張紅梅，高 雪，劉 璐，賈 穆，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

食源性致病菌是指受其污染的食品會(huì)引發(fā)人體疾病的一類(lèi)微生物，主要包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogens）、肉毒芽孢桿菌（Clostridium botulinum）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、霍亂弧菌（Vibrio cholera）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）等[1]。食源性致病菌在環(huán)境中存活率高且傳播速度快，引發(fā)的食源性疾病嚴(yán)重危害到人體健康，并一定程度上阻礙國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示，全世界每年約6億 人（1/10左右）患上食源性疾病，420000 人死于食源性疾病，其中40%是5 歲以下兒童[2]。此外，據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）報(bào)道結(jié)果顯示，美國(guó)每年約4800萬(wàn) 人（1/6左右）感染食源性疾病，128000 人因其住院，3000 人因其死亡[3-4]。因此，在早期階段更快更靈敏地檢測(cè)食源性致病菌以防患食源性疾病是亟待解決的問(wèn)題。

傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方法包括標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法和逐漸優(yōu)化的方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、利用噬菌體的方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等[5-8]。但是上述方法不能滿(mǎn)足公眾對(duì)食品安全和健康的更高需求，為此，越來(lái)越多研究者致力于更精準(zhǔn)、更高效的檢驗(yàn)方法的發(fā)展，如基于納米材料的生物傳感器檢測(cè)方法[9-10]。

基于納米材料的生物傳感器檢測(cè)方法通過(guò)將納米材料引入生物傳感器，完成對(duì)致病菌的靈敏快速測(cè)定。其中，生物傳感器是應(yīng)用物理化學(xué)檢測(cè)設(shè)備測(cè)定各種生物成分的一種生物儀器[11]，納米材料具有尺寸小、表體比大、可表面活化、良好的信號(hào)傳導(dǎo)和電導(dǎo)率等優(yōu)勢(shì)，可被高密度識(shí)別分子修飾，既可作為識(shí)別元素，也可作為信號(hào)元素，使生物傳感器的檢測(cè)性能有效提升[12-15]。相比傳統(tǒng)方法，基于納米生物傳感器的檢測(cè)方法具有靈敏省時(shí)、實(shí)時(shí)檢測(cè)、操作要求低、材料消耗少和檢測(cè)限（limit of detection，LOD）較低等優(yōu)勢(shì)[16]。

1 傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方法

為有效預(yù)防食源性致病菌的污染，大量檢測(cè)食源性致病菌的方法被研究，包括被認(rèn)為是國(guó)際黃金方法的標(biāo)準(zhǔn)平板法和逐漸改進(jìn)的快速檢測(cè)法[17]。

標(biāo)準(zhǔn)平板法是檢測(cè)食源性致病菌的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，具有較高的精確度和較強(qiáng)的靈敏性，但需要大量的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和培養(yǎng)基，易受到非檢測(cè)菌的污染，所需時(shí)間長(zhǎng)[17]。相比之下，PCR方法所需的檢測(cè)時(shí)間縮短，靈敏度提升，涵蓋簡(jiǎn)單PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR和最新的數(shù)字PCR[18-20]，但要求高、成本高且操作繁瑣[21-22]。ELISA具有極高的特異性和靈敏度，但抗原抗體的連接和酶的催化易受環(huán)境干擾[23]。利用噬菌體的方法具有極強(qiáng)的選擇性，但同時(shí)受到很多條件的限制[24-25]。LAMP可使目標(biāo)DNA擴(kuò)增，靈敏度提高，但會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[26]，Garg等指出最新的LAMP結(jié)合使用傳感器的方法可顯著提高檢測(cè)靈敏度[27]。

綜上，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無(wú)法滿(mǎn)足簡(jiǎn)易準(zhǔn)確、省時(shí)靈敏且低消耗的需求，尤其是在資源有限的地區(qū)難以實(shí)施[28-31]。而基于納米生物傳感器檢測(cè)食源性致病菌的方法很好地迎合了這些需求，深受眾多研究者的關(guān)注[32]。

2 基于納米生物傳感器的食源性致病菌檢測(cè)方法

近十幾年，生物傳感器迅速發(fā)展，LOD越來(lái)越低，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)從天到小時(shí)乃至分鐘，成為了優(yōu)化食源性致病菌檢測(cè)方法的研究熱點(diǎn)之一。此外，新型納米材料具有優(yōu)異的物理化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)及較大的表面積，可增強(qiáng)納米生物傳感器的檢測(cè)性能[33-34]，因此，基于納米材料生物傳感器的方法具有取代傳統(tǒng)方法的潛能[32,35-41]。與此同時(shí)，納米生物傳感多模式的結(jié)果輸出包括電化學(xué)[42-43]、表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）[44-45]、比色和熒光[46]等，此方法可以放大信號(hào)，提高靈敏度。為此本文對(duì)納米生物傳感器的單模式、雙模式及多模式檢測(cè)方法的原理及其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)展開(kāi)綜合比較（圖1、表1），為優(yōu)化食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

表1 用于檢測(cè)食源性致病菌的納米生物傳感器的比較Table 1 Comparison of nano-biosensors for the detection of foodborne pathogenic bacteria

圖1 納米生物傳感器在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用總結(jié)Fig.1 Summary of the application of nano-biosensors for the detection of foodborne pathogenic bacteria

2.1 單模式

基于納米生物傳感器的單模式檢測(cè)是檢測(cè)信號(hào)以比色、熒光、SERS、電化學(xué)等單模式輸出的方法。比色檢測(cè)簡(jiǎn)單、快速、成本低；熒光檢測(cè)具有較高靈敏度；SERS檢測(cè)快速且靈敏度高；電化學(xué)檢測(cè)快速便捷，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。每一種檢測(cè)方法各具優(yōu)勢(shì)，在食源性致病菌的定性定量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。

2.1.1 比色檢測(cè)

比色檢測(cè)中傳感器的顏色隨目標(biāo)致病菌的濃度改變而改變，是一種簡(jiǎn)單、可視化的方法，包括直接比色和催化比色。直接比色即由納米材料的分散和聚集、形狀和大小變化引起顏色變化，可直接通過(guò)肉眼觀察。如圖2A所示，加入目標(biāo)菌后，金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）發(fā)生聚集或金納米棒（gold nanorods，AuNRs）經(jīng)蝕刻后大小發(fā)生變化，導(dǎo)致顏色變化[46]。催化比色即利用納米酶的氧化性或過(guò)氧化性等催化無(wú)色底物，如圖2B所示，二氧化錳納米片（manganese dioxide nanosheets，MnO2NSs）催化無(wú)色的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）和鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）生成相應(yīng)的顯色氧化產(chǎn)物，顏色變化與目標(biāo)菌的濃度相關(guān)[47]。比色檢測(cè)方法簡(jiǎn)易快速且成本低，但受一些外在條件的干擾，目標(biāo)物需純化處理。

圖2 比色檢測(cè)原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of the principle of colorimetric detection

Sun Ruimeng 等[46]利用凍融后的萬(wàn)古霉素（vancomycin，Van）能夠防止AuNPs聚集的原理比色檢測(cè)S.aureus，加入S.aureus后，F(xiàn)e3O4磁性捕獲S.aureus和Van形成夾心復(fù)合物，磁吸分離后，上清液中存在未連接的Van，再轉(zhuǎn)移到AuNPs溶液中，凍融后Van能夠防止AuNPs聚集，因而S.aureus的濃度越大，上清液中的Van越少，凍融后AuNPs聚集越多，紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)紫色，與濃度范圍為10～104CFU/mL的S.aureus線性相關(guān)，測(cè)定LOD低至0.2 CFU/mL。Man Yan等[48]報(bào)道了一種利用硫代聚苯乙烯微球（thiolated polystyrene microspheres，SH-PSs）聚合AuNPs的微流控比色生物傳感器，適配體（aptamer，Apt）修飾的SH-PSs被用作檢測(cè)探針，與其表面的AuNPs結(jié)合，S.typhimurium的加入使AuNPs聚集，發(fā)生可視的顏色變化，實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)S.typhimurium，LOD為60 CFU/mL，在新鮮蔬菜沙拉樣中檢測(cè)S.typhimurium的加標(biāo)回收率為91.68%～113.76%。Feng Junli團(tuán)隊(duì)[49]將Shigella flexneri的Apt固定在AuNPs表面，加入S.flexneri后，Apt優(yōu)先與S.flexneri相連，進(jìn)而從AuNPs表面解離出來(lái)，導(dǎo)致AuNPs聚集，發(fā)生顏色變化及紫外吸收值變化，實(shí)現(xiàn)直接比色檢測(cè)，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在20 min以?xún)?nèi)，檢測(cè)靈敏、操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間。

鑒于食品復(fù)雜的基質(zhì)，通常兩種及以上食源性致病菌共存于食品基質(zhì)中，因此，食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)極具科學(xué)意義。Zhang Huiwen等[47]制備了一種同時(shí)檢測(cè)4 種食源性致病菌的比色納米生物傳感器，利用Apt連接在MnO2和Fe3O4的復(fù)合物上，催化氧化TMB，誘導(dǎo)AuNRs的大小改變，進(jìn)而引起對(duì)應(yīng)顏色的變化，可同時(shí)檢測(cè)線性濃度范圍為10～106CFU/mL的S.aureus、L.monocytogenes、E.coliO157:H7和V.parahaemolyticus，且對(duì)4 種食源性致病菌的LOD分別為1.3、1.2、1.3 CFU/mL和1.4 CFU/mL。

2.1.2 熒光檢測(cè)

熒光檢測(cè)利用與目標(biāo)物特異性反應(yīng)的體外或體內(nèi)熒光標(biāo)識(shí)物的方法，使不同目標(biāo)信號(hào)輸出為對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。在利用納米生物傳感器的熒光檢測(cè)技術(shù)中，熒光納米材料利用外部能量將檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)化為與目標(biāo)菌濃度相關(guān)的熒光強(qiáng)度，可分為上轉(zhuǎn)化熒光材料和下轉(zhuǎn)化熒光材料。上轉(zhuǎn)化熒光材料包括上轉(zhuǎn)化納米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）和碳點(diǎn)（carbon dots，CDs），具有上轉(zhuǎn)換熒光特性、高熒光穩(wěn)定性、最低的自身熒光背景干擾和生物相容性等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)；下轉(zhuǎn)化熒光材料包括傳統(tǒng)的熒光染料和量子點(diǎn)，具有下轉(zhuǎn)換光致發(fā)光特性、光譜重疊和背景干擾等不足[50-51]。

熒光檢測(cè)的原理包括熒光增強(qiáng)、熒光猝滅和熒光猝滅再恢復(fù)。熒光增強(qiáng)中常用到聚集誘導(dǎo)發(fā)射（aggregation-induced emission，AIE），即通過(guò)熒光材料與對(duì)應(yīng)檢測(cè)菌的相互作用，納米粒子產(chǎn)生聚集，誘導(dǎo)光發(fā)射，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)[52]（圖3A）。熒光猝滅包括靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅如內(nèi)濾效應(yīng)（inner filter effect，IFE）[53-54]，主要是熒光材料（供體）與猝滅劑（受體）之間形成不發(fā)光的基態(tài)配合物，導(dǎo)致熒光猝滅或者熒光強(qiáng)度降低；動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程為熒光材料的激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與猝滅劑分子的碰撞作用，以能量轉(zhuǎn)移或電荷轉(zhuǎn)移的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）[51,55]，供體的能量轉(zhuǎn)移給受體導(dǎo)致供體的熒光猝滅（圖3B）。熒光猝滅再恢復(fù)應(yīng)用更為廣泛，檢測(cè)靈敏度更高[51,56]（圖3C）。

圖3 熒光檢測(cè)原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of the principle of fluorescence detection

Pebdeni等[52]制備了Van和Apt雙識(shí)別分子修飾的銅納米簇（copper nanoclusters，CuNCs）檢測(cè)S.aureus，S.aureus富集使CuNCs聚集發(fā)生AIE作用，增強(qiáng)熒光，此方法無(wú)需磁性分離，并且CuNCs的制備和修飾比其他金屬納米簇更容易，成本更低。此外，一些研究也介紹到了熒光猝滅的原理，Jenie等[57]利用基于天然非晶體硅合成的硅納米顆粒（silica nanoparticles，SNP），經(jīng)羅丹明B（rhodamine B，RB）的修飾后檢測(cè)E.coli，加入的E.coli與RB-SNP之間發(fā)生靜電相互作用導(dǎo)致熒光猝滅，相比單獨(dú)使用RB，RB-SNP可顯著提高熒光猝滅率，檢測(cè)在15 min內(nèi)就能完成，檢測(cè)E.coli的線性濃度范圍為10～105CFU/mL，LOD低至8 CFU/mL，進(jìn)一步說(shuō)明納米材料能有效提高檢測(cè)靈敏度。基于熒光猝滅再恢復(fù)原理的檢測(cè)設(shè)備靈敏度高于基于熒光增強(qiáng)和熒光猝滅的設(shè)備。Wang Pingyue等[50]將二硫化鎢納米片（tungsten disulfide nanosheets，WS2NSs）和Apt通過(guò)范德華力相連，進(jìn)而使UCNPs-Apt和WS2NSs相連發(fā)生FRET，體系熒光猝滅，加入E.coli后，E.coli優(yōu)先與Apt相連導(dǎo)致UCNPs-Apt從WS2NSs表面釋放，體系熒光恢復(fù)。Hiremath等[51]利用靜電作用使CDs和MnO2NSs形成共軛體系發(fā)生FRET，使CDs的熒光猝滅，加入E.coli后，發(fā)生酶聯(lián)氧化還原反應(yīng)消耗MnO2NSs，使熒光恢復(fù)，以“OFF-ON”熒光模式實(shí)現(xiàn)E.coli的測(cè)定，線性范圍為102～109CFU/mL，LOD為50 CFU/mL。磁性捕獲可很好地提高檢測(cè)性能，崔方超[56]利用Apt修飾Fe3O4、Apt的互補(bǔ)DNA鏈（complementary DNA，cDNA）修飾CDs，F(xiàn)e3O4-Apt和CDs-cDNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)相連，產(chǎn)生FRET，猝滅CDs的熒光，加入的S.aureus優(yōu)先與Fe3O4-Apt連接，進(jìn)而釋放CDs-cDNA，并使其熒光恢復(fù)，以“ON-OFF-ON”的熒光模式檢測(cè)S.aureus，LOD低至8 CFU/mL。

2.1.3 SERS檢測(cè)

SERS是一種基于電磁和化學(xué)增強(qiáng)以放大拉曼信號(hào)的方法，具有識(shí)別能力強(qiáng)、響應(yīng)速度快、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，在食源性致病菌的檢測(cè)中被應(yīng)用廣泛。SERS信號(hào)與SERS活性底物和“熱點(diǎn)”有關(guān)，越來(lái)越多結(jié)構(gòu)復(fù)雜且性能優(yōu)異的多組分納米材料用于SERS檢測(cè)，因?yàn)榧{米結(jié)構(gòu)的局部表面等離子體電磁增強(qiáng)可作為增強(qiáng)SERS信號(hào)的“熱點(diǎn)”。此外，SERS強(qiáng)度可以通過(guò)改變納米材料的組成成分、表面形態(tài)和顆粒尺寸進(jìn)行調(diào)節(jié)[58-59]。

SERS檢測(cè)廣泛用于食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)中，如圖4A所示，Li Yuzhi等[60]制備了裂縫八面體和小突起兩種形狀的新型SERS標(biāo)簽，同時(shí)檢測(cè)E.coliO157:H7和S.typhimurium，裂縫八面體狀的SERS標(biāo)簽由E.coliO157:H7 Apt固定的5,5’-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）組成，小突起狀SERS標(biāo)簽由S.typhimuriumApt固定的2-巰基苯甲酸（thiosalicylic acid，MBA）組成，兩個(gè)SERS標(biāo)簽吸附在AuNRs表面，創(chuàng)造了更多的熱點(diǎn)增強(qiáng)拉曼信號(hào)，在加入E.coliO157:H7和S.typhimurium后，兩個(gè)SERS標(biāo)簽與對(duì)應(yīng)E.coliO157:H7和S.typhimurium的抗體修飾的MNPs形成夾心復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)，兩種菌的線性濃度范圍為10～106CFU/mL，LOD低于8 CFU/mL。此外，Duan Nuo等[61]構(gòu)建了基于Au-Ag核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的SERS納米傳感器檢測(cè)S.typhimurium。如圖4B所示，將S.typhimurium的Apt1修飾在Au-Ag核殼結(jié)構(gòu)納米粒子表面作為捕獲探針和SERS“熱點(diǎn)”，Apt2修飾在羅丹明X（X-rhodamine，ROX）上作為SERS信號(hào)元素，加入S.typhimurium后，由于S.typhimurium與Apt1和Apt2的高度親和力，形成了Au-Ag-Apt1-S.typhimurium-Apt2-ROX夾心復(fù)合物，夾心復(fù)合物濃度隨著S.typhimurium濃度的增大而增大，相應(yīng)地，SERS強(qiáng)度增大，由此實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測(cè)，線性濃度范圍為1.5×10～1.5×106CFU/mL，LOD為15 CFU/mL。

圖4 SERS檢測(cè)原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of the principle of SERS detection

2.1.4 電化學(xué)測(cè)定

電化學(xué)測(cè)定是指利用目標(biāo)物的物理化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)電參數(shù)發(fā)生變化，將目標(biāo)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)的方法。電化學(xué)納米傳感器因其快速靈敏、便攜快捷及可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)在檢測(cè)食源性致病菌方面深受青睞[62-63]，其中安培測(cè)定和伏安測(cè)定的原理是檢測(cè)物使電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生信號(hào)，其中，伏安測(cè)定包括差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）和循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）等[64]（圖5）。

圖5 電化學(xué)檢測(cè)原理示意圖Fig.5 Schematic diagram of the principle of electrochemical detection

Appaturi及其團(tuán)隊(duì)[64]研發(fā)出一種基于還原氧化石墨烯-碳納米管（reduced graphite oxide-carbon nanotubes，rGO-CNT）復(fù)合材料的生物傳感器無(wú)標(biāo)記檢測(cè)Salmonella。其中rGO-CNT具有良好的氧化還原性、電導(dǎo)率和電子轉(zhuǎn)移性，加入Salmonella后，細(xì)胞膜上的負(fù)電荷阻礙電子轉(zhuǎn)移到電極表面，從而經(jīng)菌體細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)移到電解質(zhì)，電流密度隨著Salmonella濃度的增加而增加，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)DPV檢測(cè)Salmonella，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器與濃度為10～108CFU/mL的Salmonella線性相關(guān)，LOD為10 CFU/mL，檢測(cè)可在10 min內(nèi)完成。Dong Xiuxiu等[65]利用AuNPs和硫化鎘量子點(diǎn)（CdS quantum dots，CdS QDs）修飾ZnO NPs，構(gòu)建了一個(gè)高性能的PEC電極檢測(cè)E.coli，Au NPs通過(guò)局域表面等離子體共振效應(yīng)促進(jìn)光的吸收，進(jìn)而促進(jìn)光誘導(dǎo)電荷的分離和輸運(yùn)，ZnO NPs和CdS QDs吸收光子并產(chǎn)生電子-空穴對(duì)，高能電子通過(guò)Au NPs從CdS QDs轉(zhuǎn)移到ZnO NPs中，因而CdS QDs-AuNPs-ZnO結(jié)構(gòu)的協(xié)同效應(yīng)可顯著提高光電子流響應(yīng)，但CdS QDs-AuNPs-ZnO NPs經(jīng)E.coli的Apt修飾后，會(huì)阻礙其電子的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致光電流強(qiáng)度減弱，進(jìn)而光電流強(qiáng)度隨著E.coli的濃度增加而降低，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)PEC檢測(cè)E.coli，線性濃度范圍為10～107CFU/mL，LOD為1.125 CFU/mL。此外，Jiang Hai等[66]開(kāi)發(fā)了一種基于MoS2NSs的電化學(xué)Apt傳感器檢測(cè)海產(chǎn)品中的V.parahaemolyticus，MoS2NSs能有效提高電極的電導(dǎo)率，增加氧化還原反應(yīng)的峰值電流，檢測(cè)耗時(shí)少且靈敏度高，動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為10～106CFU/mL，LOD為5.74 CFU/mL。

2.2 雙模式

基于納米生物傳感器的雙模式檢測(cè)是檢測(cè)信號(hào)以比色、熒光、電化學(xué)、SERS等其中兩種信號(hào)輸出的方法，包括熒光和紫外雙模式、SERS和紫外雙模式、熒光和電化學(xué)雙模式等（圖6A），其中熒光和紫外雙模式應(yīng)用較為廣泛（圖6B），相比單模式檢測(cè)，雙模式檢測(cè)能避免假陽(yáng)性，增強(qiáng)可信度。

圖6 雙模式檢測(cè)原理示意圖Fig.6 Schematic diagram of the principle of dual-mode detection

Ouyang Qin 團(tuán)隊(duì)[67]設(shè)計(jì)了一種納米探針檢測(cè)S.aureus（圖6B），Apt-MNPs作為捕獲信號(hào)探針，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和cDNA修飾的上轉(zhuǎn)化納米粒子（HRP-UCNPs-cDNA）作為比色信號(hào)探針，Apt-MNPs與HRP-UCNPs-cDNA雜交發(fā)生FRET使UCNPs的熒光猝滅，當(dāng)S.aureus存在時(shí)，HRPUCNPs-cDNA從HRP-UCNPs-cDNA-Apt-MNPs復(fù)合物中解離，導(dǎo)致UCNPs的熒光恢復(fù)，同時(shí)利用HRP氧化TMB實(shí)現(xiàn)催化比色，實(shí)現(xiàn)了比色熒光雙模式檢測(cè)，與5.6×10～5.6×106CFU/mL的S.aureus具有良好的線性關(guān)系，紫外的LOD為22 CFU/mL，熒光的LOD低至20 CFU/mL。

Wu Zhengzong[68]利用Pt修飾的金納米棒（AuNRs-Pt）是具有過(guò)氧化性的熒光猝滅劑的原理設(shè)計(jì)了一種熒光和比色雙模式傳感器測(cè)定V.parahaemolyticus?；贏uNR-Pt-Apt和UNPs-cDNA雜交體系發(fā)生IFE使UNPscDNA的熒光猝滅，加入V.parahaemolyticus反應(yīng)并離心后，上清液中UNPs-cDNA從雜交復(fù)合物中部分解離，阻斷IFE使熒光恢復(fù)，同時(shí)，沉淀中加入TMB后，AuNR-Pt-Apt能催化TMB生成oxTMB，傳感器發(fā)生顏色變化，恢復(fù)的熒光強(qiáng)度和催化的紫外光光譜強(qiáng)度都隨著V.parahaemolyticus的濃度增大而增強(qiáng)。同時(shí)，熒光檢測(cè)與濃度范圍為5×10～107CFU/mL的V.parahaemolyticus具有良好的線性關(guān)系，LOD低至10 CFU/mL，比色檢測(cè)與濃度范圍為102～106CFU/mL的V.parahaemolyticus線性相關(guān)，LOD為75 CFU/mL。此外，Wei Wenting等[69]利用基于鉑離子摻雜的釕金屬有機(jī)結(jié)構(gòu)（Pb2+-Ru-MOF-Apt）產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光和DPV兩種電化學(xué)信號(hào)雙模式檢測(cè)V.parahaemolyticus，重要的是電子可以很容易地在電極和信號(hào)元素之間交換，而不受V.parahaemolyticus的阻礙，LOD為1.7 CFU/mL，此種雙模式檢測(cè)提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

Dou Leina及團(tuán)隊(duì)[70]成功合成了新的免疫探針檢測(cè)E.coliO157:H7，利用Fe3O4、聚多巴胺（polydopamine，PDA）及Pt組成的納米酶介導(dǎo)了一種無(wú)標(biāo)記和雙模式的測(cè)流免疫分析。同時(shí)，F(xiàn)e3O4可實(shí)現(xiàn)快速磁性捕獲和分離，PDA可很快吸附在E.coliO157:H7表面實(shí)現(xiàn)直接比色檢測(cè)，Pt納米酶的催化性實(shí)現(xiàn)了催化比色檢測(cè)，直接比色和催化比色的LOD分別低至102 CFU/mL和10 CFU/mL。此外，王成男[71]基于食源性致病菌的銅離子耐受機(jī)制制備了銅離子傳感器檢測(cè)E.coli。銅離子能夠催化氧化無(wú)色無(wú)熒光的OPD為黃色且有熒光發(fā)射的OPD氧化產(chǎn)物，加入E.coli后，E.coli后與銅離子相互作用影響其催化性能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)紫外熒光雙模式檢測(cè)E.coli，具有較優(yōu)的靈敏度和較強(qiáng)的抗干擾性，紫外和熒光檢測(cè)的LOD分別為100 CFU/mL和44 CFU/mL，皆與濃度范圍為102～106CFU/mL的E.coli具有良好的線性關(guān)系。

2.3 多模式

基于納米生物傳感器的多模式檢測(cè)是檢測(cè)信號(hào)以比色、熒光、電化學(xué)、SERS等其中3 種及以上模式輸出的方法（圖7）。同時(shí)，也有很多研究報(bào)道了多模式檢測(cè)包括同一模式中不同信號(hào)輸出，如比色檢測(cè)中的直接比色和催化比色，熒光檢測(cè)中的單種熒光和比率熒光，電化學(xué)檢測(cè)中的不同電參數(shù)等[72-73]。相比單模式及雙模式，多模式檢測(cè)進(jìn)一步增強(qiáng)了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，并且多模式能滿(mǎn)足不同檢測(cè)條件的需求，特別是在資源有限的環(huán)境下。

圖7 多模式檢測(cè)示意圖Fig.7 Schematic diagram of multi-mode detection

Wang Xiu等[74]提出了一種快速檢測(cè)E.coli的多模式方法，是一種基于比色-熒光-原子熒光光譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜的多模式分析。其中，用β-糖苷酶作為E.coli的指標(biāo)，4-氨基苯酚β-D-半乳糖糖苷可以被β-糖苷酶分解得到對(duì)氨基苯酚，進(jìn)一步使Ag+形成AgNPs，Ag+導(dǎo)致Cd2+從碲化鎘量子點(diǎn)（CdTe）中解離并經(jīng)結(jié)合濾膜選擇性濾過(guò)后，可以測(cè)定其原子熒光光譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜，另外，AgNPs促進(jìn)CdTe量子點(diǎn)的可視化顏色變化和熒光檢測(cè)。加入E.coli后，通過(guò)E.coli和β-糖苷酶之間的相互作用影響比色-熒光-原子熒光光譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)多模式檢測(cè)E.coli，LOD為25 CFU/mL，在實(shí)際樣中具較高的可行性。

Lu Lixia及團(tuán)隊(duì)[72]開(kāi)發(fā)了一種基于MoS2-Au納米材料的多模式免疫傳感器檢測(cè)S.typhimurium。S.typhimurium能夠增強(qiáng)免疫M(jìn)oS2-Au的本身顏色變化、催化活性和光熱效應(yīng)，隨著S.typhimurium濃度的增大，免疫M(jìn)oS2-Au的顏色變亮，催化TMB的顏色增強(qiáng)，反應(yīng)的光色效應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基于直接比色、催化比色和光熱分析的多模式檢測(cè)，3 種檢測(cè)的LOD分別測(cè)定為103、102CFU/mL和102CFU/mL。通過(guò)催化比色和光熱分析獲得的檢測(cè)靈敏度比直接視覺(jué)檢測(cè)的高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。包括樣品前處理在內(nèi)，該模式的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)25 min，進(jìn)一步證實(shí)多模式檢測(cè)方法耗時(shí)少、可靠和準(zhǔn)確。

類(lèi)似的，Zhang Lu及團(tuán)隊(duì)[73]開(kāi)發(fā)了一種基于普魯士藍(lán)（Prussian blue，PB）和AuNPs復(fù)合物的多模式方法檢測(cè)S.typhimurium。通過(guò)加入S.typhimurium形成免疫夾心復(fù)合物，使免疫PB-AuNPs的固有藍(lán)色發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)直接比色檢測(cè)，通過(guò)溫度升高可以實(shí)現(xiàn)光熱檢測(cè)，催化對(duì)應(yīng)底物實(shí)現(xiàn)催化比色。在最優(yōu)條件下，直接比色的LOD為102CFU/mL，光熱反應(yīng)和催化比色具有更低的LOD，低至10 CFU/mL，進(jìn)一步凸顯多模式檢測(cè)在可靠性、特異性、可重復(fù)性和抗干擾性方面具有明顯的提升。

3 結(jié)語(yǔ)

食源性致病菌污染的防患仍然需要許多準(zhǔn)確快捷的方法實(shí)現(xiàn)早期檢測(cè)，相比傳統(tǒng)方法，基于納米生物傳感器的方法是一個(gè)良好的轉(zhuǎn)變，尤其是在檢測(cè)性能、操作過(guò)程及材料節(jié)省等方面。比色檢測(cè)可以直接可視化，熒光檢測(cè)更加靈敏、SERS檢測(cè)快速，電化學(xué)檢測(cè)響應(yīng)快。檢測(cè)方法通過(guò)便攜光學(xué)設(shè)備、測(cè)流免疫試紙條、微流控芯片等技術(shù)結(jié)合智能手機(jī)的使用可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。綜合比較之下，多模式優(yōu)于雙模式，雙模式優(yōu)于單模式，尤其是在結(jié)果的可信度和檢測(cè)條件方面。同時(shí)，一個(gè)優(yōu)異的檢測(cè)食源性致病菌的納米生物傳感器應(yīng)具有如下優(yōu)勢(shì)：靈敏度高、選擇性強(qiáng)、抗干擾性、簡(jiǎn)易便攜、可重復(fù)利用、可實(shí)時(shí)檢測(cè)、低成本、較短反應(yīng)時(shí)間和較低試劑用量（痕量檢測(cè)）。

然而，食源性致病菌引發(fā)的食源性疾病仍是一個(gè)重大食品安全問(wèn)題，對(duì)其檢測(cè)方法在檢測(cè)性能和制備過(guò)程方面的要求越來(lái)越高，為此，對(duì)納米生物傳感器在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用提出如下展望：1）對(duì)樣品進(jìn)行快速有效的前處理，目前大多生物傳感器都是基于菌體的純培養(yǎng)，而實(shí)際樣中的菌體濃縮與分離效果直接影響到檢測(cè)靈敏度，因此，發(fā)展更為快速有效的前處理技術(shù)以提高靈敏度將成為亟待突破的難點(diǎn)；2）制備多功能的納米材料復(fù)合體系，提高多模式檢測(cè)的靈敏度，減少條件的限制，同時(shí)制備具有較窄的發(fā)光特性的納米材料，避免不同信號(hào)之間的相互影響；3）優(yōu)化納米生物傳感器中的識(shí)別元素，避免識(shí)別元素與非靶標(biāo)檢測(cè)菌的非特異結(jié)合；4）發(fā)展實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，發(fā)展各種信號(hào)便攜設(shè)備實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，同時(shí)，結(jié)合編程軟件對(duì)各種信號(hào)進(jìn)行智能算法，通過(guò)無(wú)線通信傳輸，實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)。