林志偉，王 帥，王迎春，吳占文，李 濤，李紅娜，楊艷歌,*，袁 飛,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品質(zhì)量與安全），北京 100176；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000）

嬰兒食品安全關(guān)乎下一代健康成長，千萬家庭的幸福和國家民族的未來。研究顯示，0～6 個月嬰幼兒的腸道菌群尚處于發(fā)育階段，腸道中雙歧桿菌等有益菌尚未占據(jù)優(yōu)勢[1]。一旦誤食了含有食源性致病菌的嬰兒配方乳粉，極易導(dǎo)致結(jié)腸炎、菌血癥等疾病的發(fā)生，危害嬰兒的生命安全。乳粉中常見的食源性致病菌主要有克羅諾桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌等?？肆_諾桿菌舊稱阪崎腸桿菌，對各年齡段人群均具有感染性，尤其是免疫功能低下或不健全的老年人和嬰兒[2]。嬰兒感染后常出現(xiàn)腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等癥狀[3]，且致死率高達40%～80%[4-5]。沙門氏菌是一類在環(huán)境中廣泛存在且能夠引發(fā)食物中毒的革蘭氏陰性桿菌[6]，據(jù)報道，全球每年大約有9 000多萬 例的沙門氏菌感染事件發(fā)生[7]。單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌是兩類會導(dǎo)致食物中毒的革蘭氏陽性菌[8]，誤食污染這2 類細菌的乳粉會導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)單核細胞增多、腦膜炎、敗血癥等癥狀[9]，嚴重威脅嬰兒的生命安全。

目前微生物檢測采用的標準方法是微生物培養(yǎng)法[10]，該方法雖然易于推廣、結(jié)果準確，但耗時較長，結(jié)果易受操作人員的技術(shù)和經(jīng)驗影響[11]。為了彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足，研究者們開發(fā)了多種新型檢測手段。如王仲敏等[12]根據(jù)產(chǎn)酸克雷伯氏菌半乳糖醛酸酶基因建立了實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法，檢測時間相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法縮短了一半。Asgari等[13]將表面增強拉曼光譜與免疫探針技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了一種能夠同時分離檢測沙門氏菌和大腸桿菌O157:H7的快速檢測方法，該方法從樣品制備到出具檢測結(jié)果只需2 h。Yan Wenjing等[14]基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析，開發(fā)了一種能夠同時檢測6 種食源性致病菌的快速檢測方法，具有速度快、精度高的特點。這些方法雖然提高了檢測的靈敏度、縮短了檢測時間，但均需要光譜儀和質(zhì)譜儀等大型儀器設(shè)備，不便用于現(xiàn)場快速檢測。因此，急需開發(fā)能夠擺脫大型儀器依賴的新型檢測手段。

酶促重組等溫擴增（enzymatic recombinase amplification，ERA）技術(shù)是近些年新研發(fā)的一種等溫擴增技術(shù)[15-16]。該技術(shù)能夠在常溫環(huán)境下，依靠體系中的重組酶等組分，完成目標核酸片段的指數(shù)級擴增。相對于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，該技術(shù)操作簡單、反應(yīng)速度快、靈敏度高，且對儀器設(shè)備要求低，可在非實驗室環(huán)境條件下進行操作。該技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于臨床診斷、腐敗菌檢測、動物病毒檢測等諸多方面[16-18]，但應(yīng)用于食源性致病菌檢測的研究較少，且多針對單一檢測對象。本研究針對嬰兒配方乳粉中易污染的克羅諾桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌4 種食源性致病菌，建立雙重ERA快速檢測方法，以期為嬰兒配方乳粉中致病菌的篩查提供快速檢測手段，同時也為其他食源性病原菌的檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用菌分別來源于美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國醫(yī)學(xué)細菌菌種保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）、德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）、英國典型菌種保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC）和中國檢驗檢疫微生物菌種保藏管理中心（Inspection and Quarantine Culture Collection，IQCC），以上所有菌均保藏于IQCC。信息詳見表1。市售嬰兒配方乳粉樣品采購于北京超市和電商。

腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHIB）培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養(yǎng)基、LB肉湯（LBB）培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；PrepManTMUltra樣品制備試劑 美國Thermo Fisher公司；熒光型核酸擴增試劑盒（ERA法） 蘇州先達基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico 17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；D1008E掌上離心機 美國Scilogex公司；BioSpec-nano紫外-可見光分光光度儀 日本島津公司；VORTEX 3渦旋混合器 德國IKA公司；3850V高壓滅菌鍋 以色列Tuttnauer公司；DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國Memmert公司；HH-2水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠；mq-3164便攜式迷你qPCR儀 上海翊輝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物來源

從G e n B a n k 數(shù)據(jù)庫中提取阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）、莫金斯克羅諾桿菌（C.m u y t j e n s i i）、康帝蒙提克羅諾桿菌（C.c o n d i m e n t i）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis）和都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）以及其他近源食源性致病菌的外膜蛋白X（outer membrane protein X，ompX）基因序列，利用Clustal X軟件進行序列比對。以阪崎克羅諾桿菌ompX基因（登錄號：NZ_CP027107.1）為靶序列，在屬間保守區(qū)域和屬間差異性區(qū)域設(shè)計克羅諾桿菌ERA引物探針。沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球的引物探針引自文獻[19-21]報道，此時探針的熒光標記統(tǒng)一為FAM，通過比較擴增效果進行篩選。對篩選的探針序列進行不同熒光標記，序列及來源信息詳見表2，均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3.2 菌分離培養(yǎng)及基因組DNA提取

蘸取菌液在BHIA培養(yǎng)基表面劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落加入到5 mL的BHIB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中16 000×g離心2 min，棄上清液后加入100 μL PrepManTMUltra進行DNA提取，渦旋振蕩混勻，100 ℃加熱5 min，16 000×g離心2 min，取50 μL上清液即為DNA模板，測其濃度后于-20 ℃保存[23]。

1.3.3 反應(yīng)體系與檢測程序

ERA熒光法反應(yīng)體系參照熒光型核酸擴增試劑盒（ERA法）使用說明書制備預(yù)混液，取混勻后的預(yù)混液47 μL至ERA酶粉反應(yīng)管，模板量均為1 μL，向管蓋滴加2 μL激活劑，蓋緊后渦旋瞬時離心，放入便攜式迷你qPCR儀進行ERA反應(yīng)。反應(yīng)程序為第1階段39 ℃、1 s；第2階段39 ℃、14 s，共40 個循環(huán)，第2階段進行熒光信號收集。FAM熒光通道檢測對象為克羅諾桿菌、HEX熒光通道檢測對象為沙門氏菌、ROX熒光通道檢測對象為金黃色葡萄球菌、Cy5熒光通道檢測對象為單核細胞增生李斯特菌。

1.3.4 引物探針篩選

分別以表1所列的克羅諾桿菌屬細菌、沙門氏菌屬細菌、單核細胞增生李斯特菌以及金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，分析相關(guān)文獻中[20-27]引物探針的擴增效率和屬內(nèi)覆蓋度，確定最優(yōu)引物探針。然后對篩選的引物探針進行特異性分析，分別以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544、單核細胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門氏菌ATCC10708、金黃色葡萄球菌CMCC26003的基因組DNA為陽性對照，以非靶標菌基因組DNA為陰性對照，以無菌ddH2O為空白對照進行ERA反應(yīng)。所有樣品的基因組DNA質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，每次實驗2 個平行，重復(fù)實驗3 次。

1.3.5 雙重ERA檢測方法的建立

分別將克羅諾桿菌和單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的引物探針兩兩組合，混合加入同一反應(yīng)體系，基因組DNA模板加量為10 ng/μL，以無菌ddH2O為陰性對照，分析引物探針的交叉反應(yīng)性，確定雙重反應(yīng)的最優(yōu)組合方式。

1.3.6 雙重ERA檢測方法反應(yīng)體系優(yōu)化

1）引物濃度優(yōu)化：將ERA反應(yīng)預(yù)混液中每種引物（濃度均為10 μmol/L）的體積分別調(diào)整為1.5、2、2.5、3、3.5、4 μL，分別以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544和單核細胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門氏菌ATCC10708和金黃色葡萄球菌CMCC26003的基因組DNA為模板進行ERA反應(yīng)，每種菌基因組DNA質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，根據(jù)擴增曲線熒光強度確定雙重ERA檢測反應(yīng)的最佳引物濃度。實驗過程中以無菌ddH2O為空白對照，每次實驗2 個平行，重復(fù)實驗3 次。

2）探針濃度優(yōu)化：引物體積按照上述的優(yōu)化結(jié)果，將探針（濃度均為10 μmol/L）體積分別調(diào)整為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μL，分別以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544和單核細胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門氏菌ATCC10708和金黃色葡萄球菌CMCC26003的基因組DNA為模板進行ERA反應(yīng)，基因組DNA質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，根據(jù)擴增曲線熒光強度確定雙重ERA檢測反應(yīng)最佳的探針濃度。實驗過程中以無菌ddH2O為空白對照，每次實驗2 個平行，重復(fù)實驗3 次。

1.3.7 雙重ERA檢測方法靈敏度檢測

為進一步分析建立的雙重ERA檢測方法的靈敏度，將模板DNA濃度分別稀釋為101、100、10-1、10-2ng/μL，采用1.3.6節(jié)確定的ERA反應(yīng)體系進行實驗，分析雙重ERA檢測的靈敏度。實驗過程中以無菌ddH2O為空白對照，每次實驗2 個平行，重復(fù)實驗3 次。

1.3.8 雙重ERA檢測方法人工污染樣品

取單菌落加入至10 mL離心管中，37 ℃培養(yǎng)48 h使細菌生長達到穩(wěn)定期，作為后續(xù)實驗用的種子液。將種子液以1%接種量接入LBB培養(yǎng)基，37 ℃增菌培養(yǎng)12 h，梯度稀釋后通過平板計數(shù)法對生長量進行測算，確定4 種細菌在這一培養(yǎng)條件下的生長量。按上述操作重新培養(yǎng)菌液12 h，根據(jù)生長量計算，使用無菌水稀釋至100 CFU/mL。

稱取25 g嬰兒配方乳粉為基質(zhì)，加入225 mL LBB培養(yǎng)基制成均質(zhì)液。向均質(zhì)液中分別添加2.25 mL上述100 CFU/mL的阪崎克羅諾桿菌ATCC29544和單核細胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門氏菌ATCC10708和金黃色葡萄球菌CMCC26003菌液，即每種菌的污染量為1 CFU/mL，37 ℃增菌培養(yǎng)2、4、6 h后按1.3.7節(jié)方法提取基因組DNA。分析人工污染樣品的檢出限。實驗過程中以無菌ddH2O為空白對照，重復(fù)實驗3 次。

1.3.9 市售樣品檢測

購買的17 份嬰兒配方乳粉，按1.3.8節(jié)方法取樣均質(zhì)后增菌培養(yǎng)12 h，采用1.3.2節(jié)方法進行基因組DNA提取。分別以中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 1870—2016《出口食品中食源性致病菌檢測方法 實時熒光PCR法》[28]、SN/T 1059.7—2010《進出口食品中沙門氏菌檢測方法 實時熒光PCR法》[29]和SN/T 5224—2019《出口食品中單核細胞增生李斯特菌檢驗方法 實時熒光PCR內(nèi)標法》[30]規(guī)定的實時熒光PCR法和雙重ERA法進行檢測，通過檢測結(jié)果分析建立的雙重ERA法的檢測效果，實驗過程中以無菌ddH2O為空白對照，重復(fù)實驗3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種病原菌ERA檢測引物探針篩選

根據(jù)文獻[16]報道，重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）、重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）和ERA在原理上有一定的相似性，通過檢索發(fā)現(xiàn)沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌有RAA或RPA檢測引物探針。因此對文獻中已報道的4 組沙門氏菌、4 組單核細胞增生李斯特菌、1 組金黃色葡萄球菌以及本研究設(shè)計的3 組克羅諾桿菌引物探針進行ERA檢測效果分析。結(jié)果顯示，本研究設(shè)計的AF2-1/AR2-1/AP2引物探針組合對克羅諾桿菌具有良好的擴增效率，且對屬內(nèi)菌株：阪崎克羅諾桿菌ATCC29544、莫金斯克羅諾桿菌ATCC51329、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌DSM18702、都柏林克羅諾桿菌DSM18705、尤尼沃斯克羅諾桿菌NCTC9529的覆蓋性良好（圖1A）。文獻[20-22]報道的引物探針分別對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌具有良好的擴增效率，擴增曲線均為光滑明顯的S型曲線，空白對照無擴增，且對屬內(nèi)菌株的覆蓋性良好（圖1B～D）。優(yōu)選的引物探針詳細信息見表2。

圖1 4 種菌ERA引物探針篩選結(jié)果Fig.1 Results of screening of ERA probes for four pathogenic bacteria

2.2 4 種病原菌ERA引物探針特異性分析

為進一步分析篩選的4 種病原菌的引物探針特異性，分別對其進行ERA檢測分析，結(jié)果如圖2所示，4 種引物探針組合均只對特定的陽性靶標菌有良好的擴增，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等13 種其他菌株（表1編號23～35）均無擴增，同時在4 種食源性致病菌之間均未出現(xiàn)交叉擴增，證明本研究選用的4 種引物探針組合特異性良好，可以用于沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和克羅諾桿菌的ERA快速檢測。

圖2 4 種菌ERA引物探針特異性檢測結(jié)果Fig.2 Specificity of ERA probes for four pathogenic bacteria

2.3 雙重ERA檢測體系優(yōu)化

對4 種菌引物探針互相組合的雙重ERA檢測結(jié)果分析，最后選定克羅諾桿菌與單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌與金黃色葡萄球菌兩套雙重ERA檢測體系。進一步對上述兩套雙重ERA檢測體系進行優(yōu)化。如圖3所示，克羅諾桿菌和單核細胞增生李斯特菌雙重ERA檢測體系中每種引物的最佳用量為1.5 μL、每種探針的最佳用量為0.5 μL（圖3A、C）；在沙門氏菌和金黃色葡萄球菌雙重ERA檢測體系中，金黃色葡萄球菌的最佳引物探針用量分別為3.5 μL和0.6 μL，而沙門氏菌的最佳引物與探針用量為4 μL和0.8 μL。由于沙門氏菌的熒光信號強度不如金黃色葡萄球菌高，因此，選擇沙門氏菌的最佳引物與探針用量作為該雙重ERA檢測體系的引物探針用量（圖3B、D）。

圖3 雙重ERA檢測體系優(yōu)化Fig.3 Results of optimization of dual-ERA systems

2.4 雙重ERA檢測方法靈敏度分析

對提取的DNA質(zhì)量濃度進行檢測，C.sakazakiiATCC29544為208.56 ng/μL、S.entericaATCC10708為512.7 ng/μL、L.monocytogenesATCC15313為145.24 ng/μL、S.aureusCMCC26003為239.9 ng/μL。在此基礎(chǔ)上，將克羅諾桿菌和單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的DNA兩兩混合，使體系中每種菌DNA質(zhì)量濃度分別為101、100、10-1、10-2ng/μL。采用優(yōu)化的雙重ERA檢測體系，進一步分析對4 種致病菌檢測的靈敏度。結(jié)果顯示，本研究建立的雙重ERA檢測方法對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的靈敏度較高，DNA質(zhì)量濃度為10-2ng/μL時仍能檢出；對克羅諾桿菌檢測的靈敏度相對較低，最低檢出質(zhì)量濃度為1 ng/μL（圖4）。

圖4 雙重ERA檢測方法靈敏度分析結(jié)果Fig.4 Sensitivity of dual-ERA method

2.5 人工污染實驗

對人工污染的嬰兒配方乳粉樣品進行增菌處理并提取基因組DNA，采用本研究建立的雙重ERA方法進行檢測。表3顯示，增菌培養(yǎng)6 h后，最低可檢出污染量為1 CFU/mL的4 種菌。

表3 人工污染樣品檢測結(jié)果Table 3 Results of detection of artificially contaminated samples

2.6 市售樣品檢測

采用本研究建立的雙重ERA檢測方法對市售的17 份嬰兒配方乳粉樣品進行檢測，并以標準[29-31]規(guī)定的4 種食源性致病菌的實時熒光PCR方法進行結(jié)果比對。結(jié)果顯示，17 種乳粉樣品均未檢測出克羅諾桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌；嬰兒配方牛乳粉和嬰兒配方羊乳粉各有一個樣品檢測出金黃色葡萄球菌，檢出率為11.76%，且雙重ERA檢測方法與標準規(guī)定的實時熒光PCR法檢測結(jié)果一致（表4）。證實了本研究建立的克羅諾桿菌、沙門氏菌、單核李斯特菌和金黃色葡萄球菌雙重ERA檢測方法具有準確性和實用性。

表4 實際樣品檢測結(jié)果Table 4 Results of detection of actual samples

3 討 論

乳粉污染食源性致病菌的案例在國內(nèi)外仍時有發(fā)生。然而，現(xiàn)有的檢測方法存在一些不足，如培養(yǎng)周期過長、需要豐富的檢測經(jīng)驗、對大型儀器設(shè)備依賴度高等。因此，開發(fā)耗時短、易操作、不依賴大型儀器的嬰兒配方乳粉中食源性致病菌快速檢測方法是十分必要的。ERA技術(shù)是近些年研發(fā)的一種等溫擴增技術(shù)，在無需變溫擴增設(shè)備的基礎(chǔ)上，可進一步縮短反應(yīng)時間和檢測靈敏度。目前，國內(nèi)外還沒有利用ERA技術(shù)進行食源性病原菌檢測的報道?？肆_諾桿菌是國標規(guī)定的嬰兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品嚴格不能檢出的病原菌[31]，因此本研究以克羅諾桿菌ompX基因為靶點設(shè)計了ERA引物和探針。OmpX是存在于革蘭氏陰性菌外膜上的一類蛋白質(zhì)，是介導(dǎo)克羅諾桿菌黏附在小腸絨毛細胞表面的關(guān)鍵蛋白[32]，但目前作為PCR檢測靶點的研究較少。本研究以克羅諾桿菌ompX基因靶點建立了ERA可視化快速檢測方法。并創(chuàng)新性地將RAA和RPA檢測體系平移到ERA檢測體系中，通過比較文獻報道的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌RPA/RAA引物探針在ERA檢測體系中的檢測效果，確定了這3 種菌在ERA檢測體系中最優(yōu)的引物探針。并與本研究篩選的克羅諾桿菌ERA引物和探針結(jié)合，構(gòu)建了克羅諾桿菌-單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌-金黃色葡萄球菌兩套雙重ERA快速檢測方法，從而提高了檢測通量，減少了擴增時間，也節(jié)省了檢測成本。

同時，結(jié)合課題組前期已開發(fā)的用自發(fā)熱包提取病原菌基因組DNA的方法，依托合作研發(fā)的4通道便攜式迷你qPCR儀（僅一個平板電腦大小，4 種熒光通道），可在20 min左右完成樣品DNA提取、ERA檢測和出具檢測報告，從而在不依賴實驗室條件下實現(xiàn)食品中致病菌現(xiàn)場快速篩查的目的。且本研究最低可前增菌6 h，即可實現(xiàn)1 CFU/mL的檢出限，與采用前增菌18～22 h的其他方法一致，說明該方法的靈敏度較高。本研究對這4 種食源性致病菌雙重ERA檢測只是一個概念驗證項目，只需替換引物探針序列就可以實現(xiàn)其他靶標的檢測。為食品、臨床、環(huán)境等其他領(lǐng)域的研究提供了新的檢測思路。

4 結(jié) 論

本研究基于ERA技術(shù)，針對嬰兒配方乳粉中易污染的4 種食源性致病菌，建立了克羅諾桿菌-單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌-金黃色葡萄球菌兩套雙重ERA檢測方法，實現(xiàn)了DNA提?。珯z測結(jié)果＋出具報告僅需20 min左右即可完成4 種致病菌快速檢測的目的。且對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的檢出限為10-2ng/μL，對克羅諾桿菌純培養(yǎng)物的檢出限為1 ng/μL，前增菌6 h，樣品中致病菌檢出限可達1 CFU/mL，具有特異性好、靈敏度高、檢測時間短、操作簡單、無需變溫設(shè)備等優(yōu)勢，可用于嬰兒配方乳粉中食源性致病菌的現(xiàn)場快速篩查。