胥聆銘，朱 莉，詹曉北*，高澤鑫，尹忠偉

（1. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122； 2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122； 3. 無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫 214125）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種常見的革蘭氏陽性菌，能夠產生芽孢，具有較強的抗逆性[1]。其在自然界中廣泛分布于水、土壤、空氣中，且與大多數(shù)動植物具有密切的共生關系[2]。

近年來，生物防治在農業(yè)與環(huán)境保護方面都成了研究熱點，越來越多的人利用微生物處理動植物疾病與環(huán)境問題[3]。 蠟樣芽孢桿菌憑借其優(yōu)異性質吸引了許多研究者的興趣，李生樟等利用蠟樣芽孢桿菌拮抗水稻條斑病，表明蠟樣芽孢桿菌能夠抑制水稻條斑病菌的生長，限制條斑病癥狀的擴展[4]。 此外，蠟樣芽孢桿菌在代謝物合成[5-7]、益生菌劑制備[8-9]、廢水處理[10]、土壤修復[11]等方面都有良好的表現(xiàn)。 于平等利用蠟樣芽孢桿菌高密度發(fā)酵生產新型中性蛋白酶，獲得了酶活力為702.21 U/mL 的中性蛋白酶[12]。綜上所述，蠟樣芽孢桿菌是一種很有前景的微生物菌株，可以廣泛應用于農業(yè)、食品、醫(yī)藥等領域。

目前關于提高蠟樣芽孢桿菌產量的報道相對較少[13]，已有報道的蠟樣芽孢桿菌產量最高只有1.2×1010CFU/mL[14]，不足以滿足工業(yè)化生產的需求。通常認為發(fā)酵條件優(yōu)化是影響生物過程中細菌生長與芽孢形成的關鍵因素[15]。 因此可以對蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵條件與過程進行優(yōu)化，以提高其產量，滿足工業(yè)化需求。

高密度發(fā)酵（High Cell-Density Culture，HCDC）又稱高密度培養(yǎng)，是一種相較于常規(guī)培養(yǎng)夠顯著提高產物產量的培養(yǎng)技術[16]，對降低生產成本與工業(yè)化擴大生產具有重要意義。 劉開放等利用高密度發(fā)酵技術對布拉酵母培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化，搖瓶階段酵母產量達8.21 g/L，比優(yōu)化前提高1.39 倍，于50 L發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)，酵母產量達到51.21 g/L[17]。因此利用高密度發(fā)酵技術培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌來促進其工業(yè)化生產切實可行。 此外，蠟樣芽孢桿菌的芽孢具有多種優(yōu)良特性，在利用高密度發(fā)酵技術提高蠟樣芽孢桿菌產量的同時，也需提高其芽孢率，以最大化利用蠟樣芽孢桿菌。

作者以Bacillus cereus ATCC 14579 為實驗菌株，通過單因素實驗對蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，獲得最適宜蠟樣芽孢桿菌生長的碳源與氮源。 在此基礎上，于7 L 發(fā)酵罐進行深層擴大培養(yǎng)，探究最佳發(fā)酵調控策略，以期提高蠟樣芽孢桿菌產量與芽孢率，為其工業(yè)化生產和應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

蠟樣芽孢桿菌 （Bacillus cereus）：編號ATCC 14579，來源于作者所在實驗室保藏的菌種。

1.2 主要儀器與設備

尼康TI-S-EJOY 型倒置顯微鏡：日本Nikon 公司產品； 英諾聚Enology Y15 型全自動葡萄酒分析儀：西班牙Biosystems 公司產品；Eppendorf New Brunswick BioFlo/CelliGen115 型全自動發(fā)酵罐：美國Eppendorf 公司產品。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（組分g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10；pH 7.0。

NA 固體培養(yǎng)基（組分g/L）：胰蛋白胨10，牛肉浸粉3，氯化鈉5，瓊脂20；pH 7.3。

種子培養(yǎng)基（組分g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，葡萄糖10；pH 7.0。

1.4 主要試劑

酵母粉：購自Oxoid 公司；其他試劑：均為國產分析純，購自國藥化學試劑有限公司。

1.5 單因素實驗

1）蠟樣芽孢桿菌活化培養(yǎng) 將實驗室保存的蠟樣芽孢桿菌轉接到NA 固體培養(yǎng)基中，于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，傳代2 次后置于4 ℃保存。

2）種子液制備 用接種環(huán)挑取1 環(huán)活化2 次后的菌苔，接入種子培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)14~16 h，獲得種子液。

3）250 mL 搖瓶中營養(yǎng)物質篩選 在LB 培養(yǎng)基基礎上，通過單因素實驗，探究不同碳源、氮源對蠟樣芽孢桿菌生長情況的影響，通過測定各因素下發(fā)酵液OD600與活菌數(shù)來判斷菌體生長情況，采用雙染色法監(jiān)控芽孢形成情況。

1.6 深層高密度發(fā)酵擴大培養(yǎng)

根據(jù)搖瓶階段優(yōu)化的培養(yǎng)基配方與發(fā)酵條件，在7 L 發(fā)酵罐上進行擴大培養(yǎng)，初始裝液量為3 L，將蠟樣芽孢桿菌種子液按體積分數(shù)10%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。 初始培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖12.5，水溶性淀粉12.5，大豆蛋白胨10，酵母提取物10，MgSO4·7H2O 3，（NH4）2SO43，MnCl20.2；初始通氣量為3 L/min，攪拌轉速為250 r/min，溫度30 ℃，初始pH 恒定為6.5，在發(fā)酵過程中流加碳源和氮源，改變轉速與通氣量，自動流加2 mol/L NaOH 與1 mol/L磷酸調控pH。 發(fā)酵過程中以泡敵消泡，每隔3 h 取一次樣，測定OD600、pH、活菌數(shù)與芽孢數(shù)。

1.6.1 補料分批發(fā)酵

1）間歇流加碳源 當培養(yǎng)基中殘?zhí)琴|量濃度低于5 g/L 時開始流加碳源，流加液為75 mL 200 g/L葡萄糖與200 g/L 水溶性淀粉混合液，每隔3 h 測定一次殘?zhí)琴|量濃度。

2）間歇流加碳氮源 當培養(yǎng)基中殘?zhí)琴|量濃度低于5 g/L 時開始流加碳源與氮源，流加液中碳源為75 mL 200 g/L 葡萄糖與200 g/L 水溶性淀粉混合溶液，氮源為75 mL 100 g/L 酵母提取物與100 g/L 大豆蛋白胨混合溶液，每隔3 h 測定1 次殘?zhí)桥c殘留伯胺氮質量濃度。

3）恒速流加碳氮源 當培養(yǎng)基中殘?zhí)琴|量濃度低于5 g/L 時開始流加碳源與氮源，流加液中碳源為200 g/L 葡萄糖與200 g/L 水溶性淀粉混合液，氮源為100 g/L 酵母提取物與100 g/L 大豆蛋白胨混合液。 碳源與氮源流加速率為0.45 mL/min。

1.6.2 分段pH 調控 0~18 h 時恒定pH 為6.5，18 h 時將pH 調至7.5，直至整個發(fā)酵過程結束。

1.6.3 分段攪拌轉速與通氣量調控 0~9 h 保持攪拌轉速為250 r/min，通氣量為3 L/min；9~18 h 調高攪拌轉速與通氣量至350 r/min 與4.5 L/min，18 h時將攪拌轉速與通氣量調至150 r/min 與2.25 L/min，直至發(fā)酵結束。

1.7 檢測方法

1.7.1 菌體質量濃度測定 發(fā)酵液的菌體質量濃度采用比濁法（OD600）測定。

1.7.2 pH 測定 取一定量發(fā)酵液，10 000 r/min 離心5 min，取上清液于pH 計上測定pH。

1.7.3 活菌與芽孢計數(shù) 參見GB 4789.14—2014[18]，芽孢率Y 通過芽孢數(shù)A 和活菌數(shù)B 計算，公式如下：

1.7.4 芽孢形成過程監(jiān)控 取樣后涂片，干燥固定，滴加孔雀綠染液蓋滿菌膜，置于酒精燈上加熱5 min，傾去染液，待玻片冷卻至室溫后，用細水流沖洗玻片，再用番紅復染1~2 min 后，傾去染液，干燥后，顯微鏡鏡檢。

1.7.5 殘?zhí)琴|量濃度 采用蒽銅-硫酸比色法測定發(fā)酵液中殘?zhí)琴|量濃度[19]。

1.7.6 伯胺氮質量濃度 取一定量發(fā)酵液，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，使用英諾聚Enology Y15 型全自動葡萄酒分析儀測定發(fā)酵液中伯胺氮質量濃度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

以上每個實驗重復3 次。 采用SPSS 25.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析Origin 2021 制圖。

2 結果與分析

2.1 碳源對蠟樣芽孢桿菌生長的影響

在LB 培養(yǎng)基的基礎上，分別以葡萄糖（10 g/L）和相同質量濃度的水溶性淀粉、麥芽糖、玉米糊精、糖蜜和蔗糖為碳源，探究不同碳源對菌體生長的影響，實驗結果如圖1（a）所示。以10 g/L 葡萄糖和10 g/L 水溶性淀粉為碳源，菌體生長情況最好。 分別測定這2 種發(fā)酵液中的活菌數(shù)、 芽孢數(shù)、pH 與OD600的變化情況，實驗結果如圖1（b）、（c）所示。 以葡萄糖為碳源，菌體生長情況最好，以水溶性淀粉為碳源，芽孢最早出現(xiàn)。 基于上述結果，選擇將葡萄糖與水溶性淀粉進行復配，復配結果如圖1（d）所示。 當葡萄糖與水溶性淀粉的質量比為1∶1 時，發(fā)酵液OD600最高。 且葡萄糖與水溶性淀粉價格低廉，以葡萄糖和水溶性淀粉為碳源，不僅能獲得較高產量與芽孢率，還能大大降低生產成本，故以質量比1∶1 葡萄糖與水溶性淀粉為碳源。

圖1 碳源對蠟樣芽孢桿菌生長的影響Fig. 1 Effect of carbon source on the growth of Bacillus cereus

2.2 氮源對蠟樣芽孢桿菌生長的影響

氮源對菌體生長具有重要影響，蛋白質是細胞結構的組成成分，也是菌體生長不可或缺的營養(yǎng)物質。 分別以酵母提取物（10 g/L）與等質量濃度的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、尿素與氯化銨為氮源，探究不同氮源對菌體生長的影響。 實驗結果如圖2（a），以大豆蛋白胨與酵母提取物為氮源，菌體生長情況最好。 代書玲等的報道中發(fā)現(xiàn)，復配氮源比單一氮源更有利于菌體生長[10]，因此進一步探究了氮源復配比例對菌體生長的影響。 如圖2 （b）所示，當大豆蛋白胨與酵母提取物的添加質量比為1∶1 時，發(fā)酵液OD600最高，菌體生長情況最好。 酵母提取物來源于微生物，大豆蛋白胨來源于植物，以二者為共同氮源，能提供更豐富的營養(yǎng)物質，有利于菌體的生長。 故選擇質量比為1∶1 的酵母提取物與大豆蛋白胨為氮源。

圖2 氮源對蠟樣芽孢桿菌生長的影響Fig. 2 Effect of nitrogen source on the growth of Bacillus cereus

2.3 發(fā)酵罐深層擴大培養(yǎng)

2.3.1 流加策略的影響 補料分批發(fā)酵是通過間歇或連續(xù)補加一定量新鮮培養(yǎng)基，排出廢料，使菌體能在生長階段獲得足夠的營養(yǎng)物質并減緩菌種老化，可以讓菌體保持較高且較穩(wěn)定的生長速率，從而獲得高產物產量[20-22]。 目前補加單一營養(yǎng)物質的補料分批發(fā)酵策略較常見，鄒孟琳等通過連續(xù)流加葡萄糖，獲得了較高產量丁酸梭菌及芽孢[23]。但補加單一營養(yǎng)物質，可能導致發(fā)酵液中部分營養(yǎng)物質過剩，使菌體產生過多代謝副產物，不利于菌體生長發(fā)育。 劉景陽等通過全營養(yǎng)流加，獲得了較高產量的谷氨酸[24]。楊文革等也通過流加多種營養(yǎng)物質，獲得了高產量的蠟樣芽孢桿菌[25]。 作者在此基礎上稍加修改，探究間歇流加碳源、間歇流加碳氮源與恒速流加碳氮源3 種策略對蠟樣芽孢桿菌生長及芽孢形成情況的影響。 間歇流加碳源結果見圖3（a），發(fā)酵液中氮源在9~12 h 時耗盡，由于缺乏氮源，菌體的生長速率減緩。 同時流加碳氮源結果如圖3（b）所示，菌體生長速率在整個對數(shù)生長階段未出現(xiàn)明顯減緩，表明同時流加碳氮源有利于菌體的快速生長繁殖。 如圖3（c）所示，恒速流加碳氮源后發(fā)酵液中活菌數(shù)明顯增多，但芽孢率沒有顯著提升，考慮到恒速流加策略更加簡單易操作，因而選擇以恒速流加方式，同時流加碳氮源作為蠟樣芽孢桿菌高密度發(fā)酵的流加策略。

圖3 不同流加方式對蠟樣芽孢桿菌生長的影響Fig. 3 Effect of different feeding methods on the growth of Bacillus cereus

2.3.2 分段pH 的影響 通過搖瓶階段的實驗發(fā)現(xiàn)，pH 會影響蠟樣芽孢桿菌的生長與芽孢形成產生，弱酸性條件適合菌體生長，弱堿性條件適合芽孢形成，這與Hue 等的研究結果[26]相符合。 故在7 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)階段，將恒速流加碳氮源流加策略與分段pH 調控策略相結合，在菌體生長達到穩(wěn)定期前，使用弱酸性環(huán)境（pH 6.5）進行培養(yǎng)，促進其生長，待菌體生長進入穩(wěn)定期后，將發(fā)酵液pH 調至弱堿性環(huán)境（pH 7.5）進行培養(yǎng)，促使其轉變?yōu)檠挎?，實驗結果見圖4。18 h 菌體生長達到穩(wěn)定期后，將發(fā)酵液pH 從弱酸性調至弱堿性，與恒定弱酸性條件相比，發(fā)酵液中活菌數(shù)無較大差異，但分段pH 調控后芽孢率得到了較大提升，故恒速流加碳氮源與兩段pH 調控相結合策略有利于菌體生長及芽孢形成。

圖4 分段pH 調控策略結果Fig. 4 Results of segmented pH control strategy

2.3.3 分段攪拌轉速與通氣量調控策略 溶氧對蠟樣芽孢桿菌的生長具有重要影響[27-28]，低溶氧條件不利于菌體生長，并會促使其轉變?yōu)檠挎遊29-30]。 發(fā)酵罐中的溶氧一般由改變通氣量與攪拌轉速調控[31]。 故以分段pH 與恒速流加碳氮源為基礎，在菌體生長進入穩(wěn)定期（18 h）時，通過降低攪拌轉速與通氣量考察低溶氧對芽孢率的影響，結果見圖5（a）。 在菌體生長達到穩(wěn)定期后，將攪拌轉速與通氣量從250 r/min 與3 L/min 降低至150 r/min 與2.25 L/min。 因而芽孢率從（58.0±0.5）%升至90.0%以上，表明此種溶氧調控方式能夠顯著提高芽孢率。

圖5 分段攪拌轉速與通氣量調控策略Fig. 5 Control strategy of segmented stirring speed and ventilation ratio

在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，菌體生長進入對數(shù)生長期中期后，發(fā)酵液變黏稠，氧氣傳遞速率下降，溶氧快速減少，因而考慮在此時加大攪拌轉速與通氣量，對發(fā)酵液進行充分攪拌，增加發(fā)酵液中溶氧，以促進菌體的生長繁殖。 結果如圖5（b）所示，在9 h 時調高攪拌轉速與通氣量至350 r/min 與4.5 L/min；18 h 時，按照圖5（a）策略調低攪拌轉速與通氣量，以此得到三段攪拌轉速與通氣量調控策略。 在此調控策略下，發(fā)酵液中活菌數(shù)得到了較大提升，最終達到2.2×1010CFU/mL。

2.4 芽孢率鏡檢分析

芽孢是細菌的休眠體，一般為內生孢子，在惡劣環(huán)境下，細菌形成芽孢，待到條件適宜時，再重新萌發(fā)為細菌。 在前面的實驗中，通過分段pH、分段攪拌轉速與通氣量調控，發(fā)酵結束時發(fā)酵液內的蠟樣芽孢桿菌芽孢率超過90.0%。 圖6 為實驗過程中所觀察到的芽孢形成過程圖，實驗中所使用的染色方法為雙染色法，即利用菌體與芽孢對染液的親和力不同，將菌體染為紅色，芽孢染為綠色，以便于觀察區(qū)分。 從圖6 中可以看出，到12 h 開始有菌體轉變?yōu)檠挎撸?8 h 芽孢開始逐漸增多，但此時主要還處于芽孢形成階段，芽孢作為內生孢子，還未脫離菌體。 18 h 后進行的一系列調控使發(fā)酵液中的芽孢率開始快速上升，到24 h 時芽孢率達到50%以上；到30 h 時發(fā)酵液中芽孢率達90.0%以上。 以上結果表明本實驗所使用的發(fā)酵調控策略能有效提升芽孢率。

圖6 蠟樣芽孢桿菌芽孢形成過程（×100）Fig. 6 Bacillus cereus spore formation process（×100）

3 結 語

作者通過搖瓶階段的研究，篩選出最利于蠟樣芽孢桿菌生長的碳源為葡萄糖與相同質量濃度的水溶性淀粉，氮源為大豆蛋白胨與相同質量濃度的酵母提取物。通過7 L 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，分別探究了流加方式、pH 與溶氧對蠟樣芽孢桿菌生長情況和芽孢率的影響。 結果表明，0~9 h 恒定攪拌，轉速、通氣量與pH 分別為250 r/min、3 L/min 與6.5；9 h 時以0.45 mL/min 速率流加碳氮源，并提高攪拌轉速至350 r/min，通氣量為4.5 L/min；18 h 時停止流加碳氮源，調高pH 至7.5，攪拌轉速與通氣量分別降至150 r/min 與2.25 L/min。 在此調控策略下，18 h時蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)達到2.2×1010CFU/mL，是未優(yōu)化前的4.8 倍，發(fā)酵結束時，芽孢率超過90.0%。

利用流加碳氮源與分段pH、 攪拌轉速與通氣量調控相結合策略對蠟樣芽孢桿菌進行高密度發(fā)酵，是本研究的一個創(chuàng)新點，實驗結果也表明此調控策略確實有效，與未優(yōu)化結果相比，蠟樣芽孢桿菌生物量與芽孢率均有了較大提高，研究結果為蠟樣芽孢桿菌工業(yè)化生產提供了新思路。