崔雁娜郝貴杰丁蘭鄭夢蘭王雨辰涂金玉孫家棟林鋒

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/ 浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室/湖州市水產(chǎn)品品質(zhì)提升與加工技術(shù)重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001；2.安吉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 湖州313300；3.安吉縣梅溪鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江 湖州 313306；4.安吉梅溪草灘家庭農(nóng)場，浙江 湖州 313306；5.安吉梅溪孫傅家庭農(nóng)場，浙江 湖州 313306)

前言

馬口魚(Opsariichthys bidens)俗名花杈魚、桃花魚、山鳡等，雜食偏肉食性淡水魚類，溪流中多見，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)及經(jīng)濟價值高，投苗養(yǎng)殖當(dāng)年即可上市[1]。2017年浙江省淡水水產(chǎn)研究所突破了馬口魚種苗規(guī)?；庇P(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)催產(chǎn)率86.87%、受精率82.73%、出苗率80.58%，獲仔魚20萬尾，育成平均規(guī)格4.4cm的夏花魚種12.9萬尾[2]。馬口魚人工規(guī)?；庇苍诓粩鄬崿F(xiàn)突破[3]：人工繁育試驗，進行人工催產(chǎn)，人工授精，親魚優(yōu)選，親魚強化培育等方面都取得了飛速發(fā)展。很多學(xué)者對不同的水體馬口魚養(yǎng)殖模式也進行了研究，包括池塘、磚砌水泥池、塑料膜鋪底土池、一般土池、稻田輪養(yǎng)、河水土池、廢棄鰻池、平原河流水、室內(nèi)工廠化、跑道養(yǎng)殖等[4]，各種不同水體養(yǎng)殖的馬口魚所耗費的成本及獲得的收益有很大差別，但是相比其他魚類，經(jīng)濟效益依然非常客觀。然而，關(guān)于馬口魚體內(nèi)腸道菌群的研究還比較少見。魚類的腸道菌群在魚類生長過程中的營養(yǎng)供應(yīng)、代謝穩(wěn)態(tài)和免疫防疫中都會起到重要的作用[5]。魚類的微生物群可以是多樣的，包括原生動物、真菌、酵母、病毒以及細菌和古菌[6]。雖然原生動物、真菌、酵母、病毒以及細菌和古菌在魚類生長中都有不同程度的貢獻，但細菌是魚類腸道的主要微生物群[7]。因此，本課題組基于16SrRNA檢測對2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚體內(nèi)腸道菌群進行了研究，以期對馬口魚保健及用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2022年4月底在浙江湖州某家庭農(nóng)場放水花苗，放養(yǎng)密度7萬尾·667m-2。放苗之前池塘已經(jīng)清塘、曬干、消毒。分別在2022年6月底、9月底和2023年1月底進行采樣檢測，樣品分別對應(yīng)2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚。

選取活力好、無外傷，平行樣品大小相近的2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚各25尾，對取樣工具消毒后，分別取樣并測體重、體長、腸重、肝重，并將馬口魚腸道放置于-80℃保存待測腸道微生物。

1.2 儀器設(shè)備

PCR儀，ABI GeneAmp?9700型(美國ABI公司)；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)；分析天平(SECURA125-1CN/SQP)，德國Sartorius科學(xué)儀器有限公司；多功能水質(zhì)測定儀HQ40d(美國哈希)。

1.3 試驗方法

1.3.1 水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)檢測

對2月齡、5月齡、9月齡馬口魚養(yǎng)殖水質(zhì)的pH、水溫、溶解氧進行了檢測。

1.3.2 生長性能測定

取2月齡、5月齡、9月齡馬口魚樣品各25尾，測量其體重、體長，解剖后取內(nèi)臟和肝臟，稱重，計算各組特定生長率(specific growth rate，SGR)、肥滿度(condition factor，CF)、肝體指數(shù)(hepatopancreas somatic indices，HSI)、臟體指數(shù)(Visceral SensitivityIndex，VSI)。各指標(biāo)計算公式：

SGR(%·d-1)=100×[(lnW2-lnW1)/(t2-t1)]

(1)

CF(%)=100×W/L3

(2)

HSI(%)=100×W肝臟/W

(3)

VSI(%)=100×W內(nèi)臟/W

(4)

式中，W1和W2分別為t1和t2時的體重，g；W肝臟表示肝臟重，g；W內(nèi)臟表示內(nèi)臟重，g；W表示對應(yīng)的體重，g；L表示體長，cm。

1.3.3 腸道微生物的檢測

采用以2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道微生物DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，采用515F-907R引物對16S rRNA基因進行擴增，并用Illumina Hiseq 2500測序平臺測序獲得原始數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

需要根據(jù)barcode得到所有樣品的有效序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2；用Usearch軟件和gold數(shù)據(jù)庫，采用denovo和reference結(jié)合的方式去除嵌合體。使用軟件：Trimmomatic、FLASH、Usearch、qiime、perl程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬口魚養(yǎng)殖水質(zhì)檢測

對2月齡、5月齡、9月齡馬口魚養(yǎng)殖水質(zhì)的pH、水溫、溶解氧進行了檢測，檢測結(jié)果見表1。3組樣品pH值、養(yǎng)殖水溫均有顯著性差異；2月齡、5月齡馬口魚的溶解氧無顯著性差異，5月齡、9月齡馬口魚溶解氧存在顯著性差異；2月齡、9月齡馬口魚的溶解氧存在顯著性差異。

表1 3組馬口魚養(yǎng)殖水質(zhì)情況

2.2 馬口魚生長性能測定

2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的生長性能檢測結(jié)果見表2。從體重來看，2月齡、5月齡、9月齡馬口魚呈遞增關(guān)系，但2月齡、5月齡存在顯著性差異，5月齡、9月齡無顯著性差異；從體長來看，2月齡、5月齡、9月齡馬口魚也呈遞增關(guān)系，2月齡、5月齡、9月齡馬口魚之間均存在顯著性差異；從肥滿度來看，5月齡與2月齡和9月齡均存在顯著性差異，2月齡和9月齡無顯著性差異，2月齡、5月齡、9月齡呈先增長后下降關(guān)系。

2.3 樣品腸道微生物測序質(zhì)量分析

對2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道微生物16S rRNA 基因測序數(shù)據(jù)進行雙端拼接、質(zhì)控以及嵌合體過濾后，共獲得有效序列1837607條。序列長度范圍為1～400bp，其中99.5%集中在361～380bp。3組樣品的覆蓋度均達到了0.999以上，表明檢測的樣本量具有代表性。從圖1也可以得出同樣的結(jié)論。物種累積曲線是用于描述隨著樣本量的加大物種增加的狀況，是調(diào)查樣本的物種組成和預(yù)測樣本中物種豐度的有效工具，在生物多樣性和群落調(diào)查中，被廣泛用于樣本量是否充分的判斷以及物種豐富度的估計。

表2 馬口魚不同生長階段生長性能

圖1 2月齡、5月齡、9月齡馬口魚腸道菌群的物種累計曲線

2.4 樣品腸道微生物多樣性分析

2月齡、5月齡、9月齡馬口魚OTU特征序列韋恩圖見圖2。共有OTU 43個，占總數(shù)的2.46%；2月齡、5月齡、9月齡馬口魚獨有OTU分別為886個、18個、552個。2月齡、5月齡共有OTU 56個，占兩者總數(shù)的4.56%，占各自總數(shù)的4.66%、68.3%；2月齡、9月齡共有OTU 302個，占兩者總數(shù)的17.4%，占各自總數(shù)的25.1%、36.3%；5月齡、9月齡共有OTU 51個，占兩者總數(shù)的5.91%，占各自總數(shù)的62.2%、6.13%?？梢?，2月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群相似度更高。

圖2 馬口魚不同生長階段特征序列韋恩圖

2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群多樣性情況見表3。從表3可以看出，描述物種豐富度的指標(biāo)中，從Ace來看，2月齡、5月齡存在顯著性差異，而9月齡和2月齡、5月齡均無顯著性差異；從Chaol指數(shù)來看，2月齡、5月齡存在顯著性差異，2月齡、9月齡無顯著性差異，5月齡、9月齡存在顯著性差異。因算法不同，樣品之間的顯著性差異有細微差別。但2月齡、5月齡存在顯著性差異，2月齡、9月齡無顯著性差異是可以確定的。

Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。從表3可以看出，無論根據(jù)Simpson指數(shù)值還是Shannon指數(shù)值，群落多樣性最高的樣品是2月齡，其次是9月齡，最低的是5月齡。2月齡與5月齡存在顯著性差異，5月齡與9月齡存在顯著性差異，2月齡與9月齡無顯著性差異。

表3 馬口魚不同生長階段腸道菌群多樣性統(tǒng)計

2.5 樣品腸道菌群組成分析

對3組樣品進行群落結(jié)構(gòu)分析后，總共發(fā)現(xiàn)26個屬，見圖3。2月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenaceae)20.7%、氣單胞菌屬(Aeromonas)29.5%、鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)7.67%，醋酸桿菌屬(Cetobacterium)7.47%、足桿菌屬(Pedobacter)4.61%、假單胞菌屬(Pseudomonas)2.36%、未分類的桿菌屬(Bacilli_unclassified)3.50%、羅斯氏菌屬(Romboutsia)6.71%、Chloroplast4.85%、未分類的細菌屬(Bacteria_unclassified)2.76%、副梭菌屬(Paraclostridium)1.89%、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)1.19%、Candidatus1.17%、其他(Others)13.1%。

5月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為氣單胞菌屬(Aeromonas)41.6%、支原體屬(Mycoplasmataceae)32.9%、鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)24.5%。

9月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenaceae)46.2%、足桿菌屬(Pedobacter)10.8%、假單胞菌屬(Pseudomonas)6.95%、未分類桿菌屬(Bacilli_unclassified)3.81%、Chloroplast1.62%、不動桿菌屬(Acinetobacter)4.35%、丙酸桿菌屬(Propionibacteriaceae)3.55%、未分類的細菌屬(Bacteria_unclassified)1.33%、明串珠菌屬(Trichococcus)3.24%、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)1.01%、其他(Others)16.3%。

圖3 2月齡、5月齡、9月齡屬水平下細菌相對豐度

從2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群數(shù)據(jù)來看，馬口魚在2～5個月生長過程中，以氣單胞菌屬(Aeromonas)、鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)為主導(dǎo)菌屬，9個月時這2種菌屬幾乎消失，出現(xiàn)了更多種類的其他菌屬。通過PERMANOVA分析，發(fā)現(xiàn)有顯著性差異的菌屬有產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenaceae)P<0.01，Enterobacterales_unclassified P<0.05，MesotogaP<0.01，Methyloparacoccus P<0.05，足桿菌屬(Pedobacter)P<0.01，PropioniciclavaP<0.01，假單胞菌屬(Pseudomonas)P<0.01，羅斯氏菌屬(Romboutsia)P<0.05，Spirochaetaceae_uncultured P<0.05.對3組樣品進行群落結(jié)構(gòu)分析后，總共發(fā)現(xiàn)7個門。見圖4。

圖4 2月齡、5月齡、9月齡門水平下細菌相對豐度

2月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為變形菌門(Proteobacteria)55.6%、厚壁菌門(Firmicutes)17.6%、梭桿菌門(Fusobacteriota)7.78%、擬桿菌門(Bacteroidota)6.36%、放線菌門(Actinobacteriota)1.89%、藍菌門(Cyanobacteria)4.89%、未分類的細菌(Bacteria_unclassified)2.76%、Synergistota1.18%、其他(Others)2.02%。

5月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為變形菌門(Proteobacteria)41.9%、厚壁菌門(Firmicutes)33.2%、梭桿菌門(Fusobacteriota)24.5%。

9月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為變形菌門(Proteobacteria)63.1%、厚壁菌門(Firmicutes)10.1%、擬桿菌門(Bacteroidota)13.4%、放線菌門(Actinobacteriota)8.11%、藍菌門(Cyanobacteria)1.66%、未分類的細菌(Bacteria_unclassified)1.33%、其他(Others)2.15%。

從2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群數(shù)據(jù)來看，馬口魚在2～5個月的生長過程中，以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteriota)為主，占比達到81.0%～99.6%。9個月的馬口魚梭桿菌門(Fusobacteriota)消失。2月齡的馬口魚與成魚馬口魚菌門的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高度相似性。通過PERMANOVA分析，發(fā)現(xiàn)有顯著性差異的菌門有放線菌門(Actinobacteriota)P<0.05，擬桿菌門(Bacteroidota)P<0.01，PlanctomycetotaP<0.05，ThermotogotaP<0.01。

3 討論

3.1 馬口魚生長性能

本研究發(fā)現(xiàn)，2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚體重在馬口魚水花下塘后2～5個月期間迅速增長，5～9個月期間生長速度減緩，表現(xiàn)為體重2～5個月有顯著差異，5～9個月無顯著性差異；2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚之間體長均存在顯著性差異。肥滿度在2～5月齡期間上升，5～9月齡期間下降。這與塔里木裂腹魚的生長規(guī)律相同。原因是小個體的魚正處于生長階段，攝入能量主要供給身體的生長發(fā)育，肥滿度增加較快，隨著魚的生長，較大個體的魚攝入的能量除了供應(yīng)身體生長發(fā)育外，還需要儲存足夠的能量進行繁殖活動，導(dǎo)致肥滿度下降[8]。

3.2 樣品腸道微生物多樣性

無論是OTU韋恩圖還是ACE、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，都說明2月齡、9月齡馬口魚樣品的腸道菌群相似度更高。本試驗2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚飼料成分都一樣，所以不同月齡馬口魚的腸道菌群的差異性可排除飼料的影響因素。2月齡、9月齡馬口魚樣品的肥滿度也無顯著性差異，與腸道菌群的變化規(guī)律相同。養(yǎng)殖水質(zhì)也是需要考慮的因素。2月齡養(yǎng)殖水溫最高，從4個指數(shù)來看，2月齡腸道菌群菌種豐富度和多樣性也是最高的，這和Macmillan、Al-Harbi等的研究結(jié)論相同[9，10]。

3.3 樣品腸道菌群組成

無論是從屬還是門水平來看，都是2月齡、9月齡馬口魚樣品的腸道菌群相似度更高，5月齡馬口魚樣品腸道菌群物種豐富度都明顯低于2月齡、9月齡馬口魚樣品。這和樣品腸道微生物多樣性的規(guī)律相同。具體來看，2月齡和5月齡相同的菌屬是氣單胞菌屬(Aeromonas)和鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)，占比分別是37.2%、66.1%。氣單胞菌屬(Aeromonas)被鑒定為可能有助于消化的魚腸道微生物群[11]。2月齡、9月齡相同的菌屬是產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenaceae)、足桿菌屬(Pedobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Chloroplast，占比分別是32.5%、65.6%。5月齡、9月齡沒有相同的菌屬。Neuman C等對鮭魚的研究發(fā)現(xiàn)了季節(jié)性水溫變化與腸道微生物組成變化之間的關(guān)系。這項研究表明，溫度升高(高達21℃)與乳酸菌(LAB)和不動桿菌屬(acinetoobactspp)的消失有關(guān)[12]。2月齡和5月齡馬口魚樣品養(yǎng)殖水溫均超過21℃，未發(fā)現(xiàn)乳酸菌(LAB)和不動桿菌屬(acinetoobactspp)，9月齡馬口魚養(yǎng)殖水溫降到10℃以下時，出現(xiàn)了不動桿菌屬(acinetoobactspp)，這與Neuman C等的研究結(jié)論相同。

2月齡和5月齡相同的門是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteriota)，分別占比81.1%、99.6%；2月齡和9月齡相同的門是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)、藍菌門(Cyanobacteria)，分別占比86.3%、96.4%；5月齡和9月齡相同的門是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)，分別占比75.1%、73.2%。研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)是魚類腸道菌群中最常見的菌門[13]。

4 結(jié)論

魚類的腸道微生物群負責(zé)關(guān)鍵的生理功能，有助于消化，能夠影響魚類的營養(yǎng)、生長、繁殖、總體種群動態(tài)以及宿主對疾病的抵抗力[14]。也有文獻證明，在水生動物中，腸道微生物負責(zé)消化藻細胞，產(chǎn)生氨基酸和分泌抑制性化合物，以防止細菌病原體對腸道的定殖[15]。以上這些功能都有助于維持宿主的健康。鑒于魚類所面臨的環(huán)境變化，尤其是鑒于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的增長和氣候變化導(dǎo)致的養(yǎng)殖水溫度上升，了解其組成及其在健康和疾病方面的確切功能作用至關(guān)重要。

當(dāng)喂養(yǎng)飼料不發(fā)生變化時，養(yǎng)殖水溫是影響馬口魚菌屬的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)水溫由29.0℃降到24.5℃時，存在共同的菌屬氣單胞菌屬(Aeromonas)和鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)；當(dāng)水溫由24.5℃降到6.61℃時，共同的菌屬消失，但是菌屬種類增加。雖然水溫由24.5℃降到6.61℃時溶解氧也發(fā)生了顯著性差異，但還未查到相關(guān)文獻表明，溶解氧的變化是導(dǎo)致菌屬變化的原因。

馬口魚腸道菌群豐富度和多樣性和馬口魚的肥滿度變化規(guī)律相同。2月齡和9月齡的馬口魚腸道菌群豐富度和多樣性都無顯著性差異。但2月齡和9月齡的馬口魚腸道菌群豐富度和多樣性與5個月齡的馬口魚均存在顯著性差異。2月齡的馬口魚和9月齡的馬口魚肥滿度無顯著性差異，2月齡和9月齡的馬口魚肥滿度與5月齡的馬口魚均存在顯著性差異。

不同生長階段馬口魚腸道菌群與養(yǎng)殖水溫、溶解氧、肥滿度的關(guān)系可為養(yǎng)殖過程進行養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。但關(guān)于溶解氧、肥滿度與馬口魚生長過程中菌群變化的機理還不夠明確，還需進行深入研究。