◎ 邵 悅，劉永澤，盧福榮

（營口市食品藥品檢驗檢測中心,遼寧 營口 115000）

霉菌和酵母菌同屬于真菌，其中，霉菌是一些“絲狀真菌”的統(tǒng)稱；酵母菌是一群以芽殖或裂殖來進行無性繁殖的單細胞真菌，沒有菌絲體的圓形、桿狀、臘腸形的真菌。它們廣泛分布于自然界的每個角落，具有很強的新陳代謝能力，并可作為食品正常菌群的一部分。研究表明，如果長期食用霉菌和酵母菌可誘發(fā)癌癥。因此，檢測機構(gòu)常選擇霉菌和酵母菌作為指示菌，通過其數(shù)量判斷食品的污染程度，來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量。

實驗室能力驗證是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構(gòu)能力的活動，也是認可機構(gòu)加入和維持國際相互承認協(xié)議（MRA）的必要條件之一[1-2]。通過實驗室能力驗證，可幫助實驗室了解自身的檢測能力，證實檢測數(shù)據(jù)的準確性，在評價人員能力和驗證實驗方法、實驗數(shù)據(jù)或?qū)嶒灲Y(jié)果準確性等方面具有非常重要的意義[3]。因此，本研究旨在通過分析檢測樣品中的霉菌和酵母菌，對本實驗室進行能力驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本實驗室收到2份待測樣品：ACAS—PT1588(2023)霉菌和酵母計數(shù)能力驗證樣品，均由中國檢驗檢疫科學院測試評價中心發(fā)放，編號分別為23-T787和23-T269。

1.2 材料與試劑

孟加拉紅瓊脂,購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：1110795，規(guī)格：250 g/瓶；氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司，批號：20220927，規(guī)格：500 g/瓶；無菌水，實驗室純水機（UPH-IV-207）自制。

1.3 儀器與設(shè)備

霉菌培養(yǎng)箱：型號DMJ-250C，編號1503059，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；立式壓力滅菌器：型號YXQ-75G，編號20-B2954，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；恒溫水浴鍋：型號HH-ZK6，編號1706062，鞏義市予華儀器有限責任公司；生物安全柜：型號HR1500-IIA2，編號KECC94VCA，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品前處理

樣品前處理的步驟參照ACAS—PT1588(2023)食品中霉菌和酵母計數(shù)能力驗證（第一輪）參試指導書。將樣品開啟后，立即向西林瓶內(nèi)加入5 mL稀釋液，待樣品充分溶解后，吸出放入滅菌后的100 mL無菌瓶中，然后用余下的55 mL稀釋液反復沖洗西林瓶內(nèi)壁2～3次，回收清洗液存入100 mL無菌瓶中，得到的溶液即是待測樣品原液（各環(huán)節(jié)操作保證無菌和充分混勻）。

1.4.2 樣品稀釋

樣品稀釋的步驟參照GB 4789.15—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》第一法。用無菌吸管準確吸取25 mL待測樣品原液，加入225 mL無菌稀釋液，均質(zhì)器拍打充分混勻，即為1∶10樣品勻液。取1 mL 1∶10勻液注入含有9 mL無菌稀釋液試管中，旋渦混勻，即為1∶100樣品勻液。如此，制備10倍遞增系列稀釋樣品勻液，同時以1 mL無菌生理鹽水作為空白對照，每個實驗重復平行2次。將20～25 mL冷卻至46±1 ℃的孟加拉紅瓊脂傾注平皿，并順時針轉(zhuǎn)動平皿10次，使其混合均勻，并置水平臺面，待培養(yǎng)基完全凝固。

1.4.3 培養(yǎng)計數(shù)

培養(yǎng)計數(shù)的步驟參照GB 4789.15—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》第一法。待孟加拉紅瓊脂凝固后，將平皿放置28±1 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中正置進行培養(yǎng)，實驗人員觀察并記錄培養(yǎng)5 d的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果觀察與計數(shù)

收到樣品后，實驗室人員先檢查樣品是否存在破損、污染、密封性不強的問題，確認樣品沒有問題后再進行檢測。樣品溶解應(yīng)保持在西林瓶內(nèi)進行操作，嚴禁將白色凍干樣品倒出西林瓶進行水化[2]。樣品23-C787和樣品23-T269的霉菌與酵母菌在孟加拉紅瓊脂平板上的生長情況如表1所示。

表1 孟加拉紅瓊脂平板上的霉菌與酵母計數(shù)結(jié)果表

樣品23-T787霉菌選取10-2梯度進行計算，結(jié)果為2 900 CFU/mL，酵母菌選取原液和10-1液進行計算，結(jié)果為108 CFU/mL，總數(shù)為3.0×103CFU/mL；樣品23-T269霉菌選擇10-2梯度進行計算，結(jié)果為2 600 CFU/mL，酵母菌選擇原液進行計算，結(jié)果為81 CFU/mL，總數(shù)為2.7×103CFU/mL。因為菌落數(shù)在10-150 CFU之間，所以選擇采用兩位有效數(shù)字報告。在實驗過程中，空白對照分別做了培養(yǎng)基對照和生理鹽水空白對照。空白實驗均無菌落生長，證明實驗有效。

2.2 能力驗證結(jié)果分析

能力驗證結(jié)果如表2所示。

表2 能力驗證評價結(jié)果表

能力驗證評價準則為當|Z|值≤2.0時，實驗結(jié)果為滿意；當2.0＜|Z|＜3.0時，實驗結(jié)果為可疑；當|Z|≥3.0時，實驗結(jié)果為不滿意。其中，樣品23-C787的|Z|值為0.6，23-T269的|Z|值為0.5，2種樣品的|Z|值均＜2.0，評價結(jié)果為滿意。

2.3 檢測過程關(guān)鍵點分析

2.3.1 關(guān)于滅菌

微生物實驗通常是在無菌環(huán)境中，整個實驗過程要確保無菌操作，在做實驗之前要充分準備好實驗所需要的試劑和耗材。無菌水、0.85%生理鹽水、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基以及試劑瓶，都需要在高壓滅菌容器內(nèi)121 ℃高溫下滅菌15 min，待冷卻至室溫時方可使用。在實驗開始之前，實驗室要用紫外燈照射30 min消毒殺菌；實驗人員要戴好一次性無菌帽、口罩和手套，實驗室臺面以及放有樣品的西林瓶要用75%酒精擦拭一遍。在實驗結(jié)束后，用紫外燈照射實驗室30 min。

2.3.2 關(guān)于檢測

整個實驗過程中,必須保證無菌操作;樣品稀釋液一共要用60 mL，要定容準確;每次遞增稀釋倍數(shù)時，應(yīng)換一個1 mL的無菌槍頭；培養(yǎng)基在傾注平皿時要注意培養(yǎng)基溫度，及時將20～25 mL冷卻至46±1 ℃的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，培養(yǎng)基傾注完成后，充分轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻，如果混合不均勻會影響霉菌與酵母菌的計數(shù)。此外，由于霉菌和酵母孢子會擴散，因此在新版標準GB 4789.15—2016中，明確規(guī)定將培養(yǎng)方式調(diào)整為正置培養(yǎng)[4]。

2.3.3 關(guān)于對比實驗

快速測試片法是以紙片作為菌落的培養(yǎng)基載體，通過特定培養(yǎng)基和顯色物與菌落發(fā)生特異性反應(yīng)，培養(yǎng)適當時間，進行菌落數(shù)觀測。在進行本次能力驗證時，采取紙片法做對比，將霉菌與酵母菌測試片置于適合其生長的培養(yǎng)基中。其中，抗生素可抑制細菌生長，再加入菌落生長指示劑和專一性強的酶作顯色劑，繼而可以通過觀察有顯色的菌落，確定霉菌和酵母菌的數(shù)量[5]。這種檢測方法操作簡單，方便與孟加拉紅瓊脂平板上所顯示的菌落數(shù)進行對比，用來作為計數(shù)參考，最終報告結(jié)果時，以孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上的結(jié)果為準。

2.3.4 關(guān)于計數(shù)

霉菌與酵母菌屬于同一種培養(yǎng)基進行同步實驗，在計數(shù)時應(yīng)該分別計數(shù)。由于霉菌生長速度很快，最好在培養(yǎng)第二天時，每天記錄平板上的菌落數(shù)，防止后期霉菌生長太快影響實驗結(jié)果準確性。在進行計數(shù)時不要拿著平板上下翻轉(zhuǎn)，防止孢子擴散。培養(yǎng)24 h時后，培養(yǎng)基肉眼觀察并無菌落生長；培養(yǎng)48 h后，霉菌已經(jīng)生長達到峰值；培養(yǎng)60 h后，霉菌沒有明顯的增值現(xiàn)象；培養(yǎng)72 h后，霉菌已產(chǎn)生大量孢子。由此可見，培養(yǎng)時間越長，霉菌的菌絲生長越大，到最后會覆蓋平皿，造成計數(shù)困難。因此，建議在培養(yǎng)40～48 h內(nèi)進行實驗計數(shù)，所得結(jié)果較為準確。

3 結(jié)語

本實驗室此次能力驗證結(jié)果滿意，提高了檢驗人員的技術(shù)水平，為擴大實驗室核心競爭力奠定了良好的基礎(chǔ)。同時，實驗過程符合標準要求，能夠為食品中霉菌和酵母菌檢測提供可靠的數(shù)據(jù)，從而為營口市食品藥品檢驗檢測中心承擔國家抽檢工作奠定良好的基礎(chǔ)。