寧豫昌，高俊杰，2，袁藝萌

（1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）又名繅絲花，是薔薇科多年生落葉灌木，廣泛分布于貴州、云南、湖南等地，在貴州存在大面積人工種植。 刺梨果實(shí)具有獨(dú)特濃郁果香，含有豐富的維生素C、多酚、黃酮、類胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)，以及三萜皂苷、有機(jī)酸、氨基酸等多種生物有效成分[1-4]。 刺梨具有健脾開(kāi)胃、滋陰補(bǔ)津、強(qiáng)身健體、抗衰老等功效，且無(wú)急慢性毒性，可長(zhǎng)期安全食用[5]。 由于富含營(yíng)養(yǎng)且具有保健功能，刺梨已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品等行業(yè)，研發(fā)出果汁、果酒、飲料、果干、果脯、凍干粉膠囊等相關(guān)產(chǎn)品[6]。 但是由于刺梨果實(shí)中含有豐富的單寧和有機(jī)酸，因此刺梨鮮果和果汁往往表現(xiàn)出明顯的酸澀口感，影響了刺梨產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與銷售。 為了解決這一問(wèn)題，本課題組前期將刺梨果汁與蘋果汁按一定比例混合，并利用副干酪乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，制得了一種抗氧化性強(qiáng)、口感柔和、兼具刺梨和蘋果風(fēng)味的混合發(fā)酵果汁。 但是，由于刺梨和蘋果果汁中果膠和纖維素的含量較高，導(dǎo)致發(fā)酵后的混合果汁容易出現(xiàn)混濁、沉淀、分層等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了該混合發(fā)酵果汁產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

果實(shí)中含有的果膠和植物纖維使果汁的壓榨與澄清變得十分困難[7]。 果膠酶和纖維素酶能有效地降解果膠和植物纖維等復(fù)雜分子鏈結(jié)構(gòu)，破壞植物組織細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)最大限度地釋放出來(lái)，從而提高出汁率，使果汁變得清澈透亮，因此常被用于果蔬汁的澄清處理。 晏敏等采用果膠酶處理，使紅檸檬果汁的透光率由2.5%提升到了93.8%[8]。呂長(zhǎng)鑫等利用果膠酶與纖維素酶的復(fù)合酶制劑對(duì)南果梨汁飲料進(jìn)行了澄清處理，透光率達(dá)到了93.4%[9]。目前，人們的關(guān)注點(diǎn)多為果膠酶、纖維素酶等處理對(duì)果蔬汁出汁率和透光率等的影響，而酶制劑處理是否會(huì)影響果汁或發(fā)酵果汁的活性成分、抗氧化性等相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)。 王美美等研究了果膠酶、纖維素酶等對(duì)紅樹莓果汁抗氧化性的影響，發(fā)現(xiàn)用果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶進(jìn)行處理，可以提高果汁中總酚、花色苷、總黃酮的含量，且能改善果汁的DPPH 自由基清除率等抗氧化指標(biāo)[10]。 為了提高刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁的澄清度，并探究酶處理工藝對(duì)混合果汁發(fā)酵后品質(zhì)的影響，作者使用由果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶對(duì)刺梨、蘋果混合果汁進(jìn)行處理，然后用副干酪乳桿菌分別對(duì)經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)復(fù)合酶處理的混合果汁進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)它們的理化性質(zhì)、抗氧化性、感官評(píng)價(jià)等進(jìn)行研究，探討將復(fù)合酶應(yīng)用于刺梨、蘋果混合果汁發(fā)酵前處理的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果：市售，產(chǎn)地?zé)熍_(tái)；新鮮刺梨：購(gòu)自貴州省六盤水市；副干酪乳桿菌：購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，菌種編號(hào)BNCC 189800；食品級(jí)果膠酶（酶活力為1 U/mg）和食品級(jí)纖維素酶（酶活力為10 U/mg）：購(gòu)于河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基：購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蘆丁 （色譜純）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司； 色譜純1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；福林酚試劑（純度99%）、維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸、3，5-二硝基水楊酸、焦性沒(méi)食子酸、氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉、酚酞、亞硝酸鈉、硫酸銅、硫酸亞鐵、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫、正己烷、丙酮、碘、碘化鉀、鹽酸、TRIS、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉：均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP 恒溫培養(yǎng)箱、DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；H1850R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；FA1104 電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HHS-21-6 電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；752 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；LDZM-60KCS 立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；便攜式pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料前處理 將新鮮蘋果和刺梨分別清洗后去核、切塊、榨汁、過(guò)濾，得蘋果汁和刺梨汁，然后將刺梨汁、蘋果汁、水按1∶2∶2 的體積比混合均勻，得到刺梨、蘋果混合果汁，最后將混合果汁在85 ℃水浴中保溫15 min 以進(jìn)行巴氏殺菌。

1.3.2 復(fù)合酶處理混合果汁的單因素實(shí)驗(yàn) 復(fù)合酶處理混合果汁的基礎(chǔ)條件為酶制劑添加量3 g/L、果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比3∶2、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間1.5 h。 在基礎(chǔ)處理?xiàng)l件的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)置不同的酶解時(shí)間 （0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、 酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）、 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比（1∶1、2∶1、3∶1、3∶2、4∶1、2∶3） 進(jìn)行復(fù)合酶處理混合果汁的單因素實(shí)驗(yàn)，以透光率和出汁率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究各因素對(duì)果汁澄清效果的影響，并確定各因素的最優(yōu)值。 其中，將復(fù)合酶處理過(guò)的混合果汁5 000 r/min 離心10 min，取上清液于波長(zhǎng)680 nm 處測(cè)透光率，并稱量離心前的果汁質(zhì)量和離心后的沉淀質(zhì)量，計(jì)算出汁率。

1.3.3 復(fù)合酶處理混合果汁的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，選用L9（34）正交表，以透光率為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)并經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析得出最優(yōu)酶解條件。 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.4 復(fù)合酶處理對(duì)混合發(fā)酵果汁品質(zhì)的影響 將副干酪乳桿菌斜面菌種轉(zhuǎn)接到液體MRS 培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min 的搖床中培養(yǎng)48 h，再用液體MRS 培養(yǎng)基繼續(xù)轉(zhuǎn)接活化2~3 代，直至培養(yǎng)液中乳酸菌含量達(dá)到1.0×108CFU/mL。 將培養(yǎng)過(guò)的菌液于6 000 r/min 離心5 min 后，棄去上清液，然后用等量無(wú)菌生理鹽水重懸后即為種子液。 向混合果汁中接種體積分?jǐn)?shù)7%的種子液，在37 ℃下靜置培養(yǎng)21 h 后獲得刺梨和蘋果混合發(fā)酵果汁。以經(jīng)復(fù)合酶處理后發(fā)酵制得的混合發(fā)酵果汁為實(shí)驗(yàn)組，未經(jīng)復(fù)合酶處理制得的混合發(fā)酵果汁為對(duì)照組，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行透光率、酸度、還原糖、維生素C 等各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，以分析復(fù)合酶處理對(duì)混合發(fā)酵果汁品質(zhì)的影響。

1）酸度測(cè)定 取適量發(fā)酵果汁超聲5 min 以去除CO2，然后8 000 r/min 離心5 min，上清液即為待測(cè)液。 待測(cè)樣液與40.0 mL 經(jīng)脫氣處理的蒸餾水加入100.0 mL 錐形瓶中，向錐形瓶中滴加2~3 滴酚酞指示劑，然后用已標(biāo)定的0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，并不斷搖晃錐形瓶，直至溶液變至微紅色且在30 s 內(nèi)不褪色。按照公式（1）計(jì)算酸度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

式中：Y 為酸度值 （以乳酸計(jì)），%；C 為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V 為待測(cè)發(fā)酵果汁所消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的體積，mL；K 為1mol 氫氧化鈉相匹配的主要酸的克數(shù)，當(dāng)用乳酸表示時(shí)，K=0.090；V0為待測(cè)樣品體積，mL。

2）pH 測(cè)定 取待測(cè)發(fā)酵果汁用pH 計(jì)直接測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3）還原糖質(zhì)量濃度測(cè)定 參考李孟平等[11]的方法，采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測(cè)定待測(cè)發(fā)酵果汁中還原糖的質(zhì)量濃度（g/L）。

4） 乳酸菌含量測(cè)定 利用MRS 固體培養(yǎng)基，采用稀釋平板法對(duì)樣品中的乳酸菌含量（單位體積樣品的菌落形成單位數(shù)，CFU/mL）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

5）維生素C 質(zhì)量濃度測(cè)定 參考張歆皓等[12]的方法，采用直接碘量法測(cè)定發(fā)酵果汁中維生素C 的質(zhì)量濃度（mg/dL）。首先，精確稱取100 mg 維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100.0 mL，調(diào)勻即為標(biāo)準(zhǔn)維生素C 溶液。 分別取25.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)維生素C 溶液4 等份，用稀鹽酸調(diào)其pH 值至3.0，分別加入2.0 mL的10 g/L 的淀粉溶液作為指示劑，用0.02 mol/L 的碘液滴定標(biāo)準(zhǔn)維生素C 溶液至藍(lán)色，并保持30 s 不褪色。 記錄標(biāo)準(zhǔn)維生素C 溶液所消耗碘液的體積，并求其平均值。 然后，取25.0 mL 待測(cè)發(fā)酵果汁4份，分別加入2.0 mL 10 g/L 的淀粉溶液作為指示劑，用0.02 mol/L 的碘液滴定待測(cè)樣液至藍(lán)色，并保持30 s 不褪色。 記錄待測(cè)樣液所消耗碘液的體積，并求其平均值。 維生素C 的質(zhì)量濃度CVC按照公式（2）計(jì)算：

式中：CVC為維生素C 的質(zhì)量濃度，mg/dL；m 為25.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)維生素C 溶液中維生素C 的質(zhì)量，g；V1為待測(cè)發(fā)酵果汁所消耗碘液體積的平均值，mL；V2為標(biāo)準(zhǔn)維生素C 溶液所消耗碘液體積的平均值，mL。

6）總酚質(zhì)量濃度測(cè)定 參照賴婷等人[13]的方法測(cè)定樣品中總酚的質(zhì)量濃度（mg/mL），但略有修改。取待測(cè)發(fā)酵果汁1.0 mL 于10.0 mL 容量瓶中，加入2.0 mL 福林酚試劑，充分混勻，加入0.75 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%碳酸鈉溶液，混勻后以蒸餾水定容至刻度，再次混勻后靜置2 h，同時(shí)制作不加待測(cè)樣液的空白組。 在765 nm 處測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和空白組的吸光值并記錄，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總酚的質(zhì)量濃度（y=0.544 8x－0.008 1，R2=0.994 6）。

7） 總黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定 參考孫雪皎等人[14]的方法測(cè)定樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度 （mg/mL），但略有修改。 取待測(cè)發(fā)酵果汁1.60 mL 于10.0 mL 容量瓶中，加入50 g/L 亞硝酸鈉溶液0.28 mL，搖勻，5 min 后加入100 g/L 硝酸鋁溶液0.28 mL，搖勻，6 min 后加入4.00 mL 體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液，再次搖勻，加入40 g/L 的氫氧化鈉溶液4.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液定容至10.0 mL，再次搖勻，靜置10 min 后于520 nm 測(cè)定其吸光度。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣液中總黃酮的質(zhì)量濃度（y=1.125 9x－0.011 9，R2=0.995 2）。

8）類胡蘿卜質(zhì)量濃度測(cè)定 參考劉嘉寧等人[15]的方法測(cè)定樣品中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度（μg/mL），但稍有修改。 取10.0 mL 待測(cè)發(fā)酵果汁加入20.0 mL提取液于100.0 mL 帶蓋錐形瓶中，常溫下攪拌30 min，加入7.5 mL 蒸餾水，繼續(xù)在常溫下攪拌10 min。 提取液組成如下：體積分?jǐn)?shù)50%的正己烷、體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)25%的丙酮、0.25 g氯化鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的BHT。 攪拌結(jié)束后將混合物倒入分液漏斗中，充分振蕩后靜置，待液體清晰地分為2 層后，收集上層有機(jī)相。 該實(shí)驗(yàn)的空白組為加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的BHT 并充分?jǐn)嚢枞芙獾恼和椤?在450 nm 下測(cè)定其吸光度，按照公式（3）計(jì)算混合發(fā)酵果汁中類胡蘿卜素Cca質(zhì)量濃度：

式中：A 為待測(cè)發(fā)酵果汁在450 nm 處的吸光度；V為收集的有機(jī)相的體積，mL；V1為量取的待測(cè)混合發(fā)酵果汁的體積，mL；2 560 為1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)β-類胡蘿卜素在正己烷中的消光系數(shù)。

9）羥自由基清除率測(cè)定 參考束文秀等人[16]的方法并略有修改：吸取待測(cè)發(fā)酵果汁1.0 mL，9 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2.0 mL，9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2.0 mL，8.8 mmol/L 過(guò)氧化氫溶液0.2 mL，搖勻并于37 ℃下保溫30 min。 以超純水代替待測(cè)樣液其他條件不變的反應(yīng)溶液作為空白組，以超純水代替水楊酸-乙醇溶液其他條件不變的反應(yīng)溶液作為調(diào)零組。 測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與空白組在510 nm 處測(cè)定吸光值，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)并取其平均值。 羥自由基清除率R1按公式（4）計(jì)算：

式中：R1為羥自由基清除率，%；A0為空白組的吸光度；AS為待測(cè)發(fā)酵果汁作為自由基清除劑加入后的吸光度。

10）超氧陰離子自由基清除率測(cè)定 參考束文秀等[16]的方法并略有修改：向試管中加入4.5 mL 的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.2），置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，然后分別加入1.0 mL 的待測(cè)發(fā)酵果汁、0.4 mL 的25 mmol/L 鄰苯三酚溶液 （以10 mmol/L 鹽酸溶液配制）混勻，置于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1.0 mL 的8 mol/L 鹽酸溶液終止反應(yīng)。將以1.0 mL 蒸餾水代替待測(cè)發(fā)酵果汁，其他條件不變的所得反應(yīng)溶液作為空白組，以0.4 mL 蒸餾水代替25 mmol/L 鄰苯三酚溶液 （以10 mmol/L 鹽酸溶液配制）其他條件不變的反應(yīng)溶液作為背景組。 于325 nm 處測(cè)定實(shí)驗(yàn)組、空白組、背景組的吸光度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)并取其平均值。 超氧陰離子自由基清除率R2按公式（5）計(jì)算：

式中：R2為超氧陰離子自由基清除率，%；A 為待測(cè)發(fā)酵果汁作為自由基清除劑加入后的吸光度；A1為背景組的吸光度；A0為空白組的吸光度。

11）DPPH 自由基清除率測(cè)定 參考束文秀等[16]的方法測(cè)定發(fā)酵果汁的DPPH 自由基清除率。 分別吸取2.0 mL 的待測(cè)樣液，2.0 mL 的0.2 mmol/L DPPH 無(wú)水乙醇溶液，混勻后于37 ℃水浴中避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記為Ai。同上條件，測(cè)定2.0 mL 的待測(cè)樣液、2.0 mL 的無(wú)水乙醇溶液混合液的吸光度，記為Aj，測(cè)定2.0 mL的無(wú)水乙醇、2.0 mL 的0.2 mmol/L DPPH 無(wú)水乙醇溶液混合液的吸光度，記為Ac。 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)并取其平均值。 DPPH 自由基清除率R3按公式（6）計(jì)算：

式中：R3為DPPH 自由基清除率，%；Ai為待測(cè)發(fā)酵果汁作為DPPH 自由基清除劑加入后的吸光度；Aj為背景組的吸光度；Ac為空白組的吸光度。

1.1.5 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁感官評(píng)價(jià)的影響 根據(jù)刺梨、 蘋果混合發(fā)酵汁的色澤、香氣、組織狀態(tài)、口感4 個(gè)方面設(shè)定感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分選用百分制，其中色澤20 分，香氣30 分，組織狀態(tài)20 分，口感30 分。 感官評(píng)價(jià)小組由受過(guò)專業(yè)訓(xùn)練且獲得品酒師三級(jí)證書的20 名學(xué)生組成，其中男女各10 人。 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置20 個(gè)樣本，感官評(píng)價(jià)表如表2 所示。

表2 混合發(fā)酵果汁感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation index of mixed fermented juice

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合酶處理刺梨、蘋果混合果汁條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間 酶解時(shí)間對(duì)刺梨、 蘋果混合果汁澄清效果的影響見(jiàn)圖1。無(wú)論是透光率還是出汁率，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為2.0 h 時(shí)，透光率和出汁率均達(dá)到最大值。結(jié)果表明酶解時(shí)間并非越長(zhǎng)越好，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)影響果汁的澄清效果和出汁率。 任旭桐等利用果膠酶澄清處理枸杞汁時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，枸杞汁透光率最大，隨后透光率變化趨勢(shì)趨于平緩[17]。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2.0 h 后透光率下降，推測(cè)可能是由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致果肉組織中的一些物質(zhì)被酶解成小分子物質(zhì)并過(guò)多地溶進(jìn)果汁引起的。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)混合果汁澄清效果的影響Fig. 1 Effect of enzymolysis time on the clarification effect of mixed juice

2.1.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比 果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比對(duì)混合果汁澄清效果的影響見(jiàn)圖2。果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比對(duì)混合果汁出汁率的影響并不大，而對(duì)透光率的影響較大，當(dāng)果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為2∶3~4∶1 時(shí)，混合果汁出汁率為96.37%~97.36%，而透光率的變化范圍則為89.55%~97.32%。當(dāng)果膠酶與纖維素酶的比例為3∶2時(shí)透光率最大，為97.32%。 安玉紅等人在優(yōu)化果膠酶與纖維素酶添加比例時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比的增大，刺梨汁的透光率呈先增大后減小的趨勢(shì)，其中果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為3∶1 時(shí)刺梨汁的透光率最大[5]。 安玉紅等認(rèn)為這可能是由于果膠酶的質(zhì)量濃度不斷增加的同時(shí)對(duì)纖維素酶活性產(chǎn)生了抑制作用。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與安玉紅等的研究結(jié)果類似，只是本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為3∶2 時(shí)，刺梨、 蘋果混合果汁的透光率最大，可能是由于蘋果汁的加入導(dǎo)致果膠酶與纖維素酶達(dá)到另一個(gè)合適比例時(shí)才能表現(xiàn)出最優(yōu)的澄清效果。

圖2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)混合果汁澄清效果的影響Fig. 2 Effect of the ratio of pectinase and cellulase on the clarification effect of mixed juice

2.1.3 酶解溫度 酶解溫度對(duì)混合果汁澄清效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)混合果汁澄清效果的影響Fig. 3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the clarification effect of mixed juice

無(wú)論是透光率還是出汁率，都隨酶解溫度的上升，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且透光率與出汁率均在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值。 但是，隨著酶解溫度的變化，混合果汁的出汁率變化不大，在95.32%~96.31%變化，而透光率的變化范圍則相對(duì)出汁率的變化范圍更大，為93.3%~97.6%。

2.2 混合酶處理刺梨、蘋果混合果汁條件的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)酶解時(shí)間、果膠酶與纖維素酶的比例、酶解溫度進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。 混合酶處理刺梨、蘋果混合果汁條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酶解溫度、酶解時(shí)間、果膠酶與纖維素酶的比例，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test of enzymolysis temperature, enzymolysis time，and ratio of pectinase to cellulase

由極差分析可知，影響復(fù)合酶處理刺梨、蘋果混合果汁透光率的3 個(gè)因素主次順序?yàn)锳>B>C，即影響最大的是酶解溫度，其次是酶解時(shí)間，影響最小的是果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比。 復(fù)合酶澄清處理混合果汁的最優(yōu)條件為A1B1C2，即酶解溫度為35 ℃，酶解時(shí)間為1.5 h，果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為3∶2。采取此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)證此條件下處理的混合果汁的透光率為97.97%，比正交實(shí)驗(yàn)表中任一實(shí)驗(yàn)的透光率都高，達(dá)到了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶處理刺梨、蘋果混合果汁酶解工藝條件的目的。

2.3 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁品質(zhì)的影響

2.3.1 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁理化品質(zhì)的影響 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁理化品質(zhì)的影響結(jié)果見(jiàn)表4。 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的pH 和酸度并無(wú)顯著差異，乳酸菌質(zhì)量濃度較對(duì)照組有顯著下降（P<0.05），推測(cè)可能是因?yàn)閺?fù)合酶澄清處理后的混合果汁經(jīng)沉淀及過(guò)濾后喪失了部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致果汁中提供給乳酸菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，從而影響了乳酸菌的生長(zhǎng)。 實(shí)驗(yàn)組的透光率和還原糖質(zhì)量濃度較對(duì)照組分別有極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）提高，張鐸等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)果膠酶處理的山楂果漿，其還原糖質(zhì)量濃度相較未經(jīng)果膠酶處理的對(duì)照組有一定程度的增加[18]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。 這一方面可能是酶制劑處理使果肉組織中的還原糖進(jìn)一步溶出，提高了還原糖質(zhì)量濃度，另一方面，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組的乳酸菌質(zhì)量濃度少于對(duì)照組，導(dǎo)致乳酸菌對(duì)還原糖的利用降低，使得實(shí)驗(yàn)組中還原糖的質(zhì)量濃度高于對(duì)照組。

表4 復(fù)合酶處理對(duì)混合發(fā)酵果汁理化品質(zhì)的影響Table 4 Effect of compound enzyme treatment on the physical and chemical quality of mixed fermented juice

2.3.2 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁抗氧化品質(zhì)的影響 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁抗氧化品質(zhì)的影響結(jié)果見(jiàn)表5。相較對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的總酚、總黃酮質(zhì)量濃度均有所下降，但差異不顯著。 安玉紅等用殼聚糖共固定化復(fù)合酶澄清處理刺梨汁，發(fā)現(xiàn)酶解后刺梨汁較酶解前總黃酮的質(zhì)量濃度下降了7.23%，但差異不顯著[5]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。 蔣永波等用酶解-吸附聯(lián)用和酶解-絮凝聯(lián)用2 種方式澄清處理檸檬汁，經(jīng)2 種方式處理的檸檬汁相較檸檬原果汁中總酚的質(zhì)量濃度均在一定程度上有所下降，且有顯著影響，但本實(shí)驗(yàn)中澄清處理對(duì)總酚質(zhì)量濃度的影響并不顯著[19]，可能是由于蔣永波等采用的方法中，吸附或絮凝不利于總酚的穩(wěn)定。 實(shí)驗(yàn)組的類胡蘿卜素相比對(duì)照組呈極顯著下降（P<0.01）。 果蔬汁中的果膠與類胡蘿卜素之間存在某些相互作用，從而降低了類胡蘿卜素的生物可及性[20]。通過(guò)果膠酶的水解作用，可破壞果膠與類胡蘿卜素之間的相互作用，使植物細(xì)胞中的類胡蘿卜素被更多地釋放出來(lái)，提高其生物可及性[21]，而乳酸菌通過(guò)代謝則可分解類胡蘿卜素從而顯著降低類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度[22]，因此，推測(cè)是果膠酶和纖維素酶的水解作用提高了實(shí)驗(yàn)組中類胡蘿卜素的生物可及性，而乳酸菌的代謝進(jìn)一步降低了果汁中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。 實(shí)驗(yàn)組中維生素C 質(zhì)量濃度、DPPH 自由基清除率較對(duì)照組均有所增加，但差異均不顯著；但是實(shí)驗(yàn)組的超氧陰離子自由基清除率較對(duì)照組高了17.35%，且二者差異極顯著 （P<0.01），實(shí)驗(yàn)組羥自由基清除率較對(duì)照組高了14.13%，二者間差異顯著（P<0.05）。 李菀等人的研究顯示，當(dāng)利用果膠酶和纖維素酶分別提取甘草渣多糖時(shí)，隨著果膠酶或纖維素酶用量的提高，提取物的超氧陰離子自由基清除率等抗氧化性指標(biāo)也會(huì)逐漸增加[23]，這與本研究結(jié)果類似，推測(cè)是因?yàn)楣z酶或纖維素酶的作用，破壞了細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞中更多的抗氧化性物質(zhì)得以釋放。

表5 復(fù)合酶處理對(duì)混合發(fā)酵果汁抗氧化品質(zhì)的影響Table 5 Effect of compound enzyme treatment on the antioxidant quality of mixed fermented juice

2.3.3 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁感官評(píng)價(jià)的影響 復(fù)合酶處理對(duì)刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)表6。

表6 復(fù)合酶處理對(duì)混合發(fā)酵果汁感官評(píng)價(jià)的影響Table 6 Effect of compound enzyme treatment on sensory evaluation of mixed fermented juice

實(shí)驗(yàn)組在色澤、組織狀態(tài)方面所得評(píng)分均極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；在香氣和口感方面，實(shí)驗(yàn)組得分亦大于對(duì)照組，但差異不顯著；從綜合感官評(píng)價(jià)總分來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組的感官評(píng)價(jià)總分亦大于對(duì)照組，且差異極顯著（P<0.01）。 具體而言，實(shí)驗(yàn)組在色澤方面呈黃色、澄清透亮；在香氣方面可能由于酶解更利于揮發(fā)性物質(zhì)的逸出，使得試驗(yàn)組的果香味更明顯；組織狀態(tài)方面，對(duì)照組略有沉淀，而實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵果汁組織細(xì)膩、均勻一致；在口感方面，對(duì)照組相較于實(shí)驗(yàn)組有明顯粗糙及苦澀感。 綜上，果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶處理的刺梨、蘋果混合發(fā)酵果汁的感官品質(zhì)更受評(píng)價(jià)者接受或喜愛(ài)。

3 結(jié) 語(yǔ)

作者優(yōu)化了果膠酶和纖維素酶澄清處理刺梨、蘋果混合果汁的條件，得到最優(yōu)的處理?xiàng)l件為：果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為3∶2，酶解溫度35 ℃，酶解時(shí)間1.5 h，此時(shí)混合果汁的透光率可達(dá)到97.97%。 酶制劑澄清處理對(duì)混合果汁發(fā)酵后品質(zhì)的影響。 研究顯示，果膠酶和纖維素酶的澄清處理雖然導(dǎo)致混合發(fā)酵果汁的類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度顯著下降，但對(duì)pH、酸度以及總酚、總黃酮、維生素C的質(zhì)量濃度無(wú)顯著影響，還能顯著提升混合發(fā)酵果汁中還原糖的質(zhì)量濃度。 同時(shí)，混合發(fā)酵果汁的超氧陰離子自由基和羥自由基清除率分別有顯著和極顯著的提高。 因此，利用果膠酶和纖維素酶進(jìn)行澄清處理，不僅可顯著改善刺梨、蘋果混合果汁的透光率，且能在發(fā)酵后較好地維持果汁中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定性，并顯著提高發(fā)酵果汁的抗氧化性，改善發(fā)酵果汁的感官品質(zhì)。