徐慧倩，胡家杰，鄧尚貴，繆文華

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山 316022）

低溫等離子體（Cold atmospheric plasma，CAP）作為物質(zhì)的第4 態(tài)，主要是通過電場(chǎng)對(duì)氣體進(jìn)行電離產(chǎn)生等離子體，而其構(gòu)成的主要物質(zhì)為帶電粒子，包括正、負(fù)離子，激發(fā)態(tài)分子和原子、自由基等物質(zhì)[1]，它主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)技術(shù)[2]、環(huán)境保護(hù)[3]、食品保鮮[4]等領(lǐng)域。因其具有綠色無污染、殺菌功效好、安全且操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被人們認(rèn)為具有良好的前景，是21 世紀(jì)可大力發(fā)展的新技術(shù)。氣調(diào)包裝（Modified atmosphere packaging，MAP）是一種通過置換包裝盒里的氣體來達(dá)到保鮮目的的技術(shù)，通常使用的填充氣體有N2、CO2、O2和稀有氣體等[5]。N2是一種惰性氣體，主要用來置換氧氣以此來減少需氧菌的生長(zhǎng)，而CO2對(duì)細(xì)菌具有抑制作用，通過使細(xì)胞酸化而影響其代謝活動(dòng)[6-7]。有研究表明，CO2在低溫等離子體反應(yīng)器中可以轉(zhuǎn)化為CO 和O2[8]。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種需氧性的革蘭氏陰性菌，通常存在于水產(chǎn)品、肉制品以及乳制品中[9]，會(huì)引起敗血癥或敗血性休克等[10]。它們會(huì)產(chǎn)生胞外蛋白酶來分解水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，具有很強(qiáng)的生物膜形成能力，從而增加細(xì)菌對(duì)殺菌劑的抵抗力以及抗生素的耐藥性[11]。雖然關(guān)于低溫等離子體殺菌保鮮效果的研究已比較廣泛，包括畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品、果蔬生鮮等，但是對(duì)于CAP 在氣調(diào)環(huán)境下殺菌的致死機(jī)理有待研究深入。本文采用正交試驗(yàn)選定處理電壓為50 kV，氣調(diào)氣體體積比為V（N2）∶V（CO2）=3 ∶2，在此條件下通過改變CAP 處理時(shí)間（0，60，180，300 s）對(duì)熒光假單胞菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，為低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝的殺菌保鮮方式應(yīng)用于食品等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 熒光假單胞菌，分離自舟山帶魚中，經(jīng)初步形態(tài)學(xué)觀察和鏡檢后通過16S rDNA 鑒定為熒光假單胞菌（相似度為99.93%），凍存于-80℃冰箱中。

1.1.2 試劑 氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），青島海博生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）試劑盒、Na+/K+-ATPase（ATP）酶試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒，南京建成生物工程研究所；碘化丙啶（Propidium iodide，PI）試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Phenix BK 130/36 低溫等離子體處理裝置，美國(guó)鳳凰科技公司；MAP-H360 氣調(diào)保鮮包裝機(jī)，蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司；U-2800 紫外-可見分光光度計(jì)、F-7000 熒光分光光度計(jì)、SU8220 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，株式會(huì)社日立制作所；Centrifuge 5424 高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；BSP-250 生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備 將分離出的熒光假單胞菌凍存液進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，平板劃線后挑取3～4 個(gè)單菌落于50 mL TSB 中混勻，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。取培養(yǎng)后的菌液離心，去除上清液，用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffered solution，PBS，0.01 mol/L，pH 值在7.2～7.4 范圍）輕輕漂洗3 次后再用PBS 重懸，測(cè)量其在波長(zhǎng)600 nm 處的OD 值，調(diào)整濃度后制成菌懸液，其含菌數(shù)量約為108CFU/mL。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 移取制備好的菌懸液于培養(yǎng)皿中，以不同體積比例的N2和CO2進(jìn)行充氣包裝。

固定處理電壓為50 kV，固定處理時(shí)間為180 s，以不同N2含量（50%，55%，60%，65%，70%）進(jìn)行氣調(diào)包裝（剩余氣體以CO2進(jìn)行填充，即50%，45%，40%，35%，30%，下同）后進(jìn)行低溫等離子體處理。

固定處理電壓為50 kV，N2含量為60%，以不同處理時(shí)間（60，120，150，180，240 s）進(jìn)行低溫等離子體處理。

固定處理時(shí)間為180 s，N2含量為60%，以不同處理電壓（40，45，50，55，60 kV）進(jìn)行低溫等離子體處理。

1.3.2.2 殺菌率測(cè)定 將處理后的菌懸液混勻后立即進(jìn)行稀釋和涂布，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察計(jì)數(shù)。每個(gè)處理組平行3 次，以平均值作為最終結(jié)果。殺菌率的計(jì)算公式見式（1）。

式中，λ——?dú)⒕剩?；γ0——未經(jīng)CAP 處理的菌落數(shù)，CFU/mL；γ1——CAP 處理后的菌落數(shù)，CFU/mL。

1.3.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)置如表1 所示，以殺菌率為指標(biāo)來研究低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌殺菌工藝的測(cè)定及優(yōu)化。

表1 因素水平設(shè)置表Table 1 Factor level setting table

1.3.3 樣品的制備 將菌懸液混勻后置于培養(yǎng)皿中，以氣調(diào)氣體體積比為N2∶CO2=3∶2（即氮?dú)?0%，二氧化碳40%）的條件進(jìn)行充氣包裝。之后進(jìn)行CAP 處理，處理電壓為50 kV；處理時(shí)間分別為0，60，180，300 s，以0 s 處理組作為對(duì)照組，立即進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞活性的測(cè)定 細(xì)胞活性的測(cè)定采取CCK-8 法。根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，分別在30 ℃下培養(yǎng)0，0.5，1，2，4 h，測(cè)定其在波長(zhǎng)450 nm 處的OD 值。細(xì)菌存活率計(jì)算公式如下：

式中，A0——空白的吸光度；A1——處理組的吸光度；A2——對(duì)照組的吸光度。

1.3.5 細(xì)胞壁的通透性 細(xì)胞壁的通透性主要通過測(cè)定AKP 的活力體現(xiàn)。將樣品以1 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，用PBS 重懸，在冰水浴中破碎細(xì)胞，取上清液作為待測(cè)樣品，然后根據(jù)AKP 試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 細(xì)胞膜的完整性

1.3.6.1 細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)泄露含量的測(cè)定 參考Xiang 等[12]的方法并稍作修改。將樣品以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，用PBS 漂洗沉淀3次后吸取上清液，分別測(cè)量波長(zhǎng)260 nm 和280 nm 處的OD 值。

1.3.6.2 ATP 活性的測(cè)定 將樣品以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，沉淀用0.85%無菌生理鹽水重懸，在冰水浴中破碎細(xì)胞，取上清液為待測(cè)樣品，然后根據(jù)ATP 試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6.3 PI 熒光染色的測(cè)定 參考康超娣[13]的方法并稍作修改。將樣品以6 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，沉淀用PBS 重懸，取900 μL 待測(cè)液，添加100 μL PI 儲(chǔ)備液（儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為10 μg/mL），反應(yīng)后于暗室靜置30 min，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量樣品的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)536 nm，發(fā)射波長(zhǎng)617 nm，狹縫寬度5 mm，光電倍增管電壓700 V）。

1.3.7 菌體內(nèi)抗氧化酶活性的測(cè)定 菌體內(nèi)的抗氧化酶活性主要以SOD 和CAT 來呈現(xiàn)，根據(jù)SOD 試劑盒說明書和CAT 試劑盒說明書分別進(jìn)行操作和測(cè)定。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定 微觀結(jié)構(gòu)的變化通過掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）來觀察。參考Tang 等[14]的步驟并稍作修改，將樣品以6 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，用PBS 輕輕漂洗3 次后留菌體，沿管壁緩緩加入2.5%戊二醛溶液，于室溫下固定2 h，然后轉(zhuǎn)入4 ℃固定12 h，使用乙醇進(jìn)行稀釋脫水，干燥后噴金，觀察細(xì)菌的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析及處理 用SPSS 19 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Origin 9.1 進(jìn)行圖片繪制，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來呈現(xiàn)，P<0.05 為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同因素對(duì)熒光假單胞菌的殺菌效果 如圖1a 所示，殺菌率隨著處理電壓的增加而增加（40～50 kV，P<0.05），當(dāng)處理電壓為40 kV 時(shí)，殺菌率為80.13%，當(dāng)處理電壓升至50 kV 時(shí)，殺菌率已經(jīng)達(dá)到了99.99%，而當(dāng)處理電壓繼續(xù)增加時(shí)，殺菌率已趨于100%，已無顯著性差異（P>0.05）。這可能是因?yàn)楫?dāng)電壓較低時(shí)，殺菌物質(zhì)如活性粒子中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）等產(chǎn)生的數(shù)量較少或無法完全激發(fā)，不能有效殺死熒光假單胞菌[15]。然而，當(dāng)處理電壓為60 kV時(shí)，CAP 放電比較劇烈，當(dāng)電極板距離不變時(shí)，處理電壓增大會(huì)使電場(chǎng)強(qiáng)度增大，而電場(chǎng)強(qiáng)度越大則越容易被擊穿[16]，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的活性粒子等外漏影響試驗(yàn)結(jié)果，并且給試驗(yàn)人員試驗(yàn)安全帶來隱患。因此從安全角度來說，選擇最優(yōu)CAP 處理電壓為50 kV。

圖1 不同因素對(duì)熒光假單胞菌殺菌率的影響Fig.1 Effects of different factors on the sterilization rate of Pseudomonas fluorescens

如圖1b 所示，殺菌率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（60～180 s，P<0.05），當(dāng)處理時(shí)間為60 s和180 s 時(shí)，殺菌率分別為76.25%和99.99%，而當(dāng)處理時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，殺菌率趨于100%，已無顯著性差異（P>0.05）。這可能是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi)CAP 產(chǎn)生的活性粒子量不變，延長(zhǎng)處理時(shí)間可能會(huì)增加活性粒子與樣品的接觸時(shí)間，殺菌效果增強(qiáng)。CAP 作用的時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌率就越高，最終趨于穩(wěn)定，這時(shí)再延長(zhǎng)處理時(shí)間，殺菌效果也不會(huì)有明顯變化。因此從經(jīng)濟(jì)角度來說，選擇最優(yōu)CAP處理時(shí)間為180 s。

如圖1c 所示，殺菌率隨著氮?dú)夂康脑黾佣尸F(xiàn)先升后降的趨勢(shì)（P<0.05）。當(dāng)N2含量為60%時(shí)，殺菌率達(dá)到99.60%。因此選擇最優(yōu)氮?dú)夂繛?0%。

2.1.2 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝處理?xiàng)l件的正交試驗(yàn)優(yōu)化 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示，正交試驗(yàn)方差分析如表3 所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and result

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance

由表2 的極差R 可知，低溫等離子體對(duì)熒光假單胞菌的各影響因素的主次分別為A、B、C，即處理電壓、處理時(shí)間、氮?dú)夂?。通過比較K 的大小來確定最佳組合是A3B3C2。由表3 可知，因素A的P 值小于0.05，因素B 和因素C 的P 值均大于0.05，說明此試驗(yàn)中處理電壓對(duì)殺菌率影響顯著，以殺菌率為指標(biāo)來判斷殺菌效果的強(qiáng)弱，因此殺菌率越高的因素水平作為最佳水平，選擇50 kV作為處理電壓；處理時(shí)間和氮?dú)夂勘壤绊懖伙@著，因此直接選擇處理時(shí)間180 s 和氮?dú)夂?0%。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)上述優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，表4 為正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。熒光假單胞菌在處理電壓為50 kV，處理時(shí)間為180 s，氮?dú)夂繛?0%的條件下進(jìn)行CAP 處理，測(cè)得殺菌率為99.49%。將優(yōu)化后的結(jié)果應(yīng)用于抑菌機(jī)理試驗(yàn)。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Orthogonal test to verify the results

2.2 菌體內(nèi)細(xì)胞活性的結(jié)果分析

細(xì)胞與試劑反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生甲臜，依據(jù)顏色的深淺和OD 值可以測(cè)定細(xì)胞的活力及數(shù)量[17]。表5 為CCK-8 法測(cè)定不同處理時(shí)間的熒光假單胞菌的存活率。分析可知，除了0 h 外，熒光假單胞菌的存活率隨處理時(shí)間的增加而顯著降低（P<0.05），培養(yǎng)時(shí)間越久，存活率降低速率也越快。由表5 可知，在培養(yǎng)2 h 和4 h 時(shí)，60 s 處理組差異較小，細(xì)菌存活率大于60%，而180 s 和300 s 處理組的細(xì)菌活性仍然在降低。這可能是CAP 處理后使得熒光假單胞菌發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18]，處理時(shí)間越長(zhǎng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)越明顯，最終使細(xì)胞存活率降低。

表5 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌存活率的影響Table 5 Effects of CAP combined with MAP on the survival rate of Pseudomonas fluorescens

2.3 細(xì)胞壁通透性的結(jié)果分析

AKP 是介于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的一種酶，其活力能夠反映細(xì)胞壁的通透性，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，AKP 會(huì)從細(xì)胞中流出，導(dǎo)致酶活力降低[19-20]。如圖2 所示，AKP 的活力隨著處理時(shí)間的增加而顯著降低（P<0.05），0，60，180 s 和300 s 處理組的AKP值分別為21.50，15.69，12.09，11.33 金氏單位/g prot。AKP 活力下降可能是因?yàn)镃AP 處理時(shí)產(chǎn)生的ROS 會(huì)破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁松弛甚至破裂繼而失去保護(hù)作用。此外，有研究表明，酶失活還可能是因?yàn)榈入x子體產(chǎn)生的羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫自由基等的作用，這些自由基與氨基酸側(cè)鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活[21-22]。

圖2 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌AKP 的影響Fig.2 Effects of CAP combined with MAP on AKP of Pseudomonas fluorescens

2.4 細(xì)胞膜完整性的結(jié)果分析

2.4.1 核酸和蛋白質(zhì)泄露含量的結(jié)果分析 核酸是生物體重要的遺傳物質(zhì)，對(duì)于生命的生長(zhǎng)及延續(xù)都起著決定性作用，并控制蛋白質(zhì)的合成及代謝過程[23]，而蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是機(jī)體不可或缺的重要部分，主要擔(dān)負(fù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和細(xì)胞機(jī)體代謝[24]。核酸和蛋白質(zhì)分別在波長(zhǎng)為260 nm 和280 nm 處有最大吸收峰[25]，通過測(cè)定菌液上清液在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處的OD 值可以判斷熒光假單胞菌的核酸和蛋白質(zhì)泄露情況。如圖3所示，隨著處理時(shí)間的增加，OD260nm值和OD280nm值也隨之增長(zhǎng)，效果顯著（P<0.05）。低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝處理后，60，180 s 和300 s 處理組的OD260nm值相較于0 s 處理組分別增加了0.01，0.03 和0.04，而OD280nm值相較于0 s 處理組分別增加了0.01，0.03 和0.06。這表明核酸和蛋白質(zhì)在細(xì)胞外液中增加，說明細(xì)胞已經(jīng)破裂。其原因可能是等離子體產(chǎn)生的ROS、RNS 等物質(zhì)不僅破壞了細(xì)胞膜的完整性，而且對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生了不可逆的損傷，使胞內(nèi)大分子物質(zhì)流出，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的泄露[26-27]，同時(shí)伴隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CAP 產(chǎn)生的ROS 會(huì)破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)層，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得OD 值上升。

圖3 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌的核酸和蛋白質(zhì)泄露含量的影響Fig.3 Effects of CAP combined with MAP on nucleic acid and protein leakage of Pseudomonas fluorescens

2.4.2 ATP 活性的結(jié)果分析 ATP 主要存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是細(xì)菌生物膜中的一種蛋白酶，在物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換和信息傳輸中起重要作用，用于維持細(xì)胞內(nèi)外的K+和Na+的平衡[28]。當(dāng)機(jī)體狀態(tài)改變時(shí)，ATP 酶活性也會(huì)隨之發(fā)生改變。如圖4 所示，ATP 活性隨著處理時(shí)間的增加而顯著降低（P<0.05），60，180 s 和300 s處理組的ATP 活性相較于0 s 處理組而言分別下降了7.28，13.10，17.09 U/mg prot。這可能是因?yàn)镃AP 破壞了細(xì)胞膜而導(dǎo)致膜內(nèi)外產(chǎn)生電勢(shì)差，使菌體內(nèi)部的離子流出，ATP 活性降低，從而讓細(xì)胞內(nèi)的多種生物酶不能正常運(yùn)作，細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)受阻[29]。除此之外，ATP 下降還可能是因?yàn)镃AP 處理時(shí)抑制了三羧酸循環(huán)以及糖酵解相關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致細(xì)菌的代謝功能障礙[9]。

圖4 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌的ATP 的影響Fig.4 Effects of CAP combined with MAP on ATP of Pseudomonas fluorescens

2.4.3 PI 熒光染色的結(jié)果分析 PI 是一種核酸染料，可以用于細(xì)胞核的染色，因?yàn)镻I 無法透過正常的細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜被破壞或者細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核才能被PI 染色，因此PI 熒光染色也可用來表示細(xì)胞膜的完整性[28，30]。如圖5 所示，PI熒光強(qiáng)度隨著處理時(shí)間的增加而顯著升高（P<0.05），這是由于當(dāng)CAP 處理時(shí)破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致核酸泄露，細(xì)胞淬滅，使PI 染料進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這與核酸和蛋白質(zhì)含量的泄露的結(jié)果也相一致。有研究表明，PI 升高還可能是細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[31]，因?yàn)闊晒饧賳伟艿紺AP 處理時(shí)抗氧化酶失活，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化以及造成DNA的損傷，最終使細(xì)胞走向凋亡。當(dāng)CAP 處理的時(shí)間增長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞受到ROS、RNS 等物質(zhì)的作用體現(xiàn)在其長(zhǎng)久的延續(xù)性和接觸面，使細(xì)胞凋亡。然而180 s 和300 s 處理組的PI 熒光強(qiáng)度相差不顯著（P>0.05），這可能是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡的細(xì)胞碎片慢慢開始積聚，阻礙了CAP 產(chǎn)生的活性粒子、帶電粒子等物質(zhì)與正常細(xì)胞的接觸，從而增加了正常生長(zhǎng)代謝的熒光假單胞菌對(duì)低溫等離子體的抵抗力[32]。

圖5 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌的PI 熒光染色的影響Fig.5 Effects of CAP combined with MAP on PI fluorescence staining of Pseudomonas fluorescens

2.5 菌體內(nèi)抗氧化酶活性的結(jié)果分析

酶在生物體的生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，生物體內(nèi)的生化反應(yīng)離不開酶的作用，其主要構(gòu)成成分為蛋白質(zhì)。因此酶一旦失活或變性，那么生物體的功能與狀態(tài)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，這也能體現(xiàn)在細(xì)菌新陳代謝的變化上[33]。SOD 和CAT都是抗氧化酶，可以通過分解ROS 來減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的酶[34]。

如圖6a 所示，SOD 活性隨處理時(shí)間的增加而降低（P<0.05），其原因可能是CAP 處理時(shí)產(chǎn)生的ROS、RNS、帶電粒子等雖然在被細(xì)胞體內(nèi)的SOD與CAT 等抗氧化酶分解，然而持續(xù)性作用導(dǎo)致抗氧化酶失活，細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，使得細(xì)胞中的ROS 持續(xù)增加，加速了蛋白質(zhì)的氧化和核酸等物質(zhì)的泄露以及DNA 的損傷，最終導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡[35]。如圖6b 所示，CAT 活性隨處理時(shí)間的增加而降低（P<0.05），其原因可能是CAP 處理時(shí)產(chǎn)生的H2O2被CAT 分解，當(dāng)處理時(shí)間增加時(shí)，CAT 活性在下降，ROS、H2O2等物質(zhì)繼續(xù)攻擊和傷害細(xì)胞，細(xì)胞難以繼續(xù)維持氧化還原的平衡狀態(tài)，而當(dāng)ROS 積累并超出臨界值時(shí)，其不能及時(shí)被清除，進(jìn)而繼續(xù)破壞細(xì)胞內(nèi)的CAT 等抗氧化酶[36]。當(dāng)細(xì)胞中的氧化還原平衡最終被完全打破時(shí)便導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡，達(dá)到了殺菌的目的。

圖6 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌的抗氧化酶的影響Fig.6 Effects of CAP combined with MAP on antioxidant enzyme of Pseudomonas fluorescens

CAP 處理后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，繼而破壞內(nèi)源性抗氧化酶SOD 和CAT 的活性[37]。有研究表明，許多刺激能夠通過增加細(xì)胞內(nèi)的ROS 來激活多種氧化應(yīng)激途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[38]，而SOD、CAT 等抗氧化酶都可以抑制細(xì)胞凋亡[39]。當(dāng)SOD和CAT 活性較高時(shí)有利于保護(hù)細(xì)胞免受ROS 的損傷，同時(shí)可以減少膜脂過氧化來維持細(xì)胞膜完整性。

2.6 微觀結(jié)構(gòu)的結(jié)果分析

如圖7 所示為各處理組的SEM 結(jié)果，對(duì)照組的熒光假單胞菌呈現(xiàn)出完整的桿狀，而由于氣調(diào)包裝對(duì)其影響而呈現(xiàn)出輕微不光滑現(xiàn)象。在經(jīng)過處理后的熒光假單胞菌的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，表面粗糙、破損、黏連，這可能是當(dāng)細(xì)胞受損后，胞內(nèi)物質(zhì)流出使多個(gè)細(xì)胞聚集黏連[40]。180 s 和300 s 處理組的細(xì)胞形狀發(fā)生了顯著的改變，然而，有些細(xì)胞仍然保持著完整的膜結(jié)構(gòu)[37]。因此，從微觀結(jié)構(gòu)來看，CAP 可以破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞膜，增加其細(xì)胞壁的通透性，抑制其生長(zhǎng)或使細(xì)胞因無法正常代謝生長(zhǎng)而死亡。

圖7 低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌的微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effects of CAP combined with MAP on the microstructure of Pseudomonas fluorescens

3 結(jié)論

本研究以熒光假單胞菌為試驗(yàn)對(duì)象，以殺菌率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到優(yōu)化后的最佳處理?xiàng)l件，即處理電壓50 kV，處理時(shí)間180 s，氮?dú)夂?0%，在此條件下測(cè)得殺菌率為99.49%。低溫等離子體耦合氣調(diào)包裝對(duì)熒光假單胞菌的抑菌機(jī)理研究表明，隨著CAP 處理時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率下降；細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性被破壞，AKP 活力下降，核酸和蛋白質(zhì)泄露量增加，ATP 活性下降，PI 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；細(xì)胞體內(nèi)的抗氧化酶失活；表面形態(tài)被破壞等。因此，低溫等離子體協(xié)同氣調(diào)包裝可導(dǎo)致細(xì)胞失活或死亡，處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變化越顯著。綜上所述，低溫等離子體技術(shù)通過產(chǎn)生活性粒子可引起菌體內(nèi)部分酶的失活、蛋白質(zhì)的變性、能量代謝的停止、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞以及DNA 等遺傳物質(zhì)的損傷等[41]，最終使熒光假單胞菌死亡。