jù)試驗結(jié)果，應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，以評價指標（復(fù)合率）分別對各因素進行多元線性回歸和二項式方程擬合，對二項式方程中的各系數(shù)進行t檢驗，刪除P＞0.2 的項，以達到簡化模型的目的。所得多元線性回歸方程如下：Y=46.584 6+10.034 2X1-0.381 9X2+0.534 1X3（r=0.892 1），二項式方程如下：Y=75.360 3+2.925 1X1+0.530 3X2-0.823 9X3-0.396 0X1X2+0.712 5X1X3+7.039 1X2X3-7.180 2-0.021 2+2.845 9（r=0.965 0）。

由以上方程可知，二項式方程擬合的回歸系數(shù)r高于多元線性回歸，故選擇二項式擬合模型進行預(yù)測。

2.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測

由“2.4.2”項下所得二項式方程，應(yīng)用Design Expert 8.0 軟件繪制指標（復(fù)合率）與影響顯著的兩個自變量的三維效應(yīng)面和二維等高圖（另一個自變量設(shè)為中心點值），結(jié)果見圖2、圖3 和圖4。

圖2 復(fù)合率對脂藥比和藥物濃度的三維效應(yīng)面和二維等高線

圖3 復(fù)合率對脂藥比和反應(yīng)溫度的三維效應(yīng)面和二維等高線

圖4 復(fù)合率對藥物濃度和反應(yīng)溫度的三維效應(yīng)面和二維等高線

由圖2～4 可以看出，在一定范圍內(nèi)，水飛薊素與大豆卵磷脂的復(fù)合率隨磷脂與水飛薊素比例的增大而增高，隨反應(yīng)濃度的增高而降低，隨反應(yīng)溫度的增高而增高。每個效應(yīng)面都有其較優(yōu)區(qū)域，以復(fù)合率為指標，軟件給出最佳工藝是水飛薊素與大豆卵磷脂比例為1∶1.8，反應(yīng)溫度55.95 ℃，反應(yīng)物的濃度為8.04 mg/ml。綜合考慮技術(shù)的可行性和經(jīng)濟的合理性，確定制備SM-PC 的最優(yōu)工藝條件為水飛薊素與大豆卵磷脂的比例為1∶1.8，反應(yīng)溫度56 ℃，反應(yīng)物的濃度8.0 mg/ml。

2.5 優(yōu)化工藝的驗證

將上述優(yōu)選的最佳工藝制備3 批SM-PC 進行驗證性試驗，測定水飛薊素與磷脂的復(fù)合率，將所得結(jié)果與二項式擬合方程的預(yù)測值相比較，結(jié)果見表10。

表10 最佳工藝條件驗證試驗(%)

由表10 可知，復(fù)合率的預(yù)測值和實測值的偏差小于3 %，證明試驗所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較好。

2.6 體外溶出試驗

采用槳法測定SM-API、SM-PC、市售水飛薊素膠囊在蒸餾水（pH5.6）和pH7.5 的磷酸鹽緩沖液（含0.5 % SDS）中的體外溶出度，槳轉(zhuǎn)速為100 r/min，水浴溫度為37 ℃。每次取含水飛薊素150 mg 的磷脂復(fù)合物粉末裝入膠囊，分別于10、20、30、40、50、60 min 取樣，每次10 ml，并及時補充等溫度等體積的溶出介質(zhì)，用0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液進樣分析[14]。試驗結(jié)果見圖5 和圖6。SMAPI、SM-PC 和水飛薊素膠囊在pH5.6 的蒸餾水中溶出均不完全，SM-API 各組分的溶出顯示出較大差異，其中，水溶性成分TF 溶出最高，達60%，而SB 溶出不到20%。在pH7.5 的磷酸鹽緩沖液（含0.5 %SDS）中，SM-API 的溶出度有了一定的提高，但仍溶出不完全，SM-PC 各組分在60 min 的溶出接近90%，主要成分SB 的溶出行為與市售水飛薊素膠囊相似，遠高于原料藥。

圖5 在蒸餾水中的溶出曲線

圖6 在pH7.5 的磷酸鹽緩沖液(含0.5 %SDS)中的溶出曲線

3 討論

在制備磷脂復(fù)合物的過程中，真空干燥必須控制一定的溫度條件，溫度太低，則磷脂復(fù)合物無法充分干燥，制備的磷脂復(fù)合物較黏稠，不利于后續(xù)制劑的制備；而溫度太高，發(fā)現(xiàn)所制備的磷脂復(fù)合物顏色加深，這可能是由于大豆卵磷脂在高溫條件下變性所致。結(jié)合預(yù)實驗，本研究最終確定制備SM-PC 的真空干燥溫度為45 ℃。

通常選擇溶出度試驗的溶劑應(yīng)該接近生理條件，對于難溶性藥物而言, 可根據(jù)藥物的理化性質(zhì)（如溶解度數(shù)據(jù)）添加適量的表面活性劑。文獻報道[15]，將水飛薊素制備成磷脂復(fù)合物后，藥物的脂溶性提升較大，生物利用度在人體提高了2～3 倍，而水溶性提升相對不明顯，其在水、人工腸液和人工胃液中難以完全溶出。參考市售水飛薊素磷脂復(fù)合物制劑的溶出條件，采用溶出介質(zhì)為pH7.5 的磷酸鹽緩沖液（含0.5 %的SDS），槳轉(zhuǎn)數(shù)為100 r/min[16]。

雖然采用磷脂復(fù)合物技術(shù)有效提高了水飛薊素的體外溶出度，但由于磷脂復(fù)合物本身具有較強的黏性，分散性較差，因而也會限制其溶出速率和溶出度提高的幅度。從本文的研究結(jié)果也可以看出，僅采用磷脂復(fù)合物技術(shù)對水飛薊素的體外溶出度提高有限，后續(xù)可與固體分散體、微球、微丸以及自微乳給藥系統(tǒng)等制劑新技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用來進一步改善溶出行為。需要注意的是，磷脂復(fù)合物聯(lián)合其它制劑新技術(shù)雖能提高其自身的分散性，加快藥物的溶出，但由于采用不同制劑新技術(shù)所制備藥物的微粒載藥方式、釋藥方式和速率、粒徑大小等不同，其溶出速率、跨膜方式、作用部位也可能存在差異，也會影響藥物的療效[17]。因此，實際研究過程中，應(yīng)該基于藥物自身的性質(zhì)以及循證藥學(xué)的證據(jù)去探索合適的制劑新技術(shù)。