鄭劉芳，劉清秀，李娟

(1.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科，重慶 405425；2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院產(chǎn)科，四川 成都 610091)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠前糖代謝正常或有潛在糖耐量減退，但在妊娠期才出現(xiàn)或確診一種糖尿病，在糖尿病孕婦中占比較大，高達80%，可明顯增加先兆子癇、流產(chǎn)、早產(chǎn)、難產(chǎn)、巨大胎兒及畸形等妊娠不良結(jié)局發(fā)生率[1-2]。目前，國內(nèi)大多數(shù)城市均開展了GDM篩查發(fā)現(xiàn)，GDM發(fā)生率日漸升高，娜仁其木格等[3]學(xué)者針對中國妊娠期糖尿病患病率進行Meta分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)妊娠期糖尿病患病率各不相同，以華北地區(qū)最高，約13%。但其發(fā)病機制仍不十分明確，可能與肥胖、遺傳、炎性及脂肪細胞因子等有關(guān)[4]。2007年，“人類微生物組計劃”被提出，隨后隨研究深入發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與機體肥胖、炎癥調(diào)控及糖尿病等多種代謝性疾病密切相關(guān)[5-6]，但其與GDM之間關(guān)系的研究較少。本研究以100例妊娠期糖尿病患者、100名正常妊娠人群和100名健康體檢女性作為研究對象，探討妊娠期糖尿病腸道變化規(guī)律，并分析其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月至2018年6月于重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科收治的妊娠期糖尿病患者100例作為糖尿病妊娠組。妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2011年ADA指南[7]：孕24～28周清晨空腹口服75 g葡萄糖后檢測后續(xù)任一項達標(biāo)即可，空腹血糖≥5.1 mmol /L，餐后1 h血糖≥10.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥8.5 mmol /L；所有研究對象確診后均給予相應(yīng)干預(yù)治療。排除：(1)既往妊娠期糖尿病病史；(2)孕前糖尿病、糖耐量異常、多囊卵巢綜合征及慢性腸道疾病確診史；(3)合并嚴重內(nèi)科疾病者；(4)近1月內(nèi)使用過抗生素或微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等影響腸道微生態(tài)的藥物者。選取同期年齡、孕周、孕次及產(chǎn)次等一般資料與之匹配的100名正常妊娠人群和100名健康體檢女性作為正常妊娠組和對照組。本研究所有研究對象及家屬均簽署知情同意書，且通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 入組但未給予任何治療之前，收集糖尿病妊娠組空腹外周血及糞便。(1)空腹外周血收集。抽取空腹外周血5 mL于黃色血清管中，1 h內(nèi)送檢，3 000 rpm離心10 min，取上清進行血糖及胰島素檢測；(2)糞便標(biāo)本收集。用滅菌棉簽取早上自然排出新鮮糞便30～50 g于糞便采集專用管中，并于30 min內(nèi)送檢。正常妊娠組和對照組糞便采集方法同上。

1.2.2 血糖相關(guān)指標(biāo)檢測 本研究中血糖相關(guān)指標(biāo)主要包括空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)。其中FBG采用美國雅培c1600全自動生化儀，F(xiàn)INS采用德國羅氏E160電化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.2.3 腸道菌群檢測 (1)提取糞便DNA。采用糞便DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)進行檢測，具體步驟如下：取20 g糞便與1.4 mL GSL緩沖液混合后置于70 ℃溫浴5 min，后于震蕩儀上振蕩15 s，后以12 000 rpm離心1 min，棄上清，加入15 μL蛋白酶proteinase K和200 μL GB緩沖液，后70 ℃溫浴10 min，再加無水乙醇沉淀DNA，最后50 μL用TB洗脫緩沖液洗脫DNA過柱。(2)DNA質(zhì)量檢測。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測上述DNA濃度，當(dāng)A260/A280比值為1.8～2.0即為合格，本研究所有DNA提取物均合格。(3)糞便細菌通用16SrDNA基因PCR擴增及文庫構(gòu)建：采用糞便細菌通用16SrDNA V4區(qū)通用引物進行PCR擴增，后將PCR擴增產(chǎn)物純化后連接pGEM-T Easy Vector，后將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至宿主菌，后將轉(zhuǎn)化子涂在SOB/氨芐青霉素平板上(含IPGT和X-Gal)，過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆送深圳華大基因公司進行測序。

1.2.4 觀察指標(biāo) 收集糖尿病妊娠組FBG和FINS，并計算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance,IR)=FBG×FINS/22.5；收集各組腸道菌群物種及優(yōu)勢菌群，并計算其比例；收集各組妊娠不良結(jié)局情況，包括先兆子癇、流產(chǎn)、早產(chǎn)、難產(chǎn)、巨大胎兒及胎兒器官發(fā)育異常等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組腸道菌群中優(yōu)勢菌群比例比較

本研究共鑒定出9門屬腸道內(nèi)細菌，各組均以厚壁菌門、擬桿菌菌門、變形菌門和放線菌門為主，3組腸道菌群種各優(yōu)勢菌門屬比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 血糖相關(guān)指標(biāo)與腸道菌群優(yōu)勢菌門屬的關(guān)系

經(jīng)Spearman相關(guān)分析，F(xiàn)BG、FINS和IR與厚壁菌門和放線菌門均呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，而FBG、FINS和IR與擬桿菌菌門和變形菌門呈明顯負相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.3 各組妊娠不良結(jié)局情況比較

與正常妊娠組比較，糖尿病妊娠組妊娠不良結(jié)局總發(fā)生率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 3組腸道菌群優(yōu)勢菌群比例比較

*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與正常妊娠組相比。

表2 血糖相關(guān)指標(biāo)與腸道菌群優(yōu)勢菌門屬的關(guān)系

表3 3組妊娠不良結(jié)局情況比較[n(%)]

2.4 妊娠不良結(jié)局與腸道菌群優(yōu)勢菌門屬的關(guān)系

與正常妊娠結(jié)局組比較，不良結(jié)局發(fā)生組腸道菌群中厚壁菌門和放線菌門比例明顯升高，而擬桿菌菌門、變形菌門和其它菌門比例則明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 妊娠不良結(jié)局與腸道菌群優(yōu)勢菌門屬的關(guān)系

3 討論

妊娠期女性激素、免疫、代謝等均可發(fā)生一系列變化，包括體重增加、血糖、瘦素、胰島素及膽固醇等水平增高，甚至出現(xiàn)嚴重胰島素抵抗，最終導(dǎo)致GDM發(fā)生[8-9]。 腸道菌群是指寄居在人體胃腸道內(nèi)，從出生即開始建立形成，并隨著生長發(fā)育而不斷完善的正常菌群；至今為止，共發(fā)現(xiàn)1014個微生物，是人體細胞總數(shù)的10倍，以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門和梭桿菌門等6種優(yōu)勢菌群為代表[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)、維生素B及維生素K等營養(yǎng)物質(zhì)，與機體代謝、能量平衡及免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SCFA可調(diào)控胰島β細胞分泌抗菌肽分泌，提示腸道菌群可通過直接影響胰島免疫環(huán)境直接參與糖尿病的發(fā)生[13]。但關(guān)于妊娠期糖尿病腸道菌群變化及臨床價值探討較少。

在本研究中，共檢出9門屬腸道內(nèi)細菌，其中厚壁菌門、擬桿菌菌門、變形菌門和放線菌門構(gòu)成比例達90%以上，與前述結(jié)論基本一致，提示腸道菌群穩(wěn)定性好，妊娠并未造成腸道菌群結(jié)構(gòu)類型紊亂。 糖尿病妊娠組、正常妊娠組和對照組各優(yōu)勢菌門屬比例比較差異明顯，提示腸道菌群對妊娠期糖尿病有一定診斷價值。其中正常妊娠組和對照組各優(yōu)勢菌門屬比例比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這是因為妊娠期代謝機能發(fā)生變化，腸道菌群構(gòu)成及比例也隨之改變[14]。正常妊娠組和糖尿病妊娠組比較，厚壁菌門和放線菌門比例升高明顯，而擬桿菌菌門等其它菌門相對下降，其中尤以厚壁菌門比例變化明顯，這可能是因為厚壁菌門可發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生許多SCFA，通過調(diào)節(jié)胃腸道激素分泌、胰島素敏感性及糖脂代謝等參與糖尿病發(fā)生[15]；而擬桿菌菌門和變形菌門比例下降，其所抑制的TNF-α和IL-6等炎癥因子則明顯上升，使機體處于低炎癥水平，可誘發(fā)GDM發(fā)生[16]。此外，本研究經(jīng)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血糖相關(guān)指標(biāo)FBG、FINS和IR與厚壁菌門和放線菌門均呈明顯正相關(guān)，而FBG、FINS和IR與擬桿菌菌門和變形菌門呈明顯負相關(guān)，與上述觀點基本一致。在本研究中，妊娠期糖尿病患者妊娠不良結(jié)局發(fā)生率約15%，明顯高于正常妊娠者，說明妊娠期糖尿病在一定程度上可增加妊娠不良結(jié)局發(fā)生率，與國內(nèi)外結(jié)論一致。而本研究主要比較了妊娠不良結(jié)局女性與正常妊娠結(jié)局女性腸道菌群發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠結(jié)局組比較，不良結(jié)局發(fā)生組腸道菌群中厚壁菌門和放線菌門比例明顯升高，而擬桿菌菌門、變形菌門和其它菌門比例則明顯下降，提示腸道菌群變化在妊娠期糖尿病發(fā)生中占有一定地位，其中厚壁菌門和放線菌比例升高可增加妊娠期糖尿病發(fā)生概率，為臨床工作者預(yù)測妊娠期糖尿病患者妊娠結(jié)局提供參考。

綜上認為，與正常妊娠女性比較，妊娠期糖尿病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)及比例改變明顯，對其診斷及妊娠不良結(jié)局預(yù)測有一定價值。樣本量及樣本收集范圍是本研究限制點，后續(xù)將擴大樣本量及收集范圍，進一步完善結(jié)論。