張 彪，蔡丹鳳，姚天擇，郎一涵，傅炎勇，申屠旭萍，俞曉平

（1 中國計量大學生命科學學院 杭州310018 2 杭州銘治醫(yī)學檢驗實驗室有限公司 杭州 310020）

氯霉素（Chloramphenieol，CAP）作為廣譜抑菌抗生素，曾作為特效藥應用于治療人類的傷寒、副傷寒及敏感菌所致的嚴重感染性疾病[1]，也曾作為畜禽和水產養(yǎng)殖投入品，多用于畜禽、水產品中厭氧菌感染和敏感微生物所致各種感染性疾病[2-4]。消費者長期使用氯霉素易引起造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經系統(tǒng)疾?。宦让顾貧埩粢渍T發(fā)致病菌的耐藥性，且經食物鏈被攝入消費者體內后，長期慢性積累后具有潛在的危害[5-7]。因此，歐美等國家已明令禁止使用氯霉素，我國農業(yè)農村部也相繼發(fā)布并完善了《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，規(guī)定氯霉素不得用于食品和動物，動物性食品中不得檢出氯霉素[8-9]。然而，由于利益的驅使以及檢測難度大，動物性食品特別是水產品中氯霉素非法使用問題未得到有效控制和解決，仍然較為突出。因此開發(fā)一種操作簡單、檢測快速、高效靈敏的氯霉素分析方法顯得極為重要。

目前，氯霉素的分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[10]、氣相色譜法（GC）[11]、液質聯(lián)用法（LC-MS/MS）[12]、氣質聯(lián)用法（GC-MS）[13]、微生物法[14]和酶聯(lián)免疫分析法[15-17]。液相與氣相色譜法分析氯霉素，檢測樣本少，難以實現(xiàn)大規(guī)模樣品檢測；與前兩種色譜法相比，液質聯(lián)用法和氣質聯(lián)用法雖然靈敏度高，檢測限低，但需要專業(yè)化人員操作，儀器成本和維護費用昂貴，不宜大規(guī)模應用；微生物法操作時間長且誤差大，靈敏度不高，難以大規(guī)模普及應用[18-19]。因此，急需開發(fā)一種檢測成本低、檢測效率高的氯霉素快速檢測方法。

近年來，抗體-抗原免疫分析技術因具有靈敏度高、檢測成本低、產品可商業(yè)化及可實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測等優(yōu)點，而成為最具有發(fā)展和應用前景的痕量分析技術之一[20]。本研究利用氯霉素抗體與抗原，系統(tǒng)優(yōu)化工作條件，構建氯霉素的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法（ic-ELISA），并應用水產品中氯霉素殘留量的快速檢測，以期為其它小分子目標物酶聯(lián)免疫吸附測定法的開發(fā)，動物性食品中氯霉素的快速檢測提供高效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；氯霉素抗體，天津泰進科技有限公司；卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、過氧化氫脲、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），Sigma 公司；氯霉素包被原（CAP-OVA）實驗室制備；其它試劑均為分析純級。

Genics 酶標儀，TECAN 公司；96 孔酶標板，丹麥Nunc 公司；Millipore/Rios8 超純水系統(tǒng)，法國Millipore 公司；CP80WX 超速離心機，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 包被原添加量和抗體稀釋倍數的優(yōu)化 96微孔板每孔包被原的添加量依次為0.01，0.05，0.10 μg，抗體稀釋倍數為1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000，1∶12 000，1∶16 000，1∶24 000，1∶32 000，二抗稀釋倍數為1∶1 000，進行組合試驗，加入底物溶液顯色后，利用酶標儀測定不同條件下在波長450 nm 處的OD 值，并按照式（1）計算抑制率[21]。

1.2.2 包被原包被條件與封閉液的優(yōu)化 在1.2.1節(jié)試驗結果上，分別選4 ℃-12 h，4 ℃-14 h，4℃-16 h，37 ℃-2 h，37 ℃-3 h，37 ℃-4 h 6 種方式進行包被原包被，測定不同條件下OD 值，并計算IC50值；然后分別選0.5%脫脂乳粉，1.0%脫脂乳粉，0.5% BSA，1.0% BSA，0.5%明膠和1.0%明膠進行封閉液優(yōu)化試驗。

1.2.3 氯霉素間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（ic-ELISA）的構建 競爭反應時間及溫度，酶標二抗反應時間等參考前期工作[22]。ic-ELISA 方法的構建步驟如下[22]：在最佳包被條件下，包被原包被96微孔（100 μL/孔）；磷酸鹽緩沖液（PBST）洗板3次，200 μL/孔封閉液37 ℃封閉1 h；PBST 洗板3次，加入梯度標準或5 倍稀釋樣品提取液（50 μL/孔）和抗體（50 μL/孔），37 ℃孵育1 h；PBST 洗板4 次，加入酶標二抗（100 μL/孔），37 ℃孵育0.5 h；PBST 洗板5 次，加入底物37 ℃顯色15 min，1.25 mol/L 硫酸（50 μL 孔）終止反應，測定波長450 nm 處OD 值，計算不同標準品的抑制率，以氯霉素質量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標擬合S 型標準曲線，根據標準曲線獲得本方法的靈敏度（IC50）和檢測限（IC15）。

1.2.4 氯霉素ic-ELISA 特異性評價 選取氯霉素結構類似物（氟苯尼考、甲砜霉素）和孔雀石綠、隱色孔雀石綠、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、四環(huán)素、沙丁胺醇、慶大霉素、甲硝唑、結晶紫等11 種同類抗生素進行方法特異性評價，評價的指標為交叉反應率，計算方法見式（2）[22]。

1.2.5 氯霉素ELISA 的穩(wěn)定性和應用性評價 日內和日間變異系數（CV）評價方法的穩(wěn)定性[23]，選取大黃魚、縊蟶、牛蛙等水產品進行方法應用性評價。樣品處理如下[3]：首先準確稱取2.0 g 肌肉樣品，加入到含6.0 mL 乙酸乙酯中，充分振蕩5 min，5 000 r/min 離心5 min 后，取3.0 mL 上清液，50 ℃下氮氣吹干，依次加入2.0 mL PBS 溶液和2.0 mL 正己烷均渦旋60 s，5 000 r/min 離心5 min 后，取下層水相用于分析。樣品加標水平為5.0，10.0，20.0 μg/kg。LC-MS/MS 檢測氯霉素的樣品處理和分析條件參考GB/T 20756-2006 《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[24]。

2 結果與討論

2.1 包被原添加量和抗體稀釋倍數的優(yōu)化

包被原添加量和抗體的稀釋倍數是影響酶聯(lián)免疫吸附分析法靈敏度和檢測限的重要因素之一[25]。試驗結果如圖1 所示，每孔的包被量相同，隨著抗體稀釋倍數增加，OD 值和IC50值整體呈現(xiàn)下降趨勢；當每孔包被原包被量為0.05 μg，抗體稀釋倍數為1∶16 000 時，IC50值最小，OD 值為0.84，因而選擇每孔包被量為0.05 μg，抗體稀釋倍數為1∶16 000 進行后續(xù)研究。

圖1 包被量與抗體稀釋條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of coating antigen amount and antibody dilution conditions

包被原包被條件和封閉液的種類及濃度是影響酶聯(lián)免疫分析方法靈敏度（IC50）的重要因素[25]。如圖2 所示，不同包被條件的OD 值差異顯著（P<0.05），其中包被條件為4 ℃-14 h，4 ℃-16 h，37 ℃-3 h，37 ℃-4 h 時，IC50值較低，且IC50值差異不顯著（P>0.05），變異系數小于4.53%，說明上述的包被條件下方法的穩(wěn)定性好，結合檢測時間和實際情況考慮，本研究選擇包被條件為4 ℃-14 h 進行后續(xù)試驗。如圖3 所示，選取BSA和明膠封閉時，IC50值高于同質量分數的脫脂乳粉，差異極顯著（P<0.01）；0.5%脫脂乳粉為封閉液，IC50值最低。因此封閉液選擇0.5%脫脂乳粉。

圖2 包被條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of temperature and time of coating condition

圖3 封閉液種類的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the type of blocking solution

2.2 氯霉素ic-ELISA 標準曲線的構建

經過上述試驗條件的優(yōu)化，構建氯霉素ic-ELISA 最佳工作條件：包被量為0.05 μg/孔，包被條件為4 ℃-14 h，0.5%脫脂乳粉為封閉液，抗體稀釋倍數為1∶16000。如圖4 所示，本研究構建的氯霉素的“S”型標準曲線的方程為y=98.6856+（11.3477-98.6856）/[1+（x/6.1134）1.0235]（R2=0.9994），計算得靈敏度IC50=（4.88±0.33）μg/L，檢測限IC15=（0.29±0.13）μg/L。

圖4 氯霉素ic-ELISA 方法標準曲線Fig.4 Standard curve of CAP by ic-ELISA

2.3 氯霉素ic-ELISA 方法特異性評價

為進一步驗證氯霉素ic-ELISA 方法的有效性，本研究通過交叉反應率進行氯霉素ic-ELISA 特異性評價[26]。如表1 所示，氯霉素ic-ELISA 方法結果分析表明，氟苯尼考、甲砜霉素、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、四環(huán)素、沙丁胺醇、慶大霉素、甲硝唑和結晶紫的交叉率低于0.1%，說明氯霉素抗體不能識別氯霉素的結構類似物和11 種同類抗生素，構建的氯霉素ic-ELISA 方法特異性良好。

表1 交叉反應率檢測結果Table 1 The detection results of cross-reaction rate

2.4 氯霉素ic-ELISA 方法穩(wěn)定性和應用性評價

本研究采用日內和日間變異系數評價氯霉素ic-ELISA 方法的穩(wěn)定性，實際樣品檢測和加標回收評價氯霉素ic-ELISA 方法的應用性。如表2 所示，氯霉素ic-ELISA 方法的日內變異系數（CV）在2.28%～4.63%之間，日間CV 值在3.56%～6.96%之間，LC-MS/MS 方法CV 值在0.69%～1.94%之間，構建的氯霉素ic-ELISA 方法穩(wěn)定性良好。對大黃魚、縊蟶、牛蛙樣品中氯霉素進行檢測，儀器分析與本方法均未檢測到本底濃度，樣品中添加5.0，10.0，20.0 μg/kg 3 個水平，加標回收試驗結果表明，ic-ELISA 方法對氯霉素回收率在83.90%～100.73%之間。對ic-ELISA 和LC-MS/MS 進行氯霉素檢測結果進行線性回歸分析（圖5），日內（日間）檢測數據與LC-MS/MS 檢測數據相關系數R2=0.9924（R2=0.9793），說明ic-ELISA 檢測結果與LC-MS/MS 檢測結果具有很好的一致性。本文構建的氯霉素ic-ELISA 方法，穩(wěn)定性良好，可應用于水產品中氯霉素含量的檢測。

圖5 ic-ELISA 與LC-MS/MS 檢測結果相關性分析Fig.5 Correlation analysis of detection results between ic-ELISA and LC-MS/MS

3 結論

本文以食品動物禁用獸藥氯霉素為研究對象，系統(tǒng)優(yōu)化間接競爭酶聯(lián)免疫分析（ic-ELISA）方法的包被原添加量、抗體稀釋倍數、包被條件、封閉液種類等工作參數，建立ic-ELISA 方法。所構建氯霉素ic-ELISA方法，靈敏度為（IC50）4.88 μg/L，檢測限（IC15）為0.29 μg/L，本方法只特異性識別氯霉素，不能識別結構類似物和同類抗生素，交叉反應率均低于0.1%。 本文構建的氯霉素ic-ELISA對大黃魚、縊蟶、牛蛙添加回收率范圍為83.90%~100.73%，變異系數（CV）范圍為2.28%~6.96%， 檢測結果與LC-MS/MS檢測結果具有較好的一致性。 綜上所述，本文構建的氯霉素ic-ELISA 方法，可應用于水產品中氯霉素殘留進行準確檢測，為食品安全提供一份保障。同時，本方法為禁止使用的農獸藥殘留、生物毒素、非法添加劑以及其它食品危害因子間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法開發(fā)與應用提供技術參考。