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        改良QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留

        2024-03-10 13:12:54穆迎春喻亞麗陳建武甘金華
        食品科學(xué) 2024年3期
        關(guān)鍵詞:亞砜克氏代謝物

        彭 婕,穆迎春,喻亞麗,陳建武,劉 婷,何 力,3,*,甘金華,3,*

        (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚(yú)類(lèi)種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢),湖北 武漢 430223;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京 100141;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100141)

        撲草凈是一種選擇內(nèi)吸傳導(dǎo)型均三氮苯類(lèi)除草劑,在中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛[1],它具有類(lèi)似苯環(huán)的結(jié)構(gòu),化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定,是一種持久性有機(jī)污染物[2]。20世紀(jì)70年代,撲草凈開(kāi)始被用于池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖中清除雜草和青苔[3],后續(xù)又用于去除蝦類(lèi)、海參、貝類(lèi)等養(yǎng)殖中的大型藻類(lèi)[4]。種植業(yè)和漁業(yè)使用的撲草凈大部分隨著地表徑流和雨水沖刷等途徑進(jìn)入水體環(huán)境[5],它在水中有較高的溶解度,難以降解,經(jīng)過(guò)自然界的水循環(huán)作用被帶入江河湖海,從而導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外不同水域中均能檢測(cè)到撲草凈殘留[6-10]。撲草凈通過(guò)水體環(huán)境在生物體內(nèi)富集,沿食物鏈傳遞,危害人類(lèi)健康[11],它會(huì)引起生物機(jī)體的內(nèi)分泌紊亂、腫瘤產(chǎn)生等不良危害[12-13],因此,美國(guó)和歐盟等已將其列入內(nèi)分泌干擾物名單[14],中國(guó)也于2010年在中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1435號(hào)中將其列入《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》[15]。近年來(lái)我國(guó)水產(chǎn)品中多次檢出撲草凈殘留[16-17],甚至突發(fā)使用撲草凈清除蝦池中的青苔,導(dǎo)致克氏原螯蝦全部死亡的事故,2021年撲草凈被正式納入“國(guó)家產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃”主要檢測(cè)指標(biāo),可見(jiàn)水產(chǎn)品中撲草凈殘留問(wèn)題已引起廣泛的關(guān)注和重視。撲草凈在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)降解代謝轉(zhuǎn)化途徑產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)多樣的代謝中間產(chǎn)物[18],其中主要包含通過(guò)N-脫烷基化反應(yīng)形成的化合物去異丙基撲草凈(desisopropyl prometryn,DIP)和雙去異丙基撲草凈(dideisopropyl prometryn,DDIP),硫氧化形成的化合物撲草凈亞砜,以及羥基取代甲硫基形成的化合物2-羥基-撲滅津等[19]。目前諸多研究都只針對(duì)水產(chǎn)品中撲草凈殘留分析,缺乏有效的水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝產(chǎn)物殘留測(cè)定方法,無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估水產(chǎn)品中撲草凈殘留風(fēng)險(xiǎn),因此有必要開(kāi)發(fā)水產(chǎn)品中撲草凈及其主要代謝產(chǎn)物DIP、DDIP、撲草凈亞砜和2-羥基-撲滅津快速準(zhǔn)確的分析方法,進(jìn)一步提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)水平。

        由于水產(chǎn)品基質(zhì)具有組分復(fù)雜、干擾物質(zhì)多以及目標(biāo)物含量低等特點(diǎn),因此,準(zhǔn)確評(píng)估水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物的殘留水平需要優(yōu)良的前處理方法和精準(zhǔn)的分析技術(shù)。目前報(bào)道的撲草凈殘留測(cè)定方法主要有氣相色譜法[1]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-21]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-24]。對(duì)比4 類(lèi)分析方法,氣相色譜法靈敏度不高,準(zhǔn)確定性能力較弱;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在精準(zhǔn)定性能力方面有所提升,但檢測(cè)靈敏度仍不具備顯著優(yōu)勢(shì);液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于其靈敏度高、選擇性好,成為分析復(fù)雜基質(zhì)中撲草凈殘留的首選方法。當(dāng)前,水產(chǎn)品中撲草凈殘留分析多采用固相萃?。╯olid phase extraction,SPE)凈化[25-27],此類(lèi)方法往往需先活化SPE柱,再上樣、淋洗、洗脫,不僅過(guò)程耗時(shí),還需消耗大量溶劑,既不經(jīng)濟(jì)也不環(huán)保。近年來(lái),QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)作為一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、安全的前處理技術(shù),在動(dòng)物性食品農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛[28-30]。

        本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,采用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除吸附劑(enhanced matrix removal of lipids,EMR-Lipid)與Cleanert LipoNo混合物作為凈化吸附劑,基于改良的QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、同位素內(nèi)標(biāo)定量,建立了一種同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,具有良好的準(zhǔn)確度和精密度,以期為水產(chǎn)品中新型持久性有機(jī)污染物殘留來(lái)源和質(zhì)量安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        草魚(yú)、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹樣品來(lái)源于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

        撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品(CAS 號(hào)7287-19-6、分子式C10H19N5S,純度≥99%)、DDIP標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)5397-01-3、分子式C4H7N5S,純度為99.7%)、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)7374-53-0、分子式C9H17N5O,純度為99.9%)天津阿爾塔科技有限公司;DIP標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)4147-57-3、分子式C7H13N5S,純度≥99%)美國(guó)TLC公司;撲草凈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)55702-48-2、分子式C10H19N5OS,純度≥99%)美國(guó)Panphy公司;撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)1705649-52-0、分子式C10H13D6N5S,純度≥98%)美國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;撲草凈原藥(純度>97%)浙江中山化工集團(tuán)有限公司。

        乙腈、乙酸乙酯(均為色譜純)美國(guó)J.T.Baker公司;甲醇、乙腈(均為質(zhì)譜級(jí))德國(guó)Meker公司;甲酸(質(zhì)譜級(jí))美國(guó)Fisher公司;氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂(均為分析純)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;EMR-Lipid 安捷倫科技(中國(guó))有限公司;Cleanert LipoNo 天津博納艾杰爾科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀、TSQ Quantiva 三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI))美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;VORTEX 2渦旋混勻儀 德國(guó)IKA公司;R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司;Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL):分別準(zhǔn)確稱(chēng)取撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)品各5.00 mg,置于50 mL棕色容量瓶中,加入適量甲醇充分溶解后,用甲醇定容至刻度線,超聲混勻備用。

        撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL):準(zhǔn)確稱(chēng)取撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg,置于50 mL棕色容量瓶中,加入適量甲醇充分溶解后,用甲醇定容至刻度線,超聲混勻備用。

        撲草凈及其代謝混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 μg/mL):分別準(zhǔn)確移取1 mL撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,超聲混勻備用。

        撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液(10 μg/mL):移取5 mL撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于50 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,超聲混勻備用。

        撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL):移取1 mL撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液,置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,超聲混勻備用。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

        用20%乙腈-甲酸溶液配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均含有撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津混合外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6。每份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為20 ng/mL,外標(biāo)系列質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10、50、200、500 ng/mL。

        1.3.3 前處理方法

        1.3.3.1 樣品制備

        草魚(yú)去鱗,帶皮沿背脊取肌肉部分;克氏原螯蝦去頭、殼、腸腺,取肌肉部分;試樣切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊后均質(zhì)、混勻。中華絨螯蟹去殼、鰓后,將所有可食部分全部取出并絞碎混勻。所有待測(cè)樣品密封標(biāo)記后置于-20 ℃冷凍保存,備用。

        1.3.3.2 樣品前處理

        稱(chēng)取2 g(精確至0.01 g)均質(zhì)的肉糜樣品,置于50 mL離心管中,加入200 μL撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL),混勻后靜置10 min,加入10 mL乙腈和3 顆玻璃珠均質(zhì)子渦旋混勻30 s,隨后依次加入2 g氯化鈉和1 g無(wú)水硫酸鎂,渦旋混合2 min后超聲提取5 min,5000 r/min離心5 min,取上清液至雞心瓶中,殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取1 次,合并提取液,40 ℃減壓蒸干。

        向雞心瓶中加入2 mL 20%甲醇溶液,渦旋混合至瓶?jī)?nèi)殘留物全部溶解,將上述復(fù)溶液置于10 mL離心管中,加入0.20 g EMR-Lipid與0.05 g Cleanert LipoNo混合凈化劑,渦旋振蕩1 min,10000 r/min冷凍離心10 min,取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm聚砜醚濾膜過(guò)濾后,待測(cè)。

        1.3.4 液相色譜條件

        Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);流動(dòng)相:A為乙腈,B為0.1%甲酸溶液;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL;梯度洗脫條件:0~1.0 min,20% A、80% B;1.0~6.0 min,20%~80% A、80%~20% B;6.0~8.0 min,80% A、20% B;8.0~8.1 min,80%~20% A、20%~80% B;8.1~10.0 min,20% A、80% B。

        1.3.5 質(zhì)譜條件

        加熱大氣壓ESI;正離子模式掃描;掃描模式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;噴霧電壓為3500 V;蒸發(fā)溫度為350 ℃;離子傳輸毛細(xì)管溫度為330 ℃;鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?,流速分別為40 L/min和10 L/min;碰撞氣(氬氣,純度≥99.999%);碰撞氣壓力2.0 mTorr。撲草凈及其代謝物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)如表1所示。

        表1 撲草凈及其代謝物質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for prometryn and its metabolites

        1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)評(píng)估

        水產(chǎn)品中含量較高的蛋白質(zhì)、磷脂等內(nèi)源性物質(zhì)會(huì)因與待測(cè)物離子競(jìng)爭(zhēng)液-液表面,從而產(chǎn)生基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),有關(guān)研究表明基質(zhì)種類(lèi)、基質(zhì)質(zhì)量和待測(cè)物質(zhì)量濃度對(duì)ME均有一定影響[31],因此為評(píng)估建立方法的準(zhǔn)確度,應(yīng)考慮ME對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,本研究采用提取凈化后添加標(biāo)樣法,按照下式計(jì)算ME:

        基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:取均質(zhì)的陰性草魚(yú)、克氏原螯蝦和中華絨螯蟹肌肉組織樣品,不加內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6,其余步驟按照1.3.3.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理,制備得到不同水產(chǎn)品空白基質(zhì)溶液。用不同水產(chǎn)品空白基質(zhì)溶液配制系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液,其中內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6質(zhì)量濃度為20 ng/mL,撲草凈及其代謝物混合外標(biāo)質(zhì)量濃度依次為1.0、5.0、10、50、200、500 ng/mL,以此建立基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.7 克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留測(cè)定

        選取體質(zhì)量為(26.94±6.78)g的鮮活克氏原螯蝦,按9.6 μg/mL的質(zhì)量濃度藥浴撲草凈溶液,藥浴36 h后換干凈爆氣水繼續(xù)暫養(yǎng),每個(gè)實(shí)驗(yàn)箱每只克氏原螯蝦用隔板隔開(kāi)。給藥后在0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72、96、120、144 h和168 h采集克氏原螯蝦肌肉組織。克氏原螯蝦肌肉組織均質(zhì)后于-18 ℃冷凍保存,待分析。分析前將克氏原螯蝦肌肉樣品解凍,前處理步驟及儀器分析方法同1.3.3~1.3.5節(jié)。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用Trace Finder 3.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)對(duì)樣品中的撲草凈及其代謝物進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)采集和處理,采用Origin 2023進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算和圖表繪制。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

        撲草凈及其代謝物均為含氨基的三嗪類(lèi)化合物,質(zhì)譜分析時(shí)宜選擇ESI正離子模式測(cè)定,在流動(dòng)相中加入一定量的甲酸,不僅能夠提高目標(biāo)物的離子化效率,還能改善色譜峰峰形,提高色譜峰的分離度。取質(zhì)量濃度為1 μg/mL的撲草凈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蠕動(dòng)泵將其隨流動(dòng)相一同注入質(zhì)譜儀中,在ESI+模式下進(jìn)行母離子全掃描,手動(dòng)調(diào)試質(zhì)譜參數(shù)(噴霧電壓、蒸發(fā)溫度、離子傳輸毛細(xì)管溫度、鞘氣和輔助氣流速等)使目標(biāo)物的質(zhì)譜強(qiáng)度和穩(wěn)定性達(dá)到最佳狀態(tài),然后儀器自動(dòng)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

        2.2 色譜條件優(yōu)化

        本研究對(duì)比Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)和Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,5 μm)對(duì)撲草凈及其代謝物的分離效果,結(jié)果顯示,粒徑更小的色譜柱在峰形、分辨率、保留時(shí)間等方面表現(xiàn)更佳。流動(dòng)相的組成直接影響分析物的分離效果和檢測(cè)靈敏度[32],甲醇和乙腈是農(nóng)獸藥殘留分析時(shí)常用的流動(dòng)相[33-34],本研究考察了水相為0.1%甲酸溶液,有機(jī)相分別選用甲醇和乙腈時(shí)目標(biāo)物的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。如圖1所示,采用甲醇時(shí),代謝物2-羥基-撲滅津與DIP無(wú)法徹底分離,撲草凈亞砜和撲草凈色譜峰不僅重疊在一起,而且出峰時(shí)間位于高有機(jī)相沖洗色譜柱階段,極易受到樣品中強(qiáng)極性雜質(zhì)干擾;采用乙腈時(shí),雖然撲草凈及其代謝物質(zhì)譜強(qiáng)度稍有降低,但所有分析物的保留時(shí)間均提前至線性梯度洗脫階段,并且5 個(gè)目標(biāo)物的色譜峰分離度顯著提升,因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

        圖1 撲草凈及其代謝物總離子流圖(50 ng/mL)Fig.1 Total ion current chromatograms of prometryn and its metabolites (50 ng/mL)

        2.3 前處理方法優(yōu)化

        2.3.1 提取溶劑優(yōu)化結(jié)果

        以撲草凈及其代謝物均未檢出的陰性草魚(yú)為基質(zhì),添加質(zhì)量濃度為10 ng/mL的撲草凈及其代謝物混標(biāo)溶液,分別以甲醇、乙酸乙酯、乙腈和1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑,參照1.3.3.2節(jié)進(jìn)行前處理,考察不同提取溶劑對(duì)5 種目標(biāo)物的萃取回收率。圖2表明,當(dāng)選擇甲醇作為提取溶劑時(shí),代謝物DIP和撲草凈亞砜加標(biāo)回收率超過(guò)120%,而代謝物DDIP和2-羥基-撲滅津回收率僅為60%~70%,由于甲醇與水互溶導(dǎo)致樣品濃縮時(shí)不容易蒸干,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;當(dāng)選擇乙酸乙酯提取目標(biāo)物時(shí),加標(biāo)回收率可達(dá)90%~130%之間,但平行樣測(cè)定結(jié)果偏差較大,結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差,同時(shí)乙酸乙酯容易溶解水產(chǎn)品中的大量脂肪,提取液顏色深且后續(xù)凈化復(fù)雜;使用1%甲酸-乙腈提取時(shí),撲草凈亞砜回收率低于20%,說(shuō)明撲草凈亞砜在酸性環(huán)境中的萃取效率較低,從而導(dǎo)致加標(biāo)回收率偏低;采用乙腈作為提取溶劑時(shí),5 種目標(biāo)物加標(biāo)回收率達(dá)75%~105%,乙腈具有沉淀蛋白等作用,提取液顏色較淺且各目標(biāo)物回收率均滿足分析要求,因此選擇乙腈作為提取溶劑。

        圖2 不同提取溶劑對(duì)撲草凈及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of prometryn and its metabolites (n=3)

        2.3.2 凈化試劑優(yōu)化結(jié)果

        采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水產(chǎn)品藥物殘留時(shí),與水產(chǎn)品共萃出的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)影響目標(biāo)物的電離能力,造成目標(biāo)物信號(hào)強(qiáng)度的改變,因此在前處理中應(yīng)盡量提高凈化效果,去除雜質(zhì),避免干擾檢測(cè),污染或損害檢測(cè)儀器。本研究對(duì)比凈化劑Cleanert LipoNo、EMR-Lipid、Cleanert LipoNo與EMRLipid混合物對(duì)撲草凈及其代謝物的凈化效果,圖3表明,3 組試劑凈化時(shí)撲草凈及其代謝物的加標(biāo)回收率均可達(dá)80%~120%,Cleanert LipoNo作為一種新型除脂材料,其填料表面修飾了許多長(zhǎng)的碳鏈,可針對(duì)性地吸附脂肪,使用該凈化試劑時(shí)僅需混合后靜置分層,無(wú)需離心,操作方便,但DIP、DDIP和撲草凈亞砜回收率高于117%,基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)顯著。EMR-Lipid結(jié)合了體積排阻和疏水作用,可選擇性去除樣品中的主要脂類(lèi)和大分子雜質(zhì),選用該試劑凈化時(shí),除撲草凈亞砜加標(biāo)回收率高于120%之外,其余目標(biāo)物回收率均小于110%,其測(cè)量準(zhǔn)確性能夠滿足檢測(cè)需求,但平行樣間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relation standard deviation,RSD)大于11%,結(jié)果的重復(fù)性較差。將兩種凈化試劑組合用于樣品凈化時(shí),5 種目標(biāo)物加標(biāo)回收率為85%~106%,平行樣間的RSD小于6%,說(shuō)明其去除基質(zhì)干擾的能力最佳。因此,選用Cleanert LipoNo與EMR-Lipid混合物作為樣品前處理的凈化試劑。

        圖3 不同凈化試劑對(duì)撲草凈及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different cleanup sorbents on the recoveries of prometryn and its metabolites (n=3)

        2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

        2.4.1 線性范圍與靈敏度

        按照1.3.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中撲草凈及其代謝物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),系列質(zhì)量濃度下?lián)洳輧艏捌浯x物的定量子離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6子離子峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,撲草凈及其代謝物在1.0~500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,確定系數(shù)R2均大于0.992。在空白樣品中加入系列低質(zhì)量濃度撲草凈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以目標(biāo)峰不小于3 倍信噪比(RSN≥3)確定方法的檢出限(limits of detection,LOD),以不小于10 倍信噪比(RSN≥10)確定方法的定量限(limits of quantification,LOQ),得出水產(chǎn)品基質(zhì)中撲草凈及其代謝物的LOD為0.20 μg/kg,LOQ為0.50 μg/kg,方法靈敏度較高,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 撲草凈及其代謝物線性范圍、線性方程、確定系數(shù)、LOD和LOQTable 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of prometryn and its metabolites

        2.4.2 回收率與精密度結(jié)果

        取陰性草魚(yú)、克氏原螯蝦和中華絨螯蟹肌肉組織樣品,依據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄F[35]的技術(shù)要求,選取LOQ、中間濃度、常見(jiàn)限量值3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),撲草凈及其代謝物3 個(gè)添加量分別為0.5、10、50 μg/kg,每個(gè)添加量進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算方法的加標(biāo)回收率和RSD。如表3所示,草魚(yú)、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹等不同水產(chǎn)品基質(zhì)中撲草凈及其代謝物的加標(biāo)回收率為74.4%~113.7%,RSD為3.17%~11.47%,均有良好的準(zhǔn)確度與精密度,符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

        表3 不同水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物回收率和RSD(n=6)Table 3 Recoveries and RSD of prometryn and its metabolites in different aquatic samples (n=6)

        2.4.3 ME評(píng)估結(jié)果

        采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值,評(píng)價(jià)ME的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)于單點(diǎn)或者多點(diǎn)單獨(dú)評(píng)價(jià)ME,更具有統(tǒng)計(jì)意義和代表性。當(dāng)ME<0.85時(shí),存在基質(zhì)抑制效應(yīng);當(dāng)ME為0.85~1.15時(shí),ME不明顯;當(dāng)ME>1.15時(shí),存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[36]。不同基質(zhì)中撲草凈及其代謝物ME結(jié)果如表4所示,結(jié)果顯示,通過(guò)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正后,5 種撲草凈及其代謝物在不同水產(chǎn)品中的ME不明顯,ME均位于0.85~1.15之間,這一結(jié)果證實(shí)了內(nèi)標(biāo)法可以消除ME造成的定量結(jié)果偏差,提高檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和精準(zhǔn)性。因此本研究采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量分析5 種撲草凈及其代謝物含量。

        表4 不同水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物的METable 4 Matrix effects of prometryn and its metabolites in different aquatic samples

        2.5 克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留分析

        應(yīng)用建立的方法分析藥浴撲草凈后的克氏原螯蝦陽(yáng)性樣品,以此評(píng)價(jià)方法的適用性。克氏原螯蝦樣品按照1.3.7節(jié)處理后,將檢出目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比確認(rèn),結(jié)果顯示藥浴撲草凈后的克氏原螯蝦肌肉樣品中主要檢測(cè)出3 種目標(biāo)物殘留,其中包括撲草凈及其代謝物DIP和撲草凈亞砜(圖4),對(duì)殘留物質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)定性后,再利用建立方法準(zhǔn)確評(píng)估撲草凈及其代謝產(chǎn)物DIP和撲草凈亞砜在克氏原螯蝦肌肉組織中的殘留水平??耸显r肌肉組織中撲草凈及其代謝產(chǎn)物藥-時(shí)曲線詳見(jiàn)圖5??梢钥闯觯c菲律賓蛤仔對(duì)撲草凈的富集規(guī)律類(lèi)似[37],藥浴撲草凈后,克氏原螯蝦肌肉中的撲草凈殘留量隨時(shí)間大幅波動(dòng),先后出現(xiàn)2 個(gè)較為明顯峰,不同的是菲律賓蛤仔體內(nèi)撲草凈殘留量在24 h達(dá)到峰值,而克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留量在12 h達(dá)到峰值,說(shuō)明克氏原螯蝦對(duì)撲草凈具有快速富集效應(yīng),但對(duì)比圖5中撲草凈原藥和代謝物殘留量變化趨勢(shì)可以看出,在短時(shí)間內(nèi)撲草凈的富集效率遠(yuǎn)高于代謝效率。藥浴撲草凈36 h后將克氏原螯蝦轉(zhuǎn)移至潔凈水中,其肌肉中撲草凈殘留量迅速下降,該結(jié)果與菲律賓蛤仔[37]和海參[38]體內(nèi)的撲草凈消除實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致,說(shuō)明撲草凈在水中消除較快。

        圖4 克氏原螯蝦肌肉組織中撲草凈及其代謝物選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.4 SRM chromatograms of prometryn and its metabolites in muscle tissue of crayfish

        圖5 克氏原螯蝦肌肉組織中撲草凈及其代謝物藥-時(shí)曲線(n=5)Fig.5 Drug-time curves of prometryn and its metabolites in muscle tissue of crayfish (n=5)

        3 結(jié)論

        本研究開(kāi)發(fā)了一種水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,樣品經(jīng)乙腈提取,EMR-Lipid與Cleanert LipoNo組合凈化,甲醇溶液定容后超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,內(nèi)標(biāo)法定量。撲草凈及其代謝物在1.0~500 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,確定系數(shù)R2大于0.992。5 種除草劑LOD為0.20 μg/kg,LOQ為0.50 μg/kg。撲草凈及其代謝物在3 種水產(chǎn)品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為74.4%~113.7%,RSD為3.17%~11.47%。該方法操作簡(jiǎn)單快速、基質(zhì)干擾少、靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留的精準(zhǔn)識(shí)別和準(zhǔn)確定量,為撲草凈在水產(chǎn)動(dòng)物中的藥代動(dòng)力學(xué)和殘留消除規(guī)律研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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