摘 要：目的：基于AMPK/mTOR/ULK1通路探究蝦青素對大鼠運動性骨骼肌損傷（EIMD）的影響。方法：健康雄性SD大鼠隨機分為對照組（C）、運動組（E）、蝦青素組（M）、運動+蝦青素組（EM）、運動+AICAR（5-氨基-1-核糖基咪唑-4-甲酰胺磷酸鹽組）組（EA）、運動+蝦青素+AICAR組（EMA）、運動＋蝦青素＋MHY1485組（EMM），每組10只。M、EM、EMA、EMM組灌胃蝦青素；C、E組灌胃大豆油；EA、EMA組注射AICAR；EMM組注射MHY1485；E、EM、EA、EMA、EMM組進(jìn)行力竭運動，其余組安靜飼養(yǎng)。運動結(jié)束后，采用HE染色觀察大鼠比目魚肌的組織病理變化；ELISA法檢測血清MDA、SOD、IL-6、IL-1β、CK和FINS含量；RT-PCR法檢測比目魚肌相關(guān)指標(biāo)的mRNA表達(dá)；Western blot法檢測比目魚肌AMPK/mTOR/ULK1自噬通路磷酸化水平及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；檢測大鼠FBG和LA水平，計算ISI和HOMA-IR；此外，通過中介效應(yīng)分析探究LA、MDA、IL-6和IL-1β在EIMD及ISI中的作用。結(jié)果：E組大鼠血清MDA、IL-6、IL-1β、CK、LA、FBG和FINS含量、HOMA-IR明顯高于C組，SOD含量和ISI明顯低于C組；大鼠比目魚肌p-AMPK Thr172、p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser555和p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)、P62基因和蛋白表達(dá)均明顯高于C組，LC3-II蛋白表達(dá)、ILC3-II/LC3-I和BCL2/BAX明顯低于C組。雖然，給力竭運動大鼠灌胃蝦青素或注射AICAR可逆轉(zhuǎn)上述改變，且與EA和EM組相比，EMA組逆轉(zhuǎn)效果更加明顯，但是，給力竭運動大鼠施加蝦青素及MHY1485的雙重干預(yù)則明顯阻斷了蝦青素對EIMD的改善作用。此外，MDA、IL-6和IL-1β在LA導(dǎo)致的EIMD及ISI下降中發(fā)揮了部分中介效應(yīng)。結(jié)論：力竭運動可造成EIMD，其發(fā)病機制涉及乳酸堆積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等，此時，胰島素抵抗增加，肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取與利用減少，這將上調(diào)骨骼肌mTOR活性，抑制自噬通量，加劇骨骼肌損傷。而蝦青素干預(yù)可調(diào)控mTOR-ULK1自噬通路以緩解EIMD，且蝦青素與AICAR的聯(lián)合作用對改善EIMD更有益。

關(guān)鍵詞：運動性骨骼肌損傷；蝦青素；自噬；中介效應(yīng)

中圖分類號：G804.2 ""文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A "文章編號：1006-2076（2024）03-0114-13

Effect of Astaxanthin on Exercise-induced Skeletal Muscle Damage in Rats through AMPK/mTOR/ULK1 Autophagy Pathway

WU Lijun1，2，WANG Jiayi1，BI Xiangyu1

1.School of P. E.， Shanxi University， Taiyuan 030006， Shanxi， China; 2. Institute for Biomedicine and Health， Shanxi University， Taiyuan 030006， Shanxi， China

Abstract：Objective： To explore the effects of astaxanthin on EIMD in rats based on the AMPK/mTOR/ULK1 pathway. Methods： Healthy male SD rats were randomly divided into a control （C） group， exercise （E） group， astaxanthin （M） group， exercise + astaxanthin （EM） group， exercise + AICAR （EA） group， exercise + astaxanthin + AICAR （EMA） group， and exercise + astaxanthin + MHY1485 （EMM） group， with 10 rats in each group. Groups M， EM， EMA， and EMM were given astaxanthin; Groups C and E were given soybean oil; Groups EA and EMA were injected with AICAR; Group EMM was injected with MHY1485; Groups E， EM， EA， EMA， and EMM proceeded with exhaustive exercise， and the other groups were fed quietly. HE staining was used to observe the pathological changes in soleus tissues. The contents of MDA， SOD， IL-6， IL-1β， CK， and FINS in serum were detected by ELISA. mRNA expression of related indexes in soleus was detected by RT-PCR. Phosphorylation levels of the AMPK/mTOR/ULK1 autophagy pathway and apoptin expression in soleus were detected by Western blot. FBG and LA levels were detected， and ISI and HOMA-IR were calculated. The role of LA， MDA， IL-6， and IL-1β in EIMD and ISI was investigated by mediating effect analysis. Results： Compared with group C， the contents of MDA， IL-6， IL-1β， CK， LA， FBG， FINS， and HOMA-IR in the serum of group E were significantly increased， while SOD and ISI were significantly decreased; The expression levels of p-AMPK Thr172， p-mTOR Ser2448， p-ULK1 Ser555， p-ULK1 Ser757， and P62 were significantly increased， while the expression levels of LC3-II， ILC3-II/LC3-I and BCL2/BAX were significantly decreased. After gavage of astaxanthin or injection of AICAR， the above changes could be reversed. The reverse effect was more obvious in the EMA group than in the groups EA and EM. However， the dual intervention of astaxanthin and MHY1485 to exhaustive exercise rats blocked the protective effect of astaxanthin on EIMD. In addition， MDA， IL-6， and IL-1β played a partial mediating effect on EIMD and ISI caused by LA. Conclusion： Exhaustive exercise can cause EIMD， and the pathogenesis involves lactic acid accumulation， oxidative stress， inflammation， and apoptosis. At this time， insulin resistance increases， and the ability of skeletal muscle to take up and utilize glucose decreases， which will up-regulate mTOR activity， inhibit autophagy flux， and aggravate muscle injury. Astaxanthin can regulate the mTOR-ULK1 autophagy pathway to alleviate EIMD， and the combined effect of astaxanthin and AICAR is more beneficial to EIMD.

Key words：exercise-induced muscle damage; astaxanthin; autophagy; mediating effect

運動性骨骼肌損傷（EIMD）是大眾健身及體育賽事中最頻發(fā)的運動創(chuàng)傷之一。不習(xí)慣的體力活動或高強度持續(xù)時間較長的運動常常會誘發(fā)EIMD，主要癥狀包括肌肉僵硬、腫脹、酸痛和收縮力下降等［1］，是影響運動員身體健康和運動表現(xiàn)的重要風(fēng)險因素。EIMD是一個復(fù)雜多變的過程，關(guān)于EIMD啟動的假說主要涉及機械和代謝性質(zhì)，機械應(yīng)力學(xué)說認(rèn)為EIMD是肌纖維受物理應(yīng)力的結(jié)果，代謝應(yīng)激模型則認(rèn)為EIMD是代謝缺陷的結(jié)果；也有學(xué)者提出EIMD的起始可以是代謝的、機械的或兩者的結(jié)合，這取決于運動的方式、強度、持續(xù)時間及個體的訓(xùn)練狀態(tài)［2］；而重復(fù)離心性運動、急性高強度運動及力竭運動是誘導(dǎo)和研究EIMD的常見模型［3］。因此，關(guān)注EIMD發(fā)生機制并降低其帶來的負(fù)面影響是提高運動效率的關(guān)鍵。

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的“垃圾處理器”。自噬的及時啟動可檢測和剔除受損細(xì)胞組件、錯誤折疊蛋白質(zhì)和代謝廢物，并在營養(yǎng)匱乏時促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物的水解與再利用以產(chǎn)生營養(yǎng)，從而保證基本的細(xì)胞活動［4］。其中，基礎(chǔ)性自噬作為一種嚴(yán)格的調(diào)節(jié)程序，有利于機體適應(yīng)各類環(huán)境波動，維持細(xì)胞外部能量與內(nèi)部生產(chǎn)-消費間的微妙平衡，但缺乏和過度自噬均對健康有害。適度運動可明顯改善自噬狀態(tài)，提高骨骼肌抵抗外界刺激的閾值及肌細(xì)胞存活率［5］；劇烈運動則與自噬異常有關(guān)，如，長時間耐力運動將導(dǎo)致肌細(xì)胞的過度自噬，加快肌細(xì)胞異化速度及蛋白降解速率，造成肌肉質(zhì)量損失；此外，自噬缺陷會誘發(fā)肌纖維變性與肌無力［5-6］。因此，維持正常的自噬通量對強化骨骼肌功能至關(guān)重要。

AMP活化蛋白激酶（AMPK）、哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)（mTOR）和Unc-51樣激酶1（ULK1）是自噬調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中相互關(guān)聯(lián)的3個主要連接點。首先，AMPK是細(xì)胞的能量傳感器，與自噬關(guān)鍵引發(fā)劑ULK1相互作用以維持能量穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP升高時（如，缺氧、禁食、運動等），AMPK將在Thr172處催化α亞基磷酸化激活A(yù)MPK，而活化的AMPK可直接在Ser555上磷酸化ULK1促進(jìn)自噬，并通過抑制mTOR的激活間接誘導(dǎo)自噬［7］。其次，mTOR在細(xì)胞生命活動及代謝調(diào)控中處于中心地位，是自噬調(diào)節(jié)因子之一，可通過促進(jìn)ULK1上Ser757位點的磷酸化，抑制自噬［8］；除受AMPK調(diào)控外，mTOR的信號傳導(dǎo)還取決于骨骼肌細(xì)胞的營養(yǎng)狀況，如，氨基酸、血糖和胰島素水平等［9-10］。再者，AMPK與mTOR對自噬啟動蛋白ULK1的協(xié)調(diào)磷酸化，為細(xì)胞中的信號整合提供機制，以適應(yīng)細(xì)胞外復(fù)雜的環(huán)境變化。雖然，運動作為常見的應(yīng)激源，可調(diào)控骨骼肌能量與物質(zhì)代謝，改變肌細(xì)胞自噬水平［11］。但當(dāng)EIMD發(fā)生時，骨骼肌代謝及AMPK/mTOR/ULK1自噬通路的激活狀態(tài)仍有待商榷。

蝦青素是一種強抗氧化劑，其特有的分子結(jié)構(gòu)能提供吸收自由基的未配對電子，防御氧化應(yīng)激損傷［12］。此外，蝦青素還具有抗炎、抗凋亡和抗毒性等功效，并參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)與葡萄糖代謝，在眾多疑難雜癥中發(fā)揮著重要作用，如，抵抗腫瘤、延緩衰老、改善疲勞和預(yù)防心腦血管疾病等［13］。但在運動人體科學(xué)領(lǐng)域，蝦青素的研究熱點多集中于抗氧化方面，關(guān)于其在自噬方面的應(yīng)用研究鮮有報道。雖有研究顯示，蝦青素可上調(diào)Akt和MAPK介導(dǎo)的自噬通路來改善神經(jīng)變性，并通過調(diào)節(jié)自噬信號在癌癥模型中發(fā)揮著抗增殖作用［14］。但關(guān)于蝦青素對AMPK/mTOR/ULK1自噬通路的調(diào)控卻知之甚少。鑒于此，本研究采用力竭運動建立大鼠EIMD模型，探究蝦青素對AMPK/mTOR/ULK1自噬通路及EIMD的影響，以期為蝦青素在運動領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7周齡SPF級雄性SD大鼠70只，體重190±10 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2020-0006］。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，隨機將雄性SD大鼠分為對照組（C）、運動組（E）、蝦青素組（M）、運動+蝦青素組（EM）、運動+AICAR（5-氨基-1-核糖基咪唑-4-甲酰胺磷酸鹽）組 （EA）、運動+蝦青素+AICAR組（EMA）和運動＋蝦青素＋MHY1485組（EMM），每組10只。所有大鼠食物飲水自由，飼養(yǎng)在溫度為26 ℃～28 ℃、相對濕度為50～60且自然晝夜節(jié)律的環(huán)境中。

1.2 運動及藥物干預(yù)方案

運動方案：正式實驗前，進(jìn)行了為期4天的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練（桶直徑50 cm、水深50 cm、水溫28 ℃～32 ℃），時長按15 min、25 min、35 min、45 min依次遞增，剔除不會游泳的大鼠。隨后，置大鼠于相同的環(huán)境下進(jìn)行游泳訓(xùn)練，直至力竭，每日下午一次，每周5 d，為期4周。力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠游泳姿勢極不協(xié)調(diào)且沉底10 s后仍無法返回水面［15］。同時，為克服大鼠在實驗過程中產(chǎn)生的運動適應(yīng)，在其尾尖綁附5體重的鉛片，隨體重增加，尾尖負(fù)重也逐漸增加［16］。

蝦青素灌胃方案：M組、EM組、EMA組和EMM組大鼠每日每只灌胃25 mg/kg體重油溶蝦青素（湖北雅仕達(dá)生物技術(shù)有限公司），C組、E組和EA組大鼠每日每只灌胃等量大豆油作為對照。每日早上灌胃，持續(xù)28 d。

AICAR注射方案：AICAR常被用作AMPK的激動劑，可降低外周組織中的胰島素抵抗。運動前0.5 h給EA組和EMA組大鼠比目魚肌注射0.5 g/kg體重的AICAR（溶于DMSO溶液），持續(xù)28 d。

MHY1485注射方案：MHY1485是mTOR的激動劑。運動前1 h給EMM組大鼠比目魚肌注射5 mg/kg體重的MHY1485（溶于DMSO溶液），持續(xù)28 d。

1.3 樣本采集及保存

大鼠在飼養(yǎng)4周并稱重后，C組和M組兩組大鼠行頸脫臼處死，股動脈采血并剝離比目魚肌；其余5組大鼠運動后即刻實施同樣的樣本采集。其中，真空采血管從大鼠股動脈取血3～5 mL，室溫靜置3 min，3 000 rpm離心15 min，分離血清后分裝；剝離出的比目魚肌經(jīng)生理鹽水清洗后分裝，置于液氮中冷凍。所有樣品置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 試劑及檢測方法

1.4.1 試劑及儀器

丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、肌酸激酶（CK）和胰島素（Insulin） ELISA試劑盒購自美國Andy Gene公司；5-氨基-1-核糖基咪唑-4-甲酰胺磷酸鹽（AICAR）、mTOR激動劑（MHY1485）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Selleck公司；RNA提取試劑盒（Transzol up）、cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒和Tip Green QPCR Super Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；磷酸化（p）-AMPKα（Thr172）抗體、p-mTOR（Ser2448）抗體、p-ULK1（Ser555）抗體、p-ULK1（Ser757）抗體、SQSTM1/P62抗體、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（BCL2）抗體和BCL2-相關(guān)X蛋白（BAX）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗購自美國Affinity公司；ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色

取各組大鼠比目魚肌，經(jīng)固定、脫水、透明和包埋后切成4 μm的切片，常規(guī)HE染色后脫水封片，顯微鏡下觀察各組大鼠比目魚肌的組織病理學(xué)改變并進(jìn)行圖片采集分析。

1.4.3 大鼠血清氧化應(yīng)激、炎性因子檢測

取各組大鼠血清，測定MDA、SOD、IL-6和IL-1β含量。根據(jù)制造商提供的方案使用各自的ELISA試劑盒，并經(jīng)酶標(biāo)儀分析，在450 nm處定量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組大鼠血清MDA、SOD、IL-6和IL-1β濃度。

1.4.4 骨骼肌損傷標(biāo)志物檢測

使用CK試劑盒（ELISA法）檢測各組大鼠血清CK濃度（步驟同1.4.3所示）。

1.4.5 胰島素水平檢測

使用Insulin試劑盒（ELISA法）檢測各組大鼠血清空腹胰島素（FINS）濃度（步驟同1.4.3所示）。

1.4.6 血乳酸、血糖濃度檢測

運動后即刻取各組大鼠尾靜脈血，使用Lactate-scout血乳酸測定儀（德國EFK公司）檢測并記錄其血乳酸（LA）濃度；使用三諾血糖測試儀（GA-3）檢測并記錄其空腹血糖（FBG）濃度。

1.5 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)

從各組大鼠比目魚肌組織中分離出總RNA，經(jīng)BestarTMqPCR RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；將cDNA作為模板，使用BestarTMqPCR MasterMix試劑進(jìn)行RT-PCR擴增。所用引物如表1所示。

1.6 Western blot分析

使用RIPA裂解液提取各組大鼠比目魚肌總蛋白，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行濃度定量，煮沸變性。以40 μg總蛋白上樣，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫?fù)u床封閉1 h。加入一抗p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1 Ser555、p-ULK1 Ser757、LC3、P62、BAX、BCL2及β-actin抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。采用PBST洗膜后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h。洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，5 min后置于轉(zhuǎn)移膜上進(jìn)行曝光、顯影和定影。并采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 交互效應(yīng)分析

將蝦青素與AICAR作為兩個干預(yù)因素，每個因素有兩個水平（0不使用，1使用），將兩個因素兩個水平組合，進(jìn)行析因設(shè)計方差分析（見表2）。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用參數(shù)檢驗，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)檢驗。本實驗的數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，以單因素方差分析檢測組間差異，方差齊使用LSD檢驗，方差不齊使用塔姆黑尼（Tamhane′s T2）檢驗，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；蝦青素與AICAR間的交互效應(yīng)采用析因設(shè)計方差進(jìn)行分析；相關(guān)系數(shù)采用Pearson法進(jìn)行分析；采用PROCESS 3.2軟件以Bootstrap法進(jìn)行中介效應(yīng)檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 蝦青素及力竭運動對大鼠比目魚肌組織病理學(xué)的影響

HE染色大鼠比目魚肌組織結(jié)構(gòu)病理變化如圖1所示。結(jié)果顯示，C組和M組大鼠比目魚肌細(xì)胞膜完整，肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，排列均勻；E組大鼠比目魚肌細(xì)胞破壞融合，肌纖維斷裂，排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤；與E組相比，EM組和EA組大鼠比目魚肌病理形態(tài)明顯偏好，呈逐漸恢復(fù)形態(tài)；但與EM組和EA組相比，EMA組大鼠比目魚肌炎性浸潤偏少，肌纖維腫脹程度偏低；而與EM組相比，EMM組大鼠斷裂的肌纖維數(shù)量明顯增多。

2.2 蝦青素及力竭運動對大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

血清MDA和SOD含量分別代表大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平與抗氧化能力。結(jié)果顯示，E組血清MDA含量明顯高于C組，SOD含量明顯低于C組；M組血清MDA、SOD含量與C組無明顯差異。EM組和EA組血清MDA含量明顯低于E組；EM組血清SOD含量明顯高于E組；EA組SOD含量與E組無明顯差異。EMA組血清MDA含量明顯低于EA組和EM組，SOD含量明顯高于EA組。而EMM組血清MDA含量明顯高于EM組，SOD含量明顯低于EM組（見表3）。

2.3 蝦青素及力竭運動對大鼠炎性因子水平的影響

血清IL-6和IL-1β是促炎因子，可反映機體的炎癥水平。結(jié)果顯示，E組血清IL-6、IL-1β含量明顯高于C組；M組血清IL-6、IL-1β含量雖明顯低于C組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。EM組和EA組血清IL-6、IL-1β含量明顯低于E組；EMA組血清IL-6、IL-1β含量明顯低于EA組和EM組；而EMM組血清IL-6、IL-1β含量明顯高于EM組（見表4）。

2.4 蝦青素及力竭運動對大鼠LA、血清CK含量的影響

LA是糖代謝的中間產(chǎn)物，血清CK則是檢測骨骼肌損傷的常用指標(biāo)。結(jié)果顯示，E組大鼠LA、血清CK含量明顯高于C組；M組與C組無明顯差異。EM組和EA組大鼠LA、血清CK含量明顯低于E組。此外，EMA組大鼠LA、血清CK含量明顯低于EA組和EM組。EMM組大鼠LA、血清CK含量明顯高于EM組（見表5）。

2.5 蝦青素及力竭運動對大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI的影響

胰島素是機體降血糖的唯一激素。其中，空腹血糖（FBG）是用于評價機體自身胰島素分泌水平及其生理功能的最基本指標(biāo)，而胰島素敏感性指數(shù)（ISI）和胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）常被用于衡量血糖與胰島素在不同靶器官（如，胰腺、肝臟、骨骼肌等）中的作用能力，二者的計算公式分別為：ISI=ln［1/（FBG×FINS）］，HOMA-IR =（FBG×FINS）/22.5。

結(jié)果顯示，E組大鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR均明顯高于C組，ISI明顯低于C組；M組FBG、FINS水平及HOMA-IR、ISI與C組無明顯差異。此外，EM組和EA組大鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR明顯低于E組，ISI明顯高于E組。EMA組大鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR顯著低于EA和EM組，ISI顯著高于EA組。而EMM組大鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR明顯高于EM組，ISI明顯低于EM組（見表6）。

2.6 大鼠血清MDA、IL-6、IL-1β、CK、LA、ISI、HOMA-IR間的相關(guān)性

結(jié)果顯示，大鼠血清MDA、IL-6、IL-1β、LA、HOMA-IR等指標(biāo)兩兩相比均呈正相關(guān)。此外，大鼠血清MDA、IL-6、IL-1β、LA、HOMA-IR等指標(biāo)與ISI均呈負(fù)相關(guān)（見表7）。

2.7 血清MDA、IL-6、IL-1β、CK的中介效應(yīng)

以LA為自變量，以CK、ISI為因變量，以MDA、IL-1β、IL-6為中介變量，分別建立LA-MDA-CK、LA-IL-1β-CK的簡單中介模型及LA-MDA-IL-6-ISI的鏈?zhǔn)街薪槟Ｐ?。由如圖2a-c所示的路徑系數(shù)可知，3個回歸模型均具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。同時，用Bootstrap抽樣法對中介效應(yīng)進(jìn)行檢驗的結(jié)果表明，首先，LA對血清CK的總效應(yīng)、直接效應(yīng)、以MDA和IL-1β介導(dǎo)的中介效應(yīng)均具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中，以MDA和IL-1β介導(dǎo)的中介效應(yīng)分別占總效應(yīng)的51.52和44.70；其次，LA對ISI的總效應(yīng)、直接效應(yīng)、以MDA和IL-6介導(dǎo)的中介效應(yīng)也具有統(tǒng)計學(xué)意義，以MDA為中介的相對效應(yīng)量、以IL-6為中介的相對效應(yīng)量、以MDA和IL-6為中介的相對效應(yīng)量分別為20.31、20.31和14.06，所有間接效應(yīng)占總效應(yīng)的55.47（見表8）。

2.8 蝦青素及力竭運動對大鼠比目魚肌自噬、凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

各組大鼠比目魚肌自噬、凋亡相關(guān)基因表達(dá)如圖3所示。結(jié)果顯示，E組比目魚肌mTOR、BAX、P62基因表達(dá)明顯高于C組，LC3、BCL2基因表達(dá)明顯低于C組，而E組AMPK、ULK1及M組自噬、凋亡相關(guān)基因表達(dá)均與C組無明顯差異。EM組和EA組比目魚肌mTOR、BAX、P62基因表達(dá)明顯低于E組，LC3、 BCL2基因表達(dá)明顯高于E組，AMPK、ULK1基因表達(dá)與E組無明顯差異。此外，EMA組比目魚肌mTOR、BAX、P62基因表達(dá)明顯低于EM組和EA組，LC3、BCL2基因表達(dá)明顯高于EM組和EA組。EMM組比目魚肌mTOR、ULK1基因表達(dá)與EM組無明顯差異，LC3基因表達(dá)明顯低于EM組，BAX、P62基因表達(dá)明顯高于EM組。

2.9 蝦青素及力竭運動對大鼠比目魚肌AMPK/mTOR/ULK1通路激活狀態(tài)的影響

結(jié)果顯示，p-AMPKα Thr172、p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser555、p-ULK1 Ser757在E組大鼠比目魚肌中的蛋白表達(dá)明顯高于C組；M組大鼠比目魚肌中的蛋白表達(dá)與C組無明顯差異。而EM組和EA組大鼠比目魚肌p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)明顯低于E組，p-AMPKα Thr172、p-ULK1 Ser555蛋白表達(dá)與E組無明顯差異。EMA組大鼠比目魚肌p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)明顯低于EM組和EA組，而p-AMPKα Thr172、p-ULK1 Ser555蛋白表達(dá)與EM組和EA組無明顯差異。EMM組大鼠比目魚肌p-mTOR Ser2448和p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)明顯高于EM組（見圖4）。

2.10 蝦青素及力竭運動對大鼠比目魚肌自噬標(biāo)志物表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，E組大鼠比目魚肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3-II蛋白表達(dá)明顯低于C組，P62蛋白表達(dá)明顯高于C組；M組大鼠比目魚肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3-II蛋白表達(dá)與C組無明顯差異。EM組和EA組大鼠比目魚肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3-II蛋白表達(dá)明顯高于E組，P62蛋白表達(dá)明顯低于E組。此外，EMA組大鼠比目魚肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3-II蛋白表達(dá)明顯高于EM組和EA組，P62蛋白表達(dá)明顯低于EM組和EA組。EMM組大鼠比目魚肌LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯低于EM組，P62蛋白表達(dá)明顯高于EM組。各組大鼠比目魚肌LC3-I蛋白表達(dá)無明顯差異（見圖5）。

2.11 蝦青素及力竭運動對大鼠比目魚肌凋亡蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，E組比目魚肌BAX蛋白表達(dá)明顯高于C組，BCL2蛋白表達(dá)與BCL2/BAX明顯低于C組；M組比目魚肌BAX、BCL2蛋白表達(dá)和BCL2/BAX與C組無明顯差異。EM組和EA組比目魚肌BAX蛋白表達(dá)明顯低于E組，BCL2蛋白表達(dá)和BCL2/BAX明顯高于E組。EMA組比目魚肌BAX蛋白表達(dá)明顯低于EM組和EA組，BCL2蛋白表達(dá)明顯高于EA組，BCL2/BAX明顯高于EM組和EA組。且EMM組比目魚肌BAX蛋白表達(dá)明顯高于EM組，BCL2蛋白表達(dá)和BCL2/BAX明顯低于EM組（見圖6）。

2.12 蝦青素與AICAR對mTOR-ULKI通路激活狀態(tài)及CK含量的交互效應(yīng)

以析因設(shè)計方差分析和判斷蝦青素與AICAR對大鼠mTOR-ULK1自噬通路磷酸化水平及血清CK含量是否存在交互作用。結(jié)果顯示，二者均可顯著降低大鼠p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)及血清CK含量，且兩者之間存在明顯的交互效應(yīng)（Plt;0.01，Plt;0.01）（見圖7）。

3 討 論

3.1 蝦青素可改善力竭運動大鼠骨骼肌損傷

（1）蝦青素可降低力竭運動大鼠的骨骼肌損傷標(biāo)志物。過度運動中骨骼肌持續(xù)收縮會強行拉伸肌原纖維，破壞其組織結(jié)構(gòu)［2］。當(dāng)肌膜損傷時，CK將由骨骼肌擴散至血液和組織液里，故血清CK含量是檢測骨骼肌損傷的可靠指標(biāo)［17］。本研究中，大鼠力竭運動后血清CK含量明顯上升，肌纖維受損斷裂，由此可推斷，實驗中的力竭運動破壞了骨骼肌的組織結(jié)構(gòu)，引發(fā)了EIMD。而給運動大鼠灌胃蝦青素后，血清CK含量明顯降低，肌纖維形態(tài)與排列明顯好轉(zhuǎn)，提示蝦青素可修復(fù)受損肌纖維，增加肌細(xì)胞膜穩(wěn)定性，進(jìn)而減少血清CK釋放。此外，EIMD癥狀還涉及肌肉酸痛、腫脹和收縮力下降等，這可能與乳酸堆積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡有關(guān)［18］。

（2） 蝦青素可緩解力竭運動大鼠的乳酸堆積與炎癥反應(yīng)。LA積累和血液PH值降低常造成運動疲勞與肌肉疼痛［19］。此外，過度運動后，循環(huán)血液中白細(xì)胞計數(shù)增加，其中單核細(xì)胞將移至受損組織附近，并分化為M1型巨噬細(xì)胞，釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子，持續(xù)的炎癥將加劇骨骼肌機械損傷［20］。而蝦青素不僅可以減少運動期間產(chǎn)生的乳酸，增強肌肉耐力，還可以防止核因子κB抑制因子α（IκB-α）降解，阻斷NF-κB依賴性信號通路，降低下游炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-a水平，在眾多疾病中發(fā)揮抗炎作用［21］。并且，給足球運動員補充蝦青素還可預(yù)防高強度體能訓(xùn)練誘發(fā)的炎癥［22］。本研究中，E組大鼠LA、血清IL-6和IL-1β含量明顯高于C組，提示力竭運動誘發(fā)了糖酵解反應(yīng)，并產(chǎn)生了H+和乳酸陰離子，這可能是過度運動引發(fā)肌肉酸痛的重要原因。此時，受損肌肉觸發(fā)了炎癥反應(yīng)以啟動組織修復(fù)，然而，大量炎性細(xì)胞浸潤引起的組織水腫和局部溫度上升，也將激活肌肉內(nèi)的傷害感受器，導(dǎo)致繼發(fā)損傷。本研究中，EM組大鼠LA、血清IL-6和IL-1β含量明顯低于E組，說明蝦青素可有效清除LA，緩解運動疲勞，并抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生與釋放，減輕炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)。

（3）蝦青素可減輕力竭運動大鼠的氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡。劇烈運動會使ROS劇增，攻擊細(xì)胞成分，生成MDA等過氧化物，危害骨骼肌性能［23］。SOD是抵抗氧化應(yīng)激的防線，可降低過氧化損傷［24］。而過度凋亡則會破壞肌細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡，誘發(fā)病理性損傷，且其與運動期間ROS的積累有關(guān)［25］，BCL2/BAX降低常提示細(xì)胞凋亡發(fā)生［26］。蝦青素不僅可通過激活Nrf2-ARE防御通路抵抗RONS攻擊，抑制過氧化物產(chǎn)生，同時提高GSH、SOD、CAT等抗氧化酶活性，保護(hù)機體免受氧化損傷［27］；蝦青素還可通過PI3K/Akt/GSK3β/Nrf2信號通路，對氧和葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［28］。本研究中，大鼠力竭運動后血清SOD含量、比目魚肌BCL2基因和蛋白表達(dá)及BCL2/BAX明顯下降，血清MDA含量、比目魚肌BAX基因和蛋白表達(dá)明顯上升，說明力竭運動時，大鼠機體氧化應(yīng)激水平增加，抗氧化能力減弱，誘發(fā)了骨骼肌過氧化損傷。此時，大量的過氧化物使肌細(xì)胞內(nèi)充斥受損分子，修復(fù)機制超負(fù)荷運轉(zhuǎn)，激活了促凋亡信號傳導(dǎo)。而給力竭大鼠灌胃蝦青素后，血清MDA含量、BAX基因和蛋白表達(dá)明顯下降，血清SOD含量、BCL2基因和蛋白表達(dá)與BCL2/BAX明顯上升，說明蝦青素能夠有效清除力竭運動產(chǎn)生的代謝廢物，降低脂質(zhì)過氧化，增強抗氧化酶活性，進(jìn)而恢復(fù)氧化還原平衡，并在力竭運動誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮積極作用。

（4）蝦青素可提高力竭運動大鼠的胰島素敏感性。研究表明，過度運動會擾亂肌細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號傳導(dǎo)，降低胰島素依賴性的葡萄糖攝取，其機制涉及機械應(yīng)激與代謝紊亂等［29］。蝦青素已被證明可有效提高肥胖小鼠骨骼肌對葡萄糖的吸收與利用能力［30］。本研究中，E組大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR顯著高于C組，ISI顯著低于C組，說明力竭運動中，糖原分解促使血液葡萄糖含量增加，胰島素含量也隨之增加以維持糖代謝與能量穩(wěn)態(tài)。但是，此時骨骼肌胰島素敏感性明顯下降，導(dǎo)致力竭運動大鼠出現(xiàn)持續(xù)的高血糖、高胰島素狀態(tài)。給力竭運動大鼠灌胃蝦青素可顯著降低大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR，提高ISI，提示蝦青素有利于改善力竭運動引發(fā)的骨骼肌胰島素抵抗，提高肌細(xì)胞對血糖的利用率，增強運動能力。

乳酸穿梭理論認(rèn)為，LA增多會增強線粒體能量代謝，生成大量ROS［31］。此外，有氧糖酵解在促炎過程中發(fā)揮著重要作用，而氧化磷酸化則與抗炎反應(yīng)相關(guān)［32］。本研究采用中介效應(yīng)法分析LA、氧化應(yīng)激、促炎因子與EIMD、ISI的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LA堆積誘導(dǎo)了EIMD，MDA和IL-1β發(fā)揮了部分中介作用，由此推測，在力竭運動誘導(dǎo)的EIMD中，LA、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)存在交互作用，該過程的乳酸生成可能來自有氧糖酵解，進(jìn)而激活了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致EIMD，這與“warburg”效應(yīng)類似。此外，過高的LA含量及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致運動后胰島素敏感性下降的罪魁禍?zhǔn)?，即，LA不僅可以直接降低ISI，還可通過MDA、IL-6的中介效應(yīng)間接影響ISI，且在此過程中氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要誘因。

3.2 蝦青素可調(diào)控力竭運動大鼠骨骼肌mTOR-ULK1自噬通路

基礎(chǔ)性自噬參與受損細(xì)胞成分的清除及正常蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和發(fā)育方面具有積極作用。然而，過度運動常導(dǎo)致自噬異常，對骨骼肌健康不利，如，一次性力竭游可引起大鼠股四頭肌的過度自噬，導(dǎo)致骨骼肌分解代謝增強，收縮力下降［33］；急性運動會降低小鼠比目魚肌自噬通量，使有害代謝物堆積，攻擊細(xì)胞成分，加重肌肉損傷［34］。AMPK-mTOR-ULK1通路是調(diào)控自噬的途徑之一，AMP/ATP上升將提高AMPK活性，進(jìn)而激活ULK1上的Ser555位點以促進(jìn)自噬。營養(yǎng)充足時，高mTOR活性通過磷酸化ULK1上的Ser757位點，破壞ULK1和AMPK間的相互作用來抑制自噬［8］。自噬啟動后，LC3-I被脂質(zhì)化形成自噬體駐留的錨定蛋白LC3-II，LC3-II/LC3-I是衡量自噬體含量的重要標(biāo)志［35］。P62作為選擇性自噬受體，是鏈接LC3與泛素化蛋白聚集體等底物的橋梁，其被選擇性包裹進(jìn)自噬體，并通過自噬溶酶體降解，常反映自噬通量［36］。

本研究中，E組大鼠比目魚肌p-AMPK Thr172、p-ULK1 Ser555、p-ULK1 Ser757和p-mTOR Ser2448蛋白表達(dá)均明顯高于C組，LC3-Ⅱ基因和蛋白表達(dá)、及LC3-II/LC3-I明顯低于C組，P62基因和蛋白表達(dá)明顯高于C組，說明力竭運動促使AMP/ATP比值上升，激活了AMPK/ULK1信號通路，自噬被啟動。但自噬體生成減少，自噬通量被抑制，這可能是由于AMPK-ULK1信號軸的激活不是引發(fā)自噬體含量變化及自噬體降解的充分刺激因素，mTOR-ULK1通路的高活性可能是力竭運動阻礙自噬通量的重要原因。此時，AMPK激活不足以調(diào)節(jié)mTOR，mTOR的高活性可能受到了高血糖、高水平胰島素的刺激［37-38］，進(jìn)而抑制了完整的自噬過程。蝦青素可調(diào)控自噬相關(guān)通路，進(jìn)而治療各種疾?。?9］，如，蝦青素能通過激活A(yù)MPK并抑制mTOR的磷酸化上調(diào)自噬水平，改善幽門螺桿菌誘導(dǎo)的相關(guān)胃?。?0］。本研究顯示，EM組大鼠比目魚肌p-AMPK Thr172、p-ULK1 Ser555蛋白表達(dá)與E組無明顯差別，p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)、P62基因和蛋白表達(dá)明顯低于E組，LC3-Ⅱ基因和蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯高于E組，說明蝦青素能夠有效降低mTOR-ULK1通路活性，增加自噬體含量及自噬通量。

3.3 提高自噬通量可改善力竭運動大鼠的骨骼肌損傷

有研究顯示，自噬與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡間存在相互作用。自噬可響應(yīng)氧化應(yīng)激而被激活，自噬受損將造成過氧化損傷［41］。自噬活性的增強還伴隨著細(xì)胞凋亡的減少［42］，自噬的降解途徑也在控制免疫炎性反應(yīng)、限制炎癥病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用［43］。因此，本研究探究了抑制mTOR-ULK1通路活性以增強自噬是否有助于改善骨骼肌氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解EIMD。AICAR常被認(rèn)為是AMPK激動劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞從合成代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榉纸獯x［44］，也可獨立于AMPK，提高外周器官對胰島素作用的敏感性，調(diào)節(jié)血糖及胰島素水平［45］，降低mTOR活性［46-47］。

本研究給力竭運動大鼠注射AICAR后，大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、比目魚肌p-mTOR Ser2448和p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)、P62基因和蛋白表達(dá)均顯著下降，ISI、比目魚肌LC3-II 基因和蛋白表達(dá)、LC3-II/LC3-I均顯著上升，比目魚肌p-AMPK Thr172、p-ULK1 Ser555蛋白表達(dá)無顯著變化，說明AICAR可刺激骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用，降低循環(huán)血中葡萄糖及胰島素含量，進(jìn)而有效抑制力竭運動大鼠比目魚肌mTOR活性，解除mTOR介導(dǎo)的自噬抑制，提高自噬通量，且該過程可能并不依賴于AMPK的激活，而是與胰島素水平及骨骼肌胰島素抵抗減輕有關(guān)。此外，EA組大鼠血清CK、MDA、IL-6、IL-1β、LA含量、BAX 基因和蛋白表達(dá)明顯低于E組，BCL2基因和蛋白表達(dá)、BCL2/BAX明顯高于E組，說明mTOR-ULK1通路介導(dǎo)的自噬通量上調(diào)可有效清除代謝廢物及過氧化產(chǎn)物，控制細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)量，進(jìn)而保護(hù)肌纖維免受凋亡及氧化應(yīng)激損傷，同時降低促炎因子水平，減輕免疫反應(yīng)期間的繼發(fā)損傷，增強肌肉防御能力。因此，自噬過程中的“自食”機制能夠限制EIMD進(jìn)程并恢復(fù)骨骼肌結(jié)構(gòu)功能完整性，而力竭運動中mTOR-ULK1通路的高活性可能是加重EIMD的重要原因。

3.4 蝦青素可通過mTOR-ULK1自噬通路減輕力竭運動大鼠的骨骼肌損傷

盡管本研究證明了蝦青素可降低力竭運動大鼠骨骼肌mTOR-ULK1通路活性，上調(diào)自噬通量，從而緩解EIMD。但由于蝦青素本身的生物效應(yīng)，其是直接發(fā)揮抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，還是通過mTOR-ULK1自噬通路間接改善EIMD，仍有待進(jìn)一步研究。MHY1485是mTOR的特異性激動劑，可有效抑制自噬。本研究中，EMM組大鼠比目魚肌p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)明顯高于EM組，LC3-Ⅱ 基因和蛋白表達(dá)明顯低于EM組，說明蝦青素對mTOR-ULK1通路的抑制作用及自噬通量的調(diào)節(jié)作用被MHY1485削弱。此時，EMM組大鼠血清CK、MDA、IL-6、IL-1β、LA含量明顯高于EM組，血清SOD含量明顯低于EM組，比目魚肌BAX基因和蛋白表達(dá)明顯高于EM組，比目魚肌BCL2蛋白表達(dá)與BCL2/BAX明顯低于EM組。由此提示，MHY1485特異性激活mTOR-ULK1通路后，阻斷了蝦青素對EIMD的保護(hù)作用，進(jìn)一步說明了蝦青素可通過抑制mTOR-ULK1信號通路活性改善受損骨骼肌的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善EIMD。

此外，在給力竭運動大鼠注射AICAR的同時進(jìn)行了蝦青素灌胃，結(jié)果顯示，EMA組大鼠比目魚肌p-mTOR Ser2448、p-ULK1 Ser757蛋白表達(dá)、P62基因和蛋白表達(dá)明顯低于EA組和EM組，LC3-II基因和蛋白表達(dá)、LC3-II/LC3-I及BCL2/BAX明顯高于EA組和EM組。EMA組大鼠血清LA、MDA、IL-6、IL-1β、CK含量明顯低于EM組和EA組，SOD含量明顯高于EA組。并且，析因設(shè)計方差分析顯示蝦青素與AICAR存在明顯的交互效應(yīng)，說明蝦青素與AICAR均可通過調(diào)控mTOR-ULK1自噬通路緩解骨骼肌的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善EIMD，且二者聯(lián)合應(yīng)用的改善效果明顯優(yōu)于單獨使用的作用效果。

4 結(jié) 論

力竭運動常導(dǎo)致EIMD，其發(fā)病機制涉及機械刺激、乳酸堆積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等。此時，AMPK-ULK1信號通路被激活以啟動自噬，卻不足以調(diào)控完整的自噬過程，因為力竭運動介導(dǎo)的骨骼肌損傷會降低肌細(xì)胞胰島素的敏感性，改變血清胰島素水平，進(jìn)而提高mTOR-ULK1通路活性，抑制肌肉自噬體生成及自噬通量。又因基礎(chǔ)性自噬對改善EIMD具有積極作用，故低水平的自噬狀態(tài)可能是加劇EIMD的機制之一。而蝦青素可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡保護(hù)骨骼肌免受運動損傷，其中，蝦青素調(diào)控的mTOR-ULK1自噬通路在這一過程中發(fā)揮了重要作用。此外，本研究雖不排除AMPK-ULK1通路的調(diào)節(jié)作用，但其卻無法逆轉(zhuǎn)力竭運動中自噬通量受阻的結(jié)局。

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收稿日期：2023-09-20

基金項目：山西省重點研發(fā)計劃項目（編號：201803D31030）。

作者簡介：吳麗君（1971- ），女，山西太原人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向為機體運動的生理生化機制與運動營養(yǎng)。

作者單位：1.山西大學(xué) 體育學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物醫(yī)藥與大健康研究院，山西 太原 030006。