王云云， 石廣革， 孫嘉笛， 陸 欣， 紀(jì) 劍， 孫秀蘭*,

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤 274000）

真菌毒素是一類由曲霉菌、鐮刀菌、青霉菌等絲狀真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。 常見的真菌毒素如赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和伏馬菌素，可通過日常飲食被生物體攝入并在體內(nèi)累積，對生物體的肝腎功能、生殖系統(tǒng)、免疫功能等造成不可逆的傷害[1-2]。2013—2014 年，Han 等對麥麩在內(nèi)的357 個飼料樣本的真菌毒素污染情況調(diào)查顯示，DON 是中國飼料中最常見的真菌毒素，其次是ZEN 和AFB1[3]。 2019年，Yang 等對國內(nèi)市場上的576 個玉米制品中的真菌毒素污染水平進(jìn)行評估，結(jié)果表明78%的樣品至少存在一種真菌毒素污染， 其中DON 和ZEN 的發(fā)生率分別為63%和46%[4]。 可見，DON 和ZEN 廣泛存在于糧食以及飼料中， 對糧食中ZEN 和DON 開展同步快速檢測對保障糧食安全具有重要意義。

目前針對DON 和ZEN 的檢測手段主要包括儀器檢測分析法和免疫檢測法兩大類[5-7]。 氣相色譜、液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器法可以實(shí)現(xiàn)高精確度檢測，但同時復(fù)雜的樣品處理流程使其無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測[8]。 免疫檢測方法是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的檢測手段。 相對于色譜和質(zhì)譜方法， 免疫檢測方法對操作人員和場地要求低，且能夠?qū)崿F(xiàn)低成本、快速靈敏檢測污染物[9]。 目前，通過動物免疫獲得的多克隆或單克隆抗體是免疫檢測中使用的主要識別元件。 其中多克隆抗體特異性差，檢測背景信號值高，不適于真菌毒素的精準(zhǔn)定量；單克隆抗體的特異性強(qiáng)，批間差異小，但技術(shù)要求高、制備周期長、成本高且只能檢測一類具有類似結(jié)構(gòu)的真菌毒素。 因此，特異性抗體的高效制備是免疫檢測方法開發(fā)的關(guān)鍵因素。

近年來，基因重組抗體技術(shù)發(fā)展迅速。 該技術(shù)將含有抗體基因的載體導(dǎo)入到原核或真核生物中，在一定條件下培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有生物活性的蛋白質(zhì)。 重組抗體克服了傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)的局限性，無須經(jīng)過復(fù)雜的細(xì)胞融合篩選過程， 具有生產(chǎn)周期短、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。 相比傳統(tǒng)的雜交-雜交瘤融合技術(shù)，重組表達(dá)的雙特異性抗體無須經(jīng)過多次細(xì)胞融合篩選的過程，且不易發(fā)生由染色體丟失造成的生產(chǎn)能力喪失的情況。 目前雙特異性抗體類型有區(qū)內(nèi)交換抗原結(jié)合片段、抗原結(jié)合片段-單鏈抗體、單鏈抗體-單鏈抗體（scFv）2等[10]。 其中（scFv）2形式可以通過多肽連接臂連接2 種scFv， 具有結(jié)構(gòu)簡單、相對分子質(zhì)量低且不存在錯誤組裝、表達(dá)效率高等優(yōu)勢[11]。 因此，作者首先在哺乳動物細(xì)胞Expi293F中表達(dá)了ZEN 單鏈抗體（ZEN-scFv）和DON單鏈抗體（DON-scFv），進(jìn)一步設(shè)計(jì)和制備可識別ZEN 和DON 的雙特異性抗體（Bis-scFv）并建立酶聯(lián)免疫檢測方法。 表達(dá)抗體Bis-scFv 制備周期短、重現(xiàn)性好和可定向改造，有助于提高抗體制備效率，實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)同時檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株與細(xì)胞大腸桿菌（E.coli DH5α）感受態(tài)：天根生化科技有限公司（北京）；Expi293F 細(xì)胞：賽默飛世爾科技有限公司（美國）；表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建、引物合成和基因測序由安升達(dá)生物科技有限公司（蘇州）完成。

1.1.2 主要試劑玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）和T-2 毒素等標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich公 司；ExpiFectamine293 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒、Opti-MEM I無血清培養(yǎng)基、Expi293F 表達(dá)培養(yǎng)基、Gene Ruler DNA Ladder Mix： 賽默飛世爾科技有限公司 （美國）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、無縫克隆試劑盒、氨芐青霉素（Amp）：生工生物工程有限公司（上海）；PCR Master Mix 高保真酶： 翌圣生物科技股份有限公司（上海）；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗His 標(biāo)簽單克隆抗體：ImmunoWay 生物技術(shù)公司；His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker：碧云天生物技術(shù)公司（南通）；牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器T-100 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)核酸擴(kuò)增儀、Mini-PROTEAN Tetra1658033 蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)：Biorad 公司（上海）；Thermo3111 恒溫培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技有限公司（美國）；VS-1300L-U 超凈工作臺：安泰空氣技術(shù)有限公司（蘇州）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒設(shè)計(jì)抗體由兩組輕鏈（VL、CL）和重鏈（VH、CH1、CH2和CH3）組成，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)“Y”型，見圖1（a）。 抗體的可變區(qū)負(fù)責(zé)識別結(jié)合抗原，可變區(qū)的VH 和VL 可通過長度通常為10～25 個氨基酸殘基的多肽接頭連接形成scFv，見圖1（b）。 其作為小相對分子質(zhì)量的單個多肽更容易被改造和表達(dá)，并且能夠保留原始抗體的性質(zhì)[12]。作者首先構(gòu)建了ZENscFv 和DON-scFv 重組質(zhì)粒， 并在哺乳動物細(xì)胞Expi293F 中表達(dá)。 通過柔性連接子 （Gly4Ser）3將ZEN-scFv 和DON-scFv 基因序列連接用于融合表達(dá)，獲得雙特異性抗體Bis-scFv，見圖1（c），以期可以同時結(jié)合ZEN 和DON 這2 種不同的表位。 為促進(jìn)重組抗體通過Expi293F 細(xì)胞進(jìn)行高表達(dá)分泌，在DON-scFv、ZEN-scFv、Bis-scFv 前添加信號肽（SP），信號肽序列為：MGWSCIILFLVATATGVHS[13-14]。DON-scFv 和ZEN-scFv 基因序列來自NCBI 數(shù)據(jù)庫，DON-scFv NCBI：AY151141.1，AY151140.1；ZENscFv NCBI：U74672.1，U74671.1。

圖1 重組抗體質(zhì)粒設(shè)計(jì)Fig.1 Design of recombinant antibody plasmid

1.2.2 重組載體構(gòu)建雙特異性抗體表達(dá)載體構(gòu)建采用無縫克隆技術(shù)，構(gòu)建流程見圖2，構(gòu)建過程使用的引物見表1。 CH-Linker-DON-scFv-pTT5 載體由金斯瑞生物科技股份有限公司構(gòu)建，保存于作者所在實(shí)驗(yàn)室。 Bis-scFv-pTT5 重組載體的構(gòu)建采用無縫克隆技術(shù)， 將CH-Linker-DON-scFv-pTT5 載體中的CH 基因替換成ZEN-scFv。 以ZEN-scFvpCMV 為模板， 以BIS-SCFV-F1/F2 為引物， 經(jīng)過PCR 擴(kuò)增獲得ZEN-scFv 片段 （802 bp）。 以CHLinker-DON-scFv-pTT5 載體作為模板， 以BISSCFV-V1/V2 為引物對經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得Linker-DON-scFv-pTT5 載體片段（5 227 bp）。 利用無縫克隆酶連接上述的PCR 純化產(chǎn)物， 取100 ng Linker-DON-scFv-pTT5 的PCR 產(chǎn)物和40 ng ZEN-scFv 擴(kuò)增片段，兩者之間的摩爾比保持在1∶2～1∶3，加入10 μL 的2×無縫克隆酶混合液， 用無菌水補(bǔ)足體系至20 μL。 混合物置于50 ℃水浴下反應(yīng)40 min，立即冰浴冷卻2 min 后進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化（42 ℃、90 s）。轉(zhuǎn)化后的E.coli DH5α 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將長度正確的菌株接種到含有氨芐的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h， 用于測序。 相同操作進(jìn)行DON-scFv-pCMV 重組載體構(gòu)建。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建所用引物Table 1 Primers used in plasmid construction

圖2 Bis-scFv-pTT5 構(gòu)建流程Fig.2 Construction process of Bis-scFv-pTT5

1.2.3 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組抗體Expi293F 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染遵循Vazquez-Lombardi 的實(shí)驗(yàn)方案[14]。 首先將液氮保存的1×107個Expi293F 細(xì)胞加入25 mL 培養(yǎng)基中， 在37 ℃含體積分?jǐn)?shù)8.0%的CO2條件下培養(yǎng)并傳代3～4 代。取7.5×107個細(xì)胞置于25.5 mL 培養(yǎng)基中， 并向其中加入表達(dá)抗體質(zhì)粒和陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑繼續(xù)培養(yǎng)，18 h 后再加入增強(qiáng)劑Ⅰ和增強(qiáng)劑Ⅱ以維持細(xì)胞活性， 繼續(xù)培養(yǎng)7 d，將培養(yǎng)物以3 200 r/min 離心20 min，上清液用于純化。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物純化以及聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)電泳驗(yàn)證 向3 mL 柱體積的層析親和柱中加入1 mL 的Ni-TAN 凝膠， 加入1mL 的非變性裂解液平衡2～3次。 將待純化的上清液加入親和柱中，富集分離目的蛋白質(zhì)。加入1 mL 的洗滌液（含20 mmol/L 咪唑）洗滌3 次，去除多余的雜蛋白質(zhì)。 加入1 mL 的洗脫液（含250 mmol/L 咪唑），重復(fù)洗脫6 次，收集洗脫液。純化產(chǎn)物用12.5 g/dL 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 驗(yàn)證相對分子質(zhì)量大小。 為保護(hù)抗體的活性， 對上述的洗脫產(chǎn)物用PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）透析3 d，去除雜質(zhì)離子。

1.2.5 抗體親和性驗(yàn)證抗體親和性采用ELISA法測定。 步驟如下：

1）包板 向96 孔板加入100 μL 質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的DON 或ZEN 抗原，37 ℃孵育2 h，然后用PBST （含有體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20 的PBS 溶液）洗滌5 次。

2）封閉 PBST 洗滌后，每孔加入250 μL 含有5 g/dL 脫脂奶粉PBS 緩沖液，37 ℃封閉2 h，結(jié)束后再將96 孔板用PBST 洗滌5 次并干燥。

3）加樣 取100 μL 純化抗體、50 μL 純化抗體與50 μL 不同質(zhì)量濃度的毒素標(biāo)準(zhǔn)品的混合液，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌5 次。

4）加二抗 將100 μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗His 標(biāo)簽二抗加入孔中，并在37 ℃下孵育30 min，PBST 洗滌5 次。

5）顯色讀數(shù) 向每個樣品孔中加入100 μL 的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液，15 min 后加入50 μL 濃度為2 mol/L 的H2SO4溶液終止顯色反應(yīng)，測定OD450。 添加體積分?jǐn)?shù)10%甲醇的PBS 溶液到對照孔， 其OD450為B0， 添加DON 和ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品的OD450為B。 以毒素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)，用origin 2018 軟件通過非線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定B/B0為50%時所對應(yīng)的真菌毒素的質(zhì)量濃度，即半抑制質(zhì)量濃度（IC50）。 此外，通過對比相同質(zhì)量濃度下的ZEN、DON、OTA、AFB1、T-2 毒素對于抗體與抗原結(jié)合的抑制效果， 驗(yàn)證抗體的特異性。 對各組抑制率采用graphpad prism8.0.1 單因素方差（ANOVA）分析，不同字母標(biāo)記（a/b）表示2 組差異顯著性（P＜0.05）。

1.2.6 實(shí)際樣品檢測取5 g 玉米粉， 分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40、80 μg/kg 的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品充分混勻，用20 mL 甲醇-水（體積比86∶14）超聲提取30 min。 將提取物于12 000 r/min 離心15 min， 并用0.22 μm微孔濾膜過濾后用氮?dú)飧稍?。將其重新溶解? mL體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇PBS 中， 提取物用體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇PBS 稀釋20 倍用于ELISA 檢測。 相同步驟對玉米進(jìn)行DON 加標(biāo)分析， 加標(biāo)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為80 μg/kg 和240 μg/kg。

式中：CV 為加標(biāo)回收率，%；m1為玉米粉中ZEN 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定值，μg/kg；m2為玉米粉中實(shí)際ZEN 加標(biāo)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；RSD 為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，%；SD為玉米粉中ZEN 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，μg/kg；m3為玉米粉中ZEN 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定值的平均值，μg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建

重組載體Bis-scFv-pTT5 和DON-scFv-pCMV的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果見圖3。 Bis-scFv-pTT5其擴(kuò)增片段大小位于2 000 bp 附近，見圖3（a），符合理論值1 904 bp。 DON-scFv-pCMV 其擴(kuò)增片段大小位于1 000～1 200 bp，見圖3（b），符合理論值1 075 bp。 對菌落PCR 長度驗(yàn)證正確的菌株進(jìn)行堿基測序顯示，重組載體片段正確組裝，且堿基序列正確， 未發(fā)生基因突變， 表明Bis-scFv-pTT5 和DON-scFv-pCMV 重組載體構(gòu)建成功。

圖3 重組載體瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of recombinant antibody plasmids

2.2 ZEN-scFv 和DON-scFv 的SDS-PAGE 分析

Expi293F 細(xì)胞采用了30 mL 的體系，誘導(dǎo)表達(dá)后離心去除細(xì)胞， 對上清液進(jìn)行純化， 分別收獲1.55 mg ZEN-scFv 和253 μg 的DON-scFv，SDSPAGE 驗(yàn)證結(jié)果見圖4。 ZEN-scFv 含有251 個氨基酸， 通過SnapGene 軟件計(jì)算蛋白質(zhì)理論相對分子質(zhì)量為26 700，在26 000～34 000 條帶單一，見圖4（a），符合ZEN-scFv 理論相對分子質(zhì)量。 DON-scFv含有257 個氨基酸，其蛋白質(zhì)理論相對分子質(zhì)量為27 400，在26 000～34 000 條帶單一，見圖4（b），符合DON-scFv 理論相對分子質(zhì)量。

圖4 Expi293F 細(xì)胞表達(dá)的單鏈抗體的SDS-PAGE 圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of single chain antibodies expressed by Expi293F cells

2.3 ZEN-scFv 和DON-scFv 親和性驗(yàn)證

透析純化后獲得質(zhì)量濃度為188 μg/mL 的ZEN-scFv。 將ZEN-scFv 稀釋為0.5 μg/mL，測定其對1.0 μg/mL 的ZEN-BSA 和1.0 μg/mL 的BSA 親和性， 定義ZEN-BSA 的吸光度OD450為P，BSA 的吸光度OD450為陰性對照N。當(dāng)P/N≥2.1 時，則判定親和性為陽性[15]。 如圖5 所示，ZEN-scFv 對應(yīng)的P值為2.57，N 值為0.07，兩者比值為36.71，顯著大于2.1，表明ZEN-scFv 能夠識別并結(jié)合抗原上偶聯(lián)的ZEN 分子，親和性為陽性。 DON-scFv 經(jīng)過純化、二喹啉甲酸法蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定后， 獲得的最大DON-scFv 質(zhì)量濃度為38 μg/mL。 將DON-scFv 稀釋至質(zhì)量濃度為1 μg/mL 進(jìn)行驗(yàn)證，對1 μg/mL 的DON-OVA 和1 μg/mL 的OVA 測定親和性。 DONscFv 對應(yīng)的P 值為0.89，N 值為0.10， 兩者比值為8.9，表明DON-scFv 能夠識別并結(jié)合抗原上偶聯(lián)的DON 分子，親和性為陽性。

圖5 ZEN-scFv 和DON-scFv 結(jié)合活性ELISA 驗(yàn)證Fig.5 ELISA validation of the binding activity of ZENscFv and DON-scFv

2.4 ZEN-scFv 和DON-scFv 靈敏度的測定

采用間接競爭ELISA 法對ZEN-scFv 和DONscFv 識別的靈敏性進(jìn)行分析。首先利用ELISA 棋盤優(yōu)化確定當(dāng)ZEN-BSA 包被質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL、ZEN-scFv 包被質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL 時，OD450約為1.0。 在此條件下， 建立了0～1 000 ng/mL 的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，結(jié)果見圖6（a）。 ZEN-scFv 的IC50值為8.66 ng/mL， 靈敏度較報(bào)道的該序列單特異性ZEN-scFv（IC50為11.20～14.00 ng/mL）高[16-17]。此外，DON-OVA 包被質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，DONscFv 的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL。在該條件下，在DON質(zhì)量濃度為0～10 000 ng/mL 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖6（b）。 DON-scFv 的IC50為69.01 ng/mL，表明對DON 具有較高的敏感性，能夠滿足國內(nèi)對于糧食中DON 限量（1 000 μg/kg）的檢測要求。

圖6 單鏈抗體標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.6 Standard inhibition curves for single chain antibodies

2.5 雙特異性抗體驗(yàn)證

6×His、 標(biāo)簽DON-scFv 由515 個氨基酸組成，理論相對分子質(zhì)量為54 100。圖7（a）顯示在相對分子質(zhì)量55 000～72 000 存在清晰的單一蛋白質(zhì)條帶，電泳條帶與理論相對分子質(zhì)量略微偏大，可能是由于磷酸化或糖基化修飾使得蛋白質(zhì)電荷發(fā)生改變從而影響了蛋白質(zhì)在凝膠上的轉(zhuǎn)移速度。 進(jìn)一步對DON-OVA（1 μg/mL）和ZEN-BSA（1 μg/mL）結(jié)合能力進(jìn)行ELISA 驗(yàn)證，結(jié)果見圖7（b）。 表達(dá)抗體Bis-scFv 對2 種抗原的OD450與對照組OVA/BSA 存在明顯差異，P/N 遠(yuǎn)大于2.1。 可見， 通過（Gly4Ser）3 Linker 連接ZEN-scFv 和DON-scFv 組成的雙特異抗體Bis-scFv 保留了DON-scFv 和ZEN-scFv 的親和識別功能。 同時，在相同抗原和抗體質(zhì)量濃度下，Bis-scFv 對ZEN 的OD450比DON強(qiáng)，表明Bis-scFv 對ZEN 具有更強(qiáng)的親和力。

圖7 雙特異性抗體的SDS-PAGE 和ELISA 親和性驗(yàn)證Fig.7 SDS-PAGE and ELISA validation of the affinity of bispecific antibody

2.6 抗體靈敏度測定

ELISA 棋盤優(yōu)化確定ZEN-BSA 包被質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，Bis-scFv 的質(zhì)量濃度為5 μg/mL。 將ZEN 溶于體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇PBS 中，配制成質(zhì)量濃度為0.25～10 000 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，Bis-scFv 對ZEN 的非線性抑制曲線見圖8（a）。Bis-scFv 對ZEN表現(xiàn)良好的靈敏度， 其IC50為20.64 ng/mL。 同樣，ELISA 棋盤優(yōu)化確定8 μg/mL 的Bis-scFv 和2 μg/mL的DON-OVA 時，OD450值約為1.0。 在此條件下，在DON 為0～10 000 ng/mL 建立非線性抑制曲線，測得其IC50為132.29 ng/mL，見圖8（b）。 將Expi293F表達(dá)的重組抗體與目前報(bào)道的單克隆抗體（mAb）進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。 Expi293F 表達(dá)的Bis-scFv 與ZEN-scFv 靈敏度相近， 且與目前報(bào)道的部分抗ZEN mAb 靈敏度相近。 目前，歐盟和我國對于糧食中ZEN 的最大限量分別為100、60 μg/kg，ZEN-scFv和Bis-scFv 能夠滿足ZEN 的檢測要求。 與DONscFv 比較，Bis-scFv 對DON 的靈敏度顯著下降，但仍顯著優(yōu)于部分報(bào)道的抗DON mAb。 研究表明，scFv 連接肽的長度以及VH 和VL 排列取向會導(dǎo)致不同結(jié)合活性和寡聚狀態(tài)[18-19]。Bis-scFv 融合抗體的形式對DON 敏感性的干擾大于ZEN， 這可能是由ZEN-scFv 和DON-scFv 排列取向差異導(dǎo)致。

表2 重組表達(dá)抗體與傳統(tǒng)抗體靈敏度比較Table 2 Sensitivity comparison between the recombinant antibodies and the traditional antibodies

圖8 雙特異性抗體標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.8 Standard inhibition curves of bispecific antibody

2.7 抗體特異性驗(yàn)證

為驗(yàn)證Bis-scFv 對ZEN 和DON 識別的特異性，考察了OTA、AFB1、T-2 毒素與Bis-scFv 的結(jié)合能力，結(jié)果見圖9。在相同質(zhì)量濃度的抗體和包被抗原的情況下， 當(dāng)ZEN 和DON 質(zhì)量濃度達(dá)到10 000 ng/mL 時， 游離的Bis-scFv 與游離的ZEN 和DON結(jié) 合，Bis-scFv 與ZEN-BSA 和DON-OVA 的 結(jié) 合受到抑制，此時抑制率接近100%。 當(dāng)向體系加入質(zhì)量 濃 度 為10 000 ng/mL 的OTA、AFB1、T-2 毒 素時， 對抗體與包被抗原結(jié)合的抑制效果顯著小于DON 和ZEN，抑制率小于10%，這表明OTA、AFB1、T-2 無法與Bis-scFv 結(jié)合，Bis-scFv 與OTA、AFB1、T-2 之間不存在明顯的交叉反應(yīng)。

圖9 表達(dá)抗體Bis-scFv 特異性Fig.9 Specificity of antibody Bis-scFv

2.8 基于雙特異性抗體的ELISA 檢測方法構(gòu)建

基于Bis-scFv 建立ELISA 檢測方法， 當(dāng)ZEN質(zhì)量濃度在1～100 ng/mL 時，B/B0與ZEN 質(zhì)量濃度對數(shù)值呈線型關(guān)系，見圖10（a）。 線性關(guān)系為Y=-0.402 8lg X+0.961 4， 線性擬合優(yōu)度R2=0.946 7，IC50為13.98 ng/mL。 當(dāng)DON 質(zhì)量濃度在10～500 ng/mL 時，DON 質(zhì)量濃度的對數(shù)與B/B0線型關(guān)系為Y＝-0.527 5lg X+1.585，線性擬合優(yōu)度R2=0.968 1，IC50為113.99 ng/mL，見圖10（b）。 用BisscFv-ELISA 檢測ZEN 和DON 加標(biāo)的玉米樣品，結(jié)果見表3。 玉米粉中ZEN 加標(biāo)量為40 μg/kg 和80 μg/kg，Bis-scFv-ELISA 測定的平均值為34.45 μg/kg 和86.52 μg/kg， 平 均 回 收 率 為86.13%～108.14%；玉米粉中DON 加標(biāo)量為80 μg/kg 和240 μg/kg，Bis-scFv-ELISA 測 定 的 平 均 值 為75.08 μg/kg 和206.44 μg/kg， 平 均 回 收 率 為86.02%～93.85%。 玉米樣品加標(biāo)回收檢測結(jié)果表明，BisscFv-ELISA 具有良好的準(zhǔn)確性，能夠用于實(shí)際樣品檢測。將Bis-scFv-ELISA 同步檢測與基于單克隆抗體的同步檢測方法進(jìn)行比較，Bis-scFv-ELISA 具有更廣定量檢測范圍，見表4。

表3 玉米粉的DON 和ZEN 加標(biāo)檢測結(jié)果（n＝3）Table 3 Detection results of DON and ZEN in spiked corn flour samples（n＝3）

表4 DON 和ZEN 檢測方法比較Table 4 Comparison of DON and ZEN detection methods

圖10 Bis-scFv-ELISA 線性標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.10 Linear standard inhibition curves of Bis-scFv-ELISA

3 結(jié) 語

結(jié)合重組抗體表達(dá)技術(shù)，在Expi293F 表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了能夠用于免疫檢測的ZEN-scFv 和DON-scFv，IC50分別為8.66 ng/mL 和69.01 ng/mL。基于性質(zhì)良好的單特異性抗體片段進(jìn)行基因改造，獲得了具有ZEN 和DON 結(jié)合位點(diǎn)的Bis-scFv。 經(jīng)ELISA 驗(yàn) 證，Bis-scFv 對ZEN-BSA 和DON-OVA存在親和性。 Bis-scFv 對ZEN 靈敏度接近ZENscFv，IC-ELISA 的IC50為20.64 ng/mL， 而對DON敏感性顯著下降，IC-ELISA 的IC50為132.29 ng/mL。Bis-scFv 對OTA、AFB1、T-2 毒素?zé)o顯著的交叉反應(yīng)， 具有良好的特異性。 基于Bis-scFv 建立的ELISA 檢測方法， 其對ZEN 檢測的線性范圍為1～100 ng/mL，DON 的檢測線性范圍為10～500 ng/mL。Bis-scFv-ELSIA 對玉米粉中ZEN 和DON 的加標(biāo)回收率分別為86.13%～108.14%和86.02%～93.85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%， 檢測穩(wěn)定性高， 表明BisscFv-ELISA 能夠滿足糧食中ZEN 和DON 檢測要求。