孫雨菡，許子藝，廖 峻，張 翮，樊 莉，魯 瑩

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室, 上海 200433；2.上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 上海 200444）

鹽酸阿霉素是一種基于蒽環(huán)類的廣譜抗腫瘤藥物，能夠通過(guò)多種機(jī)制達(dá)到抗腫瘤活性。他能與S 期DNA 相互作用，抑制核酸合成。此外，作為DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，鹽酸阿霉素可引起DNA 鏈的斷裂[1-5]；但由于鹽酸阿霉素嚴(yán)重的心臟毒性和腫瘤細(xì)胞耐藥性阻礙了其在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。小分子化療增敏劑能夠改善腫瘤的多藥耐藥，提高化療藥物的療效。氯尼達(dá)明在調(diào)節(jié)熱療、放射療法、光動(dòng)力療法的活性方面具有潛力[6-7]。氯尼達(dá)明作為己糖激酶Ⅱ（HK-Ⅱ）抑制劑，能夠抑制腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解、減少腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)[8-9]。此外，氯尼達(dá)明可以通過(guò)破壞跨膜電位而有效地觸發(fā)線粒體凋亡途徑。但它作為單一藥物，其抗腫瘤活性有限[10]，因此經(jīng)常與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用作化學(xué)增敏劑。有研究報(bào)道指出，氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素的共遞送，在體外能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞毒性并降低抗腫瘤藥物的給藥劑量[11-14]，二者在協(xié)同治療肝癌、卵巢癌、乳腺癌等領(lǐng)域已取得顯著進(jìn)展。通過(guò)大量的文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素的最佳協(xié)同比例為1∶6，但并未有人專門構(gòu)建氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素混合溶液的含量分析方法[13]。因此，本研究采用HPLC 法建立針對(duì)氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素聯(lián)合用藥的含量分析測(cè)定方法，為二者聯(lián)合用藥的含量檢測(cè)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1 260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀、紫外可見分光光度計(jì)[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]；SECURA125-1CN 型十萬(wàn)分之一電子天平、Arium@mini 超純水機(jī)（德國(guó)賽多利斯）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸阿霉素對(duì)照品（99%）、甲醇（色譜純）、三氟乙酸（TFA，色譜純）均購(gòu)自sigma-Aldrich Company；氯尼達(dá)明對(duì)照品（99%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 波長(zhǎng)的選擇

精密稱取氯尼達(dá)明和鹽酸阿霉素對(duì)照品適量，分別用甲醇水溶液（50%）溶解制成20 μg/ml 的對(duì)照品溶液，在190～400 nm 波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，鹽酸阿霉素的最大吸收波長(zhǎng)為228、253 nm，氯尼達(dá)明的最大吸收波長(zhǎng)為205 nm。故分別選擇253、205 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，見圖1。

圖1 鹽酸阿霉素與氯尼達(dá)明的紫外波長(zhǎng)掃描吸收光譜圖

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1% TFA 水溶液（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：205、253 nm；流速： 1.0 ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl；梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取12 mg 氯尼達(dá)明加入50%甲醇水溶液，渦旋震蕩并超聲溶解后定容至10 ml 量瓶中，即得1.2 mg/ml 氯尼達(dá)明溶液；精密稱取10 mg 鹽酸阿霉素加入50%甲醇水溶液，渦旋震蕩溶解后定容至50 ml 量瓶中，即得0.2 mg/ml 鹽酸阿霉素溶液。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備

將“2.3.1”項(xiàng)中的溶液等體積混合后，量取一定體積的50%甲醇水溶液稀釋2.5 倍，定容于10 ml容量瓶中，即得氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素質(zhì)量濃度分別為240 μg/ml 和40 μg/ml 的混合溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性考察

按照“2.3.1”項(xiàng)及“2.3.2”項(xiàng)條件，配制以下樣品。按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測(cè)，考察方法的專屬性。如圖2 所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法專屬性良好，氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素的色譜峰完全分離。

圖2 氯尼達(dá)明和鹽酸阿霉素的HPLC 圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取不同體積“2.3.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，置于5 ml 量瓶中，加溶劑稀釋并定容，最終得到質(zhì)量濃度為240、180、120、60、30、12、6 μg/ml 的氯尼達(dá)明溶液，此條件下，鹽酸阿霉素的質(zhì)量濃度分別為40、30、20、10、5、2、1 μg/ml。

按上述“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品的峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得氯尼達(dá)明回歸方程：Y=51.439X+111.46，r=0.999 9，證明在本方法下，氯尼達(dá)明在6～240 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性良好。得鹽酸阿霉素回歸方程：Y= 25.142X+ 2.186 3，r=0.999 9，證明在本方法下，鹽酸阿霉素在1～40 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取氯尼達(dá)明質(zhì)量濃度為30、60、240 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行日內(nèi)精密度及日間精密度考察。日內(nèi)精密度測(cè)定方法為樣品測(cè)定5 次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)偏差；日間精密度測(cè)定方法為樣品連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間相對(duì)偏差。如表2、表3 所示，3 種不同濃度的氯尼達(dá)明和鹽酸阿霉素的日內(nèi)、日間精密度的RSD 值均小于2.0 %，符合精密度要求。

表2 鹽酸阿霉素精密度試驗(yàn)(n=5)

表3 氯尼達(dá)明精密度試驗(yàn)(n=5)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)上述方法配制質(zhì)量濃度分別為60、10 μg/ml 的氯尼達(dá)明、鹽酸阿霉素混合溶液，分別在第0、2、4、8、12、24 h 時(shí)進(jìn)樣，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表4、表5 所示，表明氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素的混合溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表4 氯尼達(dá)明在不同時(shí)間下的穩(wěn)定性考察

表5 鹽酸阿霉素在不同時(shí)間下的穩(wěn)定性考察

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取6 份12 mg 氯尼達(dá)明和10 mg 鹽酸阿霉素，加入50%甲醇水溶液，分別定容于10 ml和50 ml 容量瓶中，即得1.2 mg/ml 氯尼達(dá)明溶液和0.2 mg/ml 鹽酸阿霉素溶液。

將上述溶液等體積混合后，量取一定體積的50%甲醇水溶液稀釋2.5 倍，定容于10 ml 容量瓶后，即得6 份氯尼達(dá)明與鹽酸阿霉素質(zhì)量濃度分別為240 μg/ml 和40 μg/ml 的混合溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，帶入回歸方程計(jì)算氯尼達(dá)明和鹽酸阿霉素的含量、回收率和RSD 值。結(jié)果如表6所示。說(shuō)明此方法回收率符合要求。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 討論

氯尼達(dá)明極性小，有機(jī)相比例的改變對(duì)其出峰時(shí)間影響較大。對(duì)于流動(dòng)相的選擇，本實(shí)驗(yàn)曾嘗試以乙腈（0.1% TFA）-水（0.1%TFA）、乙腈：水（0.1%三乙胺，磷酸調(diào)pH=3.0）、乙腈：水（0.1%甲酸）作為流動(dòng)相[15-17]，但氯尼達(dá)明出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且峰對(duì)稱性差。以甲醇-水（0.1% TFA）作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果及峰形較好[18]，故分別考察了甲醇與水分別為90∶10、80∶20、70∶30、65∶35 等比例下兩種化合物的保留時(shí)間。結(jié)果表明，有機(jī)相甲醇比例低于70% 時(shí)，氯尼達(dá)明出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。在溶劑的選擇上，本實(shí)驗(yàn)嘗試以甲醇、甲醇水溶液作為溶劑，當(dāng)溶劑為甲醇水溶液時(shí)，鹽酸阿霉素及氯尼達(dá)明兩組不存在前沿及拖尾現(xiàn)象，且基線較平穩(wěn)，分離度較好。故在此基礎(chǔ)上，為縮短氯尼達(dá)明的出峰時(shí)間，我們嘗試在4～15 min內(nèi)改變有機(jī)相比例，利用梯度洗脫以保證兩種化合物出峰完整且保留時(shí)間適中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用該梯度洗脫方法同時(shí)測(cè)定氯尼達(dá)明和鹽酸阿霉素，在一定濃度范圍內(nèi)線性良好，專屬性高，且精密度、回收率、穩(wěn)定性均符合方法學(xué)要求，可以作為同時(shí)測(cè)定氯尼達(dá)明和鹽酸阿霉素含量的測(cè)定方法。