宋玉濤, 王 峰, 李 凡, 馮 浩

(河北省定州市人民醫(yī)院, 河北 定州 073000)

胃癌屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤,早期缺乏癥狀,發(fā)現(xiàn)時多為晚期,常出現(xiàn)預(yù)后不良[1],因此尋找新的生物標志物或者有效的生物靶點將有助于胃癌的發(fā)現(xiàn)或治療。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一種包含200多個核苷酸的非編碼RNA,可參與腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥細胞程序性死亡等過程[2]。研究表明重組人V-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因G反義RNA1(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G-antisense RNA1,MAFG-AS1)是一種新型致癌LncRNA,在乳腺癌、肺癌等癌癥中異常過表達,通過調(diào)節(jié)miRNA影響多種生物學(xué)效應(yīng),包括增殖、轉(zhuǎn)移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等,被認為是一種有前景的預(yù)后生物標志物,可作為癌癥治療的潛在靶點[3-5]。MiRNA是LncRNA的主要靶標,miR-331-3p在多種癌癥中可作為潛在的腫瘤抑制因子,可以抑制胃癌細胞生長[6]。利用軟件分析發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1與miR-331-3p有互補結(jié)合位點。miRNAs與特定的mRNA結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控基因的表達[7]。SERPINE1是位于7號染色體上的基因,也稱纖溶酶原激活物抑制劑Ⅰ型(plasminogen activator inhibitor type 1,PAI-1),是一種組織型纖溶酶原激活劑和尿苷磷酸腺苷的抑制劑,其與多種腫瘤進展有關(guān)[8],利用軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-331-3p與SERPINE1存在互補結(jié)合位點?；诖?本研究推測:LncRNA MAFG-AS1調(diào)節(jié)miR-331-3p/SERPINE1軸影響胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1實驗材料:收集本院30例胃癌患者癌組織以及癌旁正常組織(距發(fā)灶邊緣5cm以上),經(jīng)病理鑒定均為腺癌。本實驗獲得醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2細胞、試劑:人胃黏膜正常上皮細胞GES-1、人胃癌細胞BGC-823、SGC-7901、MGC-803(中國科學(xué)院上海細胞庫)。本實驗所用質(zhì)粒由實驗室保存;Lipo3000TM轉(zhuǎn)染試劑購自德國默克公司;CCK-8試劑盒購自美國Elabscience公司;EDU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物公司;Firefly &Renilla Dual Luciferase Assay Kit購自蘇州宇恒生物公司;SERPINE1、PCNA、MMP-2抗體購自德國CST公司。

1.3細胞培養(yǎng):將GES-1、BGC-823、SGC-7901、MGC-803細胞置于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4細胞分組與轉(zhuǎn)染:將BGC-823細胞分為ctrl組(正常培養(yǎng))、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcLncRNA MAFG-AS1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MAFG-AS1)、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組(pcDNA3.1-MAFG-AS1和miR-NC共轉(zhuǎn)染)、pcLncRNA MAFG-AS1+ miR-331-3p組(pcLncRNA MAFG-AS1和miR-331-3p mimic共轉(zhuǎn)染)。將細胞轉(zhuǎn)染48h,進行后續(xù)實驗。

1.5qRT-PCR檢測MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1表達:Trizol裂解30例胃癌患者癌組織、癌旁正常組織、GES-1、BGC-823、SGC-7901、MGC-803細胞及1.4各組BGC-823細胞,提取細胞總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1 mRNA表達,MAFG-AS1和SERPINE1內(nèi)參為GAPDH、miR-331-3p內(nèi)參為U6。引物如下:MAFG-AS1正向引物序列5'-CGGGAGGAAGATAAACGGGG3';反向引物序列5'-TGACCACGGAACACCTTCAG-3'。miR-331-3p正向引物序列5'-GAGCTGAAAGCACTCCCAA-3';反向引物序列5'-CACACTCTTGATGTTCCAGGA-3'。SERPINE1正向引物序列5'-GAGGATGAAAGAAACAGCCAGCT-3';反向引物序列5'-CCCGCTATGAAATTAGATTCACGT-3'。GAPDH正向引物序列5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3';反向引物序列5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3'。U6正向引物序列5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3';反向引物序列5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt計算MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1 mRNA的相對表達量。

1.6CCK-8法檢測各組BGC-823細胞活力:各組BGC-823細胞轉(zhuǎn)染48h后,向每個孔中加入CCK-8溶液,細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)放置2h后,酶標儀監(jiān)測450nm處吸光度。

1.7EDU法檢測各組BGC-823細胞增殖:各組BGC-823細胞轉(zhuǎn)染48h后,向每個孔中加入EDU培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)放置2h后,按照EDU細胞增殖檢測試劑盒說明依次進行固定、通透、洗滌、染色、熒光檢測。

1.8Transwell檢測各組BGC-823細胞遷移和侵襲:各組BGC-823細胞轉(zhuǎn)染48h后,制成細胞懸液,加入Transwell上室,下室加入含有血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,拭去未遷移細胞,固定,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察細胞計數(shù)。細胞侵襲實驗在上室包被基質(zhì)膠,其他步驟同遷移實驗。

1.9Western blot檢測各組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2表達:各組BGC-823細胞轉(zhuǎn)染48h后,棄去上清,PBS洗滌后,加入RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白,將獲得蛋白進行定量。將蛋白進行Western blot檢測SERPINE1、PCNA、MMP-2表達,具體操作如下:跑膠,轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗,孵育二抗,ECL顯色,凝膠成像系統(tǒng)拍照保留圖像,Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.10雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?構(gòu)建MAFG-AS1野生型質(zhì)粒(MAFG-AS1-WT)和突變型質(zhì)粒(MAFG-AS1-MUT),將MAFG-AS1-WT和MAFG-AS1-MUT分別與mimics NC或miR-331-3p mimics共轉(zhuǎn)染于BGC-823細胞,48h后,檢測熒光素酶活性。構(gòu)建SERPINE1野生型質(zhì)粒(SERPINE1-WT)和突變型質(zhì)粒(SERPINE1-MUT),將SERPINE1-WT和SERPINE1-MUT分別與mimics NC或miR-331-3p mimics共轉(zhuǎn)染于BGC-823細胞,48h后,檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織以及癌旁組織中MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1表達比較:與癌旁組織相比,胃癌組織中MAFG-AS1和SERPINE1 mRNA表達顯著性升高,miR-331-3p表達顯著性降低(P<0.05),見表1。

表1 胃癌組織以及癌旁組織中MAFG-AS1 miR-331-3pSERPINE1表達比較

2.2GES-1細胞與多種胃癌細胞中MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1表達比較:與GES-1細胞相比,不同胃癌細胞中MAFG-AS1、SERPINE1 mRNA表達顯著性升高,miR-331-3p表達顯著性降低(P<0.05),BGC-823細胞變化結(jié)果更顯著,故后續(xù)實驗選擇BGC-823細胞。見表2。

表2 GES-1細胞與多種胃癌細胞中MAFG-AS1 miR-331-3p SERPINE1表達比較

2.3各組BGC-823細胞MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1 mRNA水平比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組MAFG-AS1、SERPINE1 mRNA表達顯著升高(P<0.05),miR-331-3p mRNA表達顯著降低(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組miR-331-3p mRNA表達顯著升高(P<0.05),SERPINE1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),LncRNA MAFG-AS1表達變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 各組BGC-823細胞MAFG-AS1 miR-331-3p SERPINE1 mRNA水平比較

2.4各組BGC-823細胞活力比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞活力A值升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞活力A值降低(P<0.05),見表4。

表4 各組BGC-823細胞活力A值比較

2.5各組BGC-823細胞增殖能力比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞EDU陽性細胞率升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞EDU陽性細胞率降低(P<0.05),見圖1。

2.6各組BGC-823細胞遷移和侵襲能力比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞遷移和侵襲數(shù)量升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞遷移和侵襲數(shù)量降低(P<0.05),見圖2、3。

圖2 Transwell檢測各組BGC-823細胞遷移

圖3 Transwell檢測各組BGC-823細胞侵襲

2.7各組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2表達比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2蛋白水平升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2蛋白水平降低(P<0.05),見圖4。

圖4 各組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2蛋白表達比較

2.8MAFG-AS1和miR-331-3p、miR-331-3p和SERPINE1的關(guān)系:軟件分析發(fā)現(xiàn)LncRNA MAFG-AS1與miR-331-3p、miR-331-3p與SERPINE1均有互補結(jié)合位點,見圖5A、5B。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示,與MAFG-AS1-WT+mimics NC組相比,MAFG-AS1-WT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與MAFG-AS1-MUT+mimics NC組相比,MAFG-AS1-MUT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖5C。與SERPINE1-WT+mimics NC組相比,SERPINE1-WT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與SERPINE1-MUT+mimics NC組相比,SERPINE1-MUT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖5D。

圖5 驗證MAFG-AS1和miR-331-3p、miR-331-3p和SERPINE1的關(guān)系

3 討 論

LncRNA MAFG-AS1是MAFG的反義RNA,其通過海綿化miR-505上調(diào)PLK1,促進胃癌細胞增殖[9];MAFG-AS1調(diào)控miR-143-3p/AKT2軸促進胃癌進展[10],因此研究MAFG-AS1在胃癌進展中發(fā)揮的作用具有重要意義,可為胃癌診斷和治療提供新的靶點。本文首先發(fā)現(xiàn)胃癌組織中MAFG-AS1、SERPINE1表達顯著升高,miR-331-3p表達顯著降低。隨后選取人胃黏膜正常上皮細胞以及胃癌細胞同樣檢測三者表達,本文發(fā)現(xiàn)與人胃黏膜正常上皮細胞GES-1相比,多種胃癌細胞中MAFG-AS1過表達,與臨床樣本的研究結(jié)果一致,且BGC-823細胞中MAFG-AS1表達量最高,因此后續(xù)實驗選擇BGC-823細胞。進一步研究表明,過表達MAFG-AS1通過提高增殖相關(guān)蛋白PCNA、遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2水平促進BGC-823細胞增殖,侵襲和遷移,表明MAFG-AS1在胃癌發(fā)展中發(fā)揮促癌作用。

多個研究表明miR-331-3p參與胃癌的發(fā)展,比如LncRNA MIAT通過海綿化miR-331-3p促進胃癌增殖和轉(zhuǎn)移[6];circCACTIN抑制miR-331-3p水平促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT[11],上述研究表明miR-331-3p是胃癌中潛在的腫瘤抑制因子。本研究中同樣發(fā)現(xiàn),與GES-1細胞相比,胃癌細胞中miR-331-3p表達顯著性下調(diào),隨后發(fā)現(xiàn)過表達MAFG-AS1顯著抑制miR-331-3p表達。本研究利用軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1與miR-331-3p存在結(jié)合位點,且雙熒光素酶實驗結(jié)果證實了這一預(yù)測。更重要的是,將MAFG-AS1與miR-331-3p共轉(zhuǎn)染后可減弱由MAFG-AS1引起的促癌作用,提示MAFG-AS1和miR-331-3p確實存在互作關(guān)系,說明MAFG-AS1可靶向負調(diào)控miR-331-3p進而促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲。

本文觀察到與GES-1細胞相比,SERPINE1在胃癌細胞中高表達,且與miR-331-3p表達呈負相關(guān),二者的表達趨勢與軟件的預(yù)測結(jié)果及雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果一致,提示miR-331-3p可能靶向調(diào)控SERPINE1表達。SERPINE1在胃癌組織中高表達,影響胃癌細胞的侵襲和遷移,有研究表明SERPINE1可作為胃腺癌促癌基因,調(diào)節(jié)EMT促進腫瘤細胞增殖,遷移和侵襲[12]。上述研究表明SERPINE1促進胃癌發(fā)展,本文結(jié)果與上述結(jié)果一致。本文發(fā)現(xiàn)過表達MAFG-AS1可促進SERPINE1表達,MAFG-AS1和miR-331-3p共轉(zhuǎn)染后可抑制MAFG-AS1對SERPINE1表達的促進作用,提示MAFG-AS1可通過靶向調(diào)控miR-331-3p/SERPINE1軸促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞中MAFG-AS1高表達,進一步研究表明MAFG-AS1促進BGC-823細胞增殖,侵襲和遷移;相關(guān)機制研究表明,MAFG-AS1可調(diào)節(jié)miR-331-3p/SERPINE1軸促進胃癌細胞惡性發(fā)展,本研究為胃癌的發(fā)現(xiàn)或者治療提供新的視角。然而本研究尚存在不足之處,缺乏回復(fù)性實驗,驗證下調(diào)SERPINE1表達,對BGC-823細胞增殖、遷移和侵襲的影響,將作為下一步研究重點。