黃薈嫻，匡韻迪，張馨勻，賀曉云，2，黃昆侖，2，程 楠，2*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京100083 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083 3 柳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與食品工程學(xué)院 廣西柳州 545006）

在食源性病原體中，沙門氏菌是與食源性疾病和最終死亡相關(guān)較常見的病原體之一。沙門氏菌是一種桿狀革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，有超過2 500 種血清型，所有這些血清型都可以引起人類疾病[1]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921-2021）中明確規(guī)定25 g 或25 mL 食品樣品中不得檢出沙門氏菌[2]。然而，沙門氏菌極易污染肉、蛋、奶等食品，通常當(dāng)沙門氏菌只有一個(gè)菌落單位形成時(shí)，即可引起人類感染，其致病限度極低，傳播力強(qiáng)，防控難度大，這對(duì)食品沙門氏菌污染物的防控提出了更高的要求[3]。沙門氏菌檢測(cè)的傳統(tǒng)方法（GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》）[4]一般需要3～5 d，周期長，過程繁瑣，有時(shí)還出現(xiàn)假陰性，難以適應(yīng)食品檢驗(yàn)中快速、簡便、準(zhǔn)確率高的要求。

生物傳感器作為一種簡便、靈敏、低成本的分析手段，為食品安全快速檢測(cè)特別是病原體、蛋白質(zhì)、重金屬及抗生素等提供了有效的保障[5-6]。然而，在檢測(cè)復(fù)雜樣品過程中往往存在基質(zhì)的干擾，導(dǎo)致生物傳感器的檢測(cè)靈敏度和結(jié)果科學(xué)性受到影響。近年來，采用聚乙二醇[7]、兩性離子[8]、多肽[9]等抗污染材料改性生物傳感器的研究受到越來越多的關(guān)注[10]。抵抗復(fù)雜樣品基質(zhì)中的干擾，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度和特異性，保障最終檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性，抗污染生物傳感器在快速檢測(cè)領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用顯得尤為重要[11]。目前，生物傳感器在檢測(cè)復(fù)雜樣品過程中的技術(shù)難點(diǎn)之一在于基質(zhì)的干擾[12]。不同檢測(cè)樣品中的復(fù)雜性也有所不同，如食品樣品中常見的干擾基質(zhì)為食品成分（蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、水、維生素、礦物質(zhì)分子、低分子添加劑等）[13]。干擾基質(zhì)的存在可能導(dǎo)致傳感器檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差，信號(hào)強(qiáng)度減弱，特異性識(shí)別反應(yīng)失效等問題。為了抵抗復(fù)雜樣品中的基質(zhì)干擾，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度和特異性，研究人員開發(fā)出基于抗污染材料的光學(xué)[14]、電化學(xué)[15]、表面等離子體共振[16]和水凝膠[17]傳感器，用于快速檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)，以保障最終檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。

棉簽拭子作為一種易獲得、易改性、成本低的快速檢測(cè)元件，已被廣泛應(yīng)用于樣品采集、靶標(biāo)富集和定量檢測(cè)中[18]。拭子是指小棍的一端利用棉花等纖維材料纏繞成具有吸收能力的小團(tuán)，另一端可以直接手持的工具，通常用于微生物、脫落細(xì)胞或分泌物的采集和檢測(cè)[19]。由于棉簽拭子表面存在豐富的活性羥基基團(tuán)，具備強(qiáng)大的化學(xué)修飾條件，因此近年來許多研究者將拭子與生物分子（如抗體[20]、適配體[21]等）修飾結(jié)合，使其作為生物傳感檢測(cè)的組成原件之一。拭子的易獲得性、低成本性、便攜性、易修飾性，已在檢測(cè)致病菌[22]、病毒[23]、體液有機(jī)物[24]以及環(huán)境中危害因子[25]等方面中發(fā)揮重要作用，極大提高了現(xiàn)場快速檢測(cè)的效率。

本研究構(gòu)建基于抗污染比色拭子的檢測(cè)平臺(tái)，藍(lán)色乳膠微球-適配體作為比色信號(hào)探針，通過肉眼觀察棉簽拭子表面顏色變化可得到定性檢測(cè)結(jié)果，利用便攜式色差儀配合智能手機(jī)得到定量檢測(cè)結(jié)果。通過SBMA 改性棉簽拭子，使其具備抗污染特性，避免實(shí)際樣品檢測(cè)中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，無需樣品前處理即可定量檢測(cè)牛奶中的沙門氏菌。為進(jìn)一步提升兩性離子改性棉簽拭子在致病菌超靈敏和現(xiàn)場快檢領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

2-（甲基丙烯酰基氧基）乙基二甲基-（3-磺酸丙基）氫氧化銨（SBMA），阿拉丁公司；2-羥基-4'-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮（Irgacure2595）、牛血清白蛋白（BSA），美國Sigma 公司；10×PBS 緩沖液、Tris-HCl 緩沖液，索萊寶公司；濃硫酸（H2SO4）、鹽酸（HCl）、氯化鈉（NaCl），均為分析純級(jí)，北京化工廠；高碘酸鈉（NaIO4），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺，均為分析純級(jí)，麥克林公司；HE 瓊脂培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、沙門氏菌生化鑒定盒，北京陸橋公司；羧基藍(lán)色微球，華泰昕生物公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒，碧云天公司。

1.2 儀器與設(shè)備

透射電子顯微鏡TEM，美國FEI 公司；熒光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；多用途旋轉(zhuǎn)搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO 公司；臺(tái)式離心機(jī)及恒溫金屬浴，美國Scilogex 公司；分析天平，德國Sartorius 公司；微量移液器，德國Eppendorf 公司；漩渦混合器，江蘇其林貝爾儀器制造公司；LS170 色差儀，深圳林上科技有限公司；Mili-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司。

1.3 適配體序列（從5'到3'）

試驗(yàn)所用適配體信息見表1。

表1 適配體序列Table 1 Aptamer sequences

1.4 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)所用菌株信息見表2。

表2 菌株信息Table 2 Strain information

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 改性拭子的制備

1.5.1.1 活化棉簽 在10 mL 水中加入240 mg高碘酸鈉（NaIO4）和100 μL 濃硫酸（H2SO4），混合10 min。然后，將棉簽浸泡在該溶液中，在37 ℃黑暗環(huán)境中培養(yǎng)4 h，以激活羥基，生成醛基。用蒸餾水清洗被激活的棉簽2 次，以去除多余的激活劑。然后，在烘箱中干燥并在4 ℃儲(chǔ)存，得到活化棉簽。

1.5.1.2 SBMA 棉簽 將激活的棉簽浸入含558 mg/mL SBMA 和1% Irgacure2595 的PBS 緩沖液中。棉簽完全浸泡后，用365 nm UV 燈照射20 min，擦干后保存在4 ℃。

1.5.1.3 SBMA/Aptamer 棉簽 在1 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）中加入100 μL 10 nmol/L 誘導(dǎo)劑SAT-NH2，將SBMA 棉簽浸入該溶液中，在37 ℃下孵育4 h，用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）洗滌2次。接下來，去除未結(jié)合的誘導(dǎo)劑，干燥并儲(chǔ)存在4 ℃，得到SBMA/Aptamer 棉簽。

1.5.2 實(shí)際樣品蛋白黏附測(cè)定 將未改性棉簽、活化棉簽、SBMA 棉簽和SBMA/Aptamer 棉簽分別在牛奶樣品（蛋白含量約為30 mg/mL）中浸泡10 min，蒸餾水清洗3 次后，用BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定殘留在棉簽上的蛋白質(zhì)[29]。

1.5.3 藍(lán)色乳膠微球/適配體的合成及表征

1.5.3.1 藍(lán)色乳膠微球的表征 通過透射電子顯微鏡（TEM）圖像確認(rèn)藍(lán)色乳膠微球的尺寸與形態(tài)[30]。

1.5.3.2 藍(lán)色乳膠微球/適配體的合成 將200 μL 藍(lán)色乳膠微球溶液移入1 mL 離心管中并用蒸餾水洗滌3 次，然后加入新制備的EDC（0.57 mg/mL）和NHS（12 mg/mL）進(jìn)行偶聯(lián)活化，隨后用蒸餾水洗滌微球以除去過量的偶聯(lián)劑。將蒸餾水中的活化的微球以10 000 r/min 的速度離心10 min后，完全吸出上清液，將20 μL 10 nmol/L 適配體SAT-NH2溶液與280 μL Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）混合均勻后，添加到洗滌過的活化微球中，在4 ℃下孵育過夜以幫助適配體固定在活化的納米珠上。使用1%牛血清白蛋白（BSA）4 ℃下孵育30 min，封閉納米顆粒的未結(jié)合位點(diǎn)。隨后用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）洗滌納米珠以去除未連接上的BSA，制備好的藍(lán)色乳膠微球/適配體在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3.3 藍(lán)色乳膠微球-適配體的表征 用20 μL 10 nmol/L 適配體FAM-SAT-NH2加入到280 μL Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）中，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定偶聯(lián)前上清液熒光強(qiáng)度。重復(fù)1.5.3.2 節(jié)的試驗(yàn)操作，與適配體孵育過夜后離心（1 000 r/min，10 min）測(cè)定偶聯(lián)后上清液熒光強(qiáng)度。得到偶聯(lián)前、后上清液相對(duì)熒光強(qiáng)度差值，計(jì)算適配體與藍(lán)色乳膠微球的結(jié)合效率。

1.5.4 適配體的篩選 在強(qiáng)親和力96 孔板中加入100 μL 的沙門氏菌細(xì)菌懸浮液，空白組中加入100 μL 的PBS 緩沖溶液，37 ℃下孵育3 h，倒出包被液，用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）洗滌3 次，除去未結(jié)合的細(xì)菌。每孔加入100 μL 1% BSA 溶液孵育30 min 封閉未結(jié)合位點(diǎn)，緩沖溶液洗滌3 次。加入帶有熒光標(biāo)記的50 μL 適配體溶液（STA1/STA2 濃度：1 μmol/L）室溫孵育1 h，倒出后用緩沖液洗滌3 次。加100 μL 緩沖溶液反復(fù)吹吸孔內(nèi)溶液后，吸取混勻的溶液，用熒光分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.5.5 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.5.5.1 棉簽適配體濃度優(yōu)化 將制備好的干燥SBMA 棉簽分別放到5 管含有1 mL Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）的試管中，每管分別加入100 μL 適配體SAT-NH2（1，10，100，1 000，10 000 nmol/L），37 ℃下孵育4 h，用緩沖液洗滌3 次后烘干，在相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌液（103CFU/mL）中孵育10 min，Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）清洗2 次后在相同濃度的藍(lán)色乳膠微球/適配體懸浮液中孵育10 min，Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）清洗2 次，然后用色差儀測(cè)定棉簽的RGB 值，計(jì)算得到不同適配體濃度棉簽的灰度值變化，確定制備適配體棉簽所需的適宜適配體濃度。

1.5.5.2 藍(lán)色乳膠微球適配體濃度優(yōu)化 將1.5.5.1節(jié)中優(yōu)化好適配體濃度的棉簽在相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌液（105CFU/mL）中孵育10 min，Tris-HCl 緩 沖液（pH 8.5）清洗2 次，分別在1，10，100，1 000，10 000 nmol/L 適配體結(jié)合的藍(lán)色乳膠微球懸浮液中孵育10 min，Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）清洗2次，然后用色差儀測(cè)定棉簽的RGB 值，計(jì)算得到在不同適配體濃度藍(lán)色乳膠微球中孵育棉簽的灰度值變化，確定制備藍(lán)色乳膠微球/適配體懸浮液所需的適配體濃度。

1.5.5.3 檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化 將在最適適配體濃度條件下，將棉簽浸沒在標(biāo)準(zhǔn)菌液（106CFU/mL）中孵育5，10，15，20 min，Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）清洗2 次后，在藍(lán)色乳膠微球/適配體懸浮液中孵育5，10，15，20 min，分別得到16 組不同孵育時(shí)間的檢測(cè)棉簽，用色差儀測(cè)定棉簽的RGB 值，計(jì)算得到在孵育時(shí)間下棉簽的灰度值變化，確定最優(yōu)檢測(cè)時(shí)間。

1.5.5.4 改性前、后對(duì)比色信號(hào)的影響 將活化棉簽在最適適配體濃度條件下37 ℃孵育4 h，烘干，得到未改性棉簽。未改性棉簽和SBMA/Aptamer 棉簽在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，浸沒在緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)菌液（102CFU/mL）中孵育10 min，Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）清洗2 次后，在藍(lán)色乳膠微球/適配體懸浮液中孵育10 min，用色差儀測(cè)定棉簽的RGB 值，計(jì)算棉簽的灰度值得到改性前、后對(duì)棉簽比色信號(hào)的影響。

1.5.6 檢測(cè)性能分析

1.5.6.1 靈敏度 在最佳試驗(yàn)條件下制備檢測(cè)棉簽，用十倍稀釋法配制不同濃度的沙門氏菌溶液，測(cè)試所制備棉簽的最低檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）。

1.5.6.2 特異性 在最佳試驗(yàn)條件下制備檢測(cè)棉簽，配制菌液濃度均為105CFU/mL 的沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌以及高溫高壓滅菌后的沙門氏菌溶液，測(cè)試所制備棉簽的特異性。

1.5.6.3 牛奶樣品的檢測(cè) 使用從超市獲得的牛奶樣品，將一定濃度的菌液加入到牛奶中，用HE培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法[4]、GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》中的檢測(cè)方法[4]和本研究的比色拭子法分別對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)，將所得結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)原理的設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)利用抗污染比色拭子、藍(lán)色乳膠微球、色差儀，通過夾心法構(gòu)建了簡單、快速、抗污染、靈敏檢測(cè)牛奶中沙門氏菌的快速檢測(cè)方法，試驗(yàn)原理見圖1。首先將抗污染棉簽拭子浸沒在牛奶樣品中孵育10 min，此時(shí)棉簽上的適配體能特異性捕獲樣品中的沙門氏菌，而兩性離子SBMA 水凝膠能有效阻礙牛奶中非特異性蛋白的靠近，從而起到抗污染的效果，接著蒸餾水清洗兩次以除去未結(jié)合的細(xì)菌；然后將棉簽浸沒在適配體/藍(lán)色納米微球溶液中孵育10 min，此時(shí)藍(lán)色納米微球上的適配體能特異性識(shí)別棉簽上攜帶的沙門氏菌從而使棉簽肉眼可見變藍(lán)，用蒸餾水清洗2 次以除去未結(jié)合的藍(lán)色乳膠微球。將棉簽放入暗盒中，利用便攜式色差儀讀取比色棉簽顏色，色差儀通過藍(lán)牙將實(shí)時(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)傳入智能手機(jī)中，得到抗污染比色棉簽的RGB 值，最后通過計(jì)算灰度值得到沙門氏菌定量檢測(cè)結(jié)果。

圖1 基于色差儀定量的比色拭子檢測(cè)沙門氏菌的原理圖Fig.1 Schematic diagram of colorimetric swab detection of Salmonella based on colorimeter quantification

2.2 藍(lán)色乳膠微球-適配體表征評(píng)價(jià)

通過TEM 電鏡觀察（圖2），可看到藍(lán)色乳膠微球呈球狀，大小均一，平均粒徑約為250 nm。

圖2 藍(lán)色乳膠微球TEM 電鏡圖譜Fig.2 TEM image of blue latex microspheres

通過測(cè)定偶聯(lián)前、后藍(lán)色乳膠微球/適配體上清液的熒光強(qiáng)度，如圖3 所示，可知偶聯(lián)前相對(duì)熒光強(qiáng)度F1 約為524.29，偶聯(lián)后上清液相對(duì)熒光強(qiáng)度為0，說明適配體偶聯(lián)成功。

圖3 熒光分光光度計(jì)分析藍(lán)色乳膠微球-適配體偶聯(lián)效果Fig.3 Analysis of blue latex microsphere-aptamer coupling effect by fluorescence spectrophotometer

2.3 適配體選擇結(jié)果

根據(jù)先前文獻(xiàn)報(bào)道[27-28]，篩選出2 個(gè)沙門氏菌適配體STA1 和STA2，用96 孔板孵育沙門氏菌，通過酶聯(lián)免疫法用帶有熒光基團(tuán)的適配體測(cè)定沙門氏菌與適配體的親和力。STA1 的親和結(jié)果如圖4a 所示，沒有孵育菌液的空白組，洗板后熒光相對(duì)強(qiáng)度為220.024，沙門氏菌組的相對(duì)熒光強(qiáng)度洗板后增加至477.993，STA1 與細(xì)菌的結(jié)合效率為53.97%。STA2 親和結(jié)果如圖4b 所示，空白組洗板后熒光相對(duì)強(qiáng)度為239.861，沙門氏菌組的相對(duì)熒光強(qiáng)度增加至379.793，結(jié)合效率為36.84%。因此，選擇結(jié)合效率更高的STA1 作為沙門氏菌的識(shí)別元件。

圖4 熒光分光光度計(jì)分析兩種適配體與沙門氏菌的結(jié)合效果Fig.4 Analysis of the binding effect of two aptamers to Salmonella by fluorescence spectrophotometer

2.4 試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

綜合考慮影響比色拭子傳感器在檢測(cè)過程中的關(guān)鍵點(diǎn)，試驗(yàn)中選擇以下3 點(diǎn)要素進(jìn)行體系優(yōu)化：1）棉簽以及藍(lán)色乳膠微球中適配體的濃度；2）檢測(cè)時(shí)間；3）檢測(cè)孵育方式。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 棉簽拭子檢測(cè)沙門氏菌的試驗(yàn)條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of experimental conditions for detection of Salmonella by cotton swabs

對(duì)棉簽和藍(lán)色乳膠微球的適配體濃度進(jìn)行優(yōu)化，由圖5a 可知，當(dāng)棉簽適配體濃度為10 nmol/L后灰度值趨于穩(wěn)定，使用高濃度的適配體確實(shí)會(huì)使灰度值提高，為節(jié)約成本，擇優(yōu)選取低濃度高信號(hào)的檢測(cè)體系。由圖5b 可知，當(dāng)藍(lán)色乳膠微球的適配體濃度為10 nmol/L 時(shí)灰度值最高，原因是藍(lán)色乳膠微球上與適配體的結(jié)合位點(diǎn)有限，過量的適配體無法與藍(lán)色乳膠微球結(jié)合或使微球表面適配體接枝密度過大導(dǎo)致灰度值下降。

對(duì)16 組不同孵育時(shí)間檢測(cè)棉簽的灰度值進(jìn)行比較分析，如圖5c 所示，雖然5 min 孵育時(shí)間能達(dá)到較高的灰度值，但在實(shí)際試驗(yàn)中，較短時(shí)間孵育條件下檢測(cè)棉簽的顯色效果肉眼觀察不顯著，其較低的空白組灰度值提高了整組檢測(cè)灰度值結(jié)果，因此得到的檢測(cè)結(jié)果存在偶然性；而孵育時(shí)間過長則達(dá)不到快速檢測(cè)的要求，因此高于30 min的組合時(shí)間不予考慮。因此擇優(yōu)選擇細(xì)菌孵育10 min，藍(lán)色乳膠微球孵育10 min 的檢測(cè)時(shí)間組合。

為了評(píng)估SBMA 改性棉簽表面在食品復(fù)雜基質(zhì)中的抗污染效果，選擇牛奶作為檢測(cè)體系，利用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)試了未改性棉簽、活化棉簽、SBMA 棉簽和SBMA/Aptamer 棉簽的蛋白吸附情況。結(jié)果如圖6a 所示，未改性棉簽的OD 值明顯高于SBMA 棉簽，說明未經(jīng)改性的棉簽中殘留大量食品基質(zhì)中蛋白質(zhì)，而通過SBMA 改性后的棉簽?zāi)苡行p少檢測(cè)過程中樣品基質(zhì)蛋白的干擾。在牛奶實(shí)際樣品中SBMA 改性后的棉簽與未改性棉簽相比，蛋白含量分別下降41.82%，且添加適配體后均不影響其抵抗蛋白效果，蛋白含量與未改性面前相比下降39.13%，抗蛋白黏附效果顯著。

圖6 SBMA 改性棉簽對(duì)比色信號(hào)的影響Fig.6 The effect of SBMA modified cotton swabs on contrasting color signals

用未改性的空白棉簽和SBMA/Aptamer 棉簽檢測(cè)低濃度標(biāo)準(zhǔn)菌液，觀察改性前、后對(duì)比色信號(hào)的影響。結(jié)果由圖6b 可得，未改性棉簽的空白組灰度值顯著低于改性后棉簽，且空白組肉眼可見棉簽變藍(lán)，說明未改性的棉簽易吸附藍(lán)色乳膠微球而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌液時(shí)，改性后的棉簽產(chǎn)生的顏色信號(hào)顯著高于未改性組，且空白組與檢測(cè)組的差值顯著高于未改性棉簽，由此可證明，改性后棉簽產(chǎn)生的比色信號(hào)高于未改性棉簽。

2.5 檢測(cè)性能分析

2.5.1 靈敏度及最低檢測(cè)限 在最佳試驗(yàn)體系下對(duì)傳感器靈敏度進(jìn)行測(cè)定，由圖7 可知，在細(xì)菌濃度達(dá)到107CFU/mL 后比色拭子灰度值趨于穩(wěn)定。細(xì)菌濃度在103～107CFU/mL 范圍呈線性相關(guān)，通過LOD=3.3×σ/S，σ 為空白組的標(biāo)準(zhǔn)差，S 為線性方程斜率，計(jì)算得到LOD 為117.80 CFU/mL。

圖7 比色拭子傳感器檢測(cè)不同濃度沙門氏菌的靈敏度Fig.7 Sensitivity of a colorimetric swab sensor to detect different concentrations of Salmonella

2.5.2 特異性 在最佳試驗(yàn)體系下，分別對(duì)空白組、大腸桿菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、6 種細(xì)菌混合菌液（致病菌的菌液濃度均為105CFU/mL）以及高溫高壓滅菌后的沙門氏菌溶液進(jìn)行傳感器的特異性檢測(cè)。如圖8 所示，傳感器對(duì)沙門氏菌的響應(yīng)信號(hào)遠(yuǎn)大于其它致病菌，具有良好的特異性。

圖8 比色拭子傳感器檢測(cè)沙門氏菌的特異性Fig.8 Specificity of a colorimetric swab sensor for detection of Salmonella

2.6 牛奶樣品檢測(cè)

在最佳試驗(yàn)體系下，采用比色拭子對(duì)實(shí)際樣品測(cè)試分析。通過人工添加不同濃度沙門氏菌制成實(shí)際檢測(cè)樣品。首先通過本傳感器進(jìn)行分析，然后用HE 培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)對(duì)比，隨后參照GB 4789.4-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》中的檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如表3 所示，國標(biāo)方法局限于定性檢測(cè)，對(duì)于添加標(biāo)準(zhǔn)菌液的樣品均能檢出陽性，本方法可在檢出限范圍內(nèi)給出具體的定量結(jié)果，回收率在94.15%～108.26%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表3 不同檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌污染的牛奶樣品的檢測(cè)Table 3 Detection of Salmonella-contaminated milk samples by different detection methods

3 討論

在構(gòu)建的抗污染比色拭子中，識(shí)別元件為沙門氏菌特異性適配體，比色信號(hào)為“藍(lán)色乳膠微球/適配體”信號(hào)探針，抗污染材料為兩性離子SBMA，檢測(cè)過程采用夾心法，通過肉眼可以定性測(cè)定牛奶樣品中的沙門氏菌，借助比色儀和智能手機(jī)作為終端定量設(shè)備可實(shí)現(xiàn)比色信號(hào)的快速讀取和沙門氏菌的定量快速檢測(cè)。本試驗(yàn)中通過優(yōu)化試驗(yàn)條件，使整個(gè)檢測(cè)過程能在20 min 內(nèi)完成，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。本試驗(yàn)運(yùn)用抗污染改性棉簽拭子，提升傳感器的抗污染特性，避免牛奶中非特異性大分子物質(zhì)干擾檢測(cè)信號(hào)，無需樣品前處理即可快速檢測(cè)，該方法為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場即時(shí)快速檢測(cè)提供可能性。

由于實(shí)際樣品的復(fù)雜性、基質(zhì)中干擾因素的多樣性，在實(shí)際檢測(cè)過程中抗污染棉簽拭子不能完全排除非特異性物質(zhì)（如牛奶中的小分子添加劑、脂質(zhì)等）的干擾，檢測(cè)過程中仍然會(huì)在棉簽拭子頭部殘留藍(lán)色信號(hào)探針，容易造成檢測(cè)結(jié)果偏差。此外，比色法對(duì)于有顏色的食品樣品（如黃色的蛋液、紅色的番茄汁等）有一定局限性，易造成比色結(jié)果偏差，導(dǎo)致假陽性或假陰性的錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生。因此，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)完善除蛋白質(zhì)外其它非特異性物質(zhì)的抗污染效果評(píng)價(jià)，以及利用其它的傳感信號(hào)以解決有色食品基質(zhì)中沙門氏菌的快速檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究首先用光引發(fā)聚合法制備了兩性離子SBMA 改性的抗污染棉簽拭子，通過便面蛋白黏附測(cè)試驗(yàn)證其在牛奶基質(zhì)中抵抗非特異性蛋白黏附的性能。其次，利用EDC/NHS 激活適配體與藍(lán)色乳膠微球發(fā)生酰胺反應(yīng)，形成藍(lán)色乳膠微球/適配體偶聯(lián)聚合物，形成傳感檢測(cè)比色信號(hào)探針。最后，通過試驗(yàn)條件優(yōu)化，得到抗污染棉簽拭子和藍(lán)色乳膠微球集成的快速檢測(cè)平臺(tái)，使整個(gè)檢測(cè)結(jié)果能在20 min 內(nèi)完成，與傳統(tǒng)檢測(cè)法相比，檢測(cè)時(shí)間更快，滿足快速檢測(cè)需求。利用肉眼進(jìn)行定性結(jié)果測(cè)定，并配合使用便攜式色差儀與智能手機(jī)結(jié)合的檢測(cè)裝備定量讀出檢測(cè)結(jié)果，操作簡單，為現(xiàn)場快速檢測(cè)執(zhí)法操作提供可能。本研究建立的基于抗污染比色拭子傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的高特異識(shí)別和高靈敏檢測(cè)。對(duì)沙門氏菌的線性檢測(cè)范圍為103～107CFU/mL，檢測(cè)限為117.80 CFU/mL。本研究還將比色拭子法與國標(biāo)法和傳統(tǒng)平板技術(shù)法進(jìn)行對(duì)比，在檢測(cè)范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確高效地對(duì)無需前處理的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)。比色拭子法的檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)法和平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果一致，回收率在94.15%～108.26%。為進(jìn)一步提升兩性離子改性棉簽拭子在致病菌超靈敏和現(xiàn)場快檢領(lǐng)域中的發(fā)展的可能。