靳素媛，耿 燕*，周 琦，呂琪琪，曹剛剛，賈友彬，李宣衡，史勁松

（1. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2. 安徽養(yǎng)生天下生物科技有限公司，安徽 亳州 236831）

酵素是一種通過微生物發(fā)酵動、植物或菌類而成的功能型發(fā)酵產品。 我國標準《酵素產品分類導則》（QB/T 5324）界定的食用植物酵素是“以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產品”[1]。 酵素起源于日本，始于20世紀初，現(xiàn)流行于日本、中國臺灣、歐洲等地，一般以乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等益生菌協(xié)同作用于果蔬、食用菌、藥食同源植物[2]。 現(xiàn)代藥理學研究表明其具有抗氧化[3]、調節(jié)免疫[4]、潤腸通便[5-6]、保健護肝[7]等功能。

果蔬和藥材經過微生物發(fā)酵后含有豐富的生物活性物質，其中多酚和黃酮這類天然的抗氧化活性物質是酵素產品發(fā)揮抗氧化作用的關鍵物質[8-9]。 眾多研究表明，酵素產品含有豐富的多酚類和黃酮類化合物。 發(fā)酵過程中經醋酸菌和乳酸菌等的代謝產生的有機酸，能夠增加發(fā)酵產品濃厚的風味和酸爽的口感，因此發(fā)酵液中的有機酸種類和相對含量是決定產品風味和品質的重要因素[10]。 微生物發(fā)酵產生的某些的抑菌成分，在抑制有害微生物防止腐敗等方面具有重要作用。 研究顯示酵素對一些常見有害微生物如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有較好的抑制作用[11-12]。 此外，研究發(fā)現(xiàn)果蔬中藥發(fā)酵液能夠降低癌癥的患病率，抑制癌細胞的生長。 吳勝蓮等和劉阿文的研究結果均表明發(fā)酵液對某些癌細胞表現(xiàn)出了較好抑制效果[13-14]。

作者對24 種酵素產品中的部分功能成分及其生物活性進行了探究，測定了酵素產品總黃酮和總多酚的質量濃度，然后利用超高效液相色譜進行檢測，確定了產品中的草酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、乙酸、丙酸6 種有機酸的質量濃度。 作者選擇常見的食源性致病菌金黃色葡萄球菌對酵素產品的抑菌活性進行了初步研究，并采用CCK-8 法測定細胞活性，通過比較酵素產品對人肝癌細胞Hep G2 生長抑制作用探究其抗腫瘤活性。 本研究結果為后續(xù)產品開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵原料：枸杞、黃精、槐花、荷葉、金銀花、蒲公英、魚腥草、玫瑰、小茴香、廣藿香、紫蘇、馬齒莧、余甘子、桑葉、紅棗、烏梅、丁香、桔梗、花椒、佛手、白扁豆、白芷、砂仁共24 種。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉：購于國藥集團化學試劑有限公司； 兒茶酚標準品：購于美國sigma 公司；蘆丁標準品：購于生工生物工程（上海）股份有限公司；無水草酸、琥珀酸（丁二酸）、DL-蘋果酸、DL-乳酸、冰乙酸、丙酸：購于上海麥克林生化科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清：購于美國Gibco Invitrogen 公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、CCK-8（Cell Counting Kit）試劑盒：購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀：Tecan 公司產品； 電子天秤、FE20 pH計：梅特勒-托利多國際有限公司產品；AQ-C18 色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×150 mm）：沃特世科技（上海）有限公司產品； 超高效液相色譜儀Nexera UHPLC LC-30A：日本島津株式會社產品；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司產品；DK-8D 三溫三控水槽：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產品；二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Fisher 公司產品。

1.3 酵素產品制備方法

將原料進行預處理 （漿果類直接進行打漿處理，根莖類等藥材按質量比1∶2 加水浸泡后打漿）后配料裝罐，每立方米發(fā)酵罐加入原料 （以干制計）120 kg，加入質量分數(shù)10%的紅糖，然后接種體積分數(shù)5%酵母菌液后密閉常溫發(fā)酵150 d，然后過濾除渣制得酵素初液；向所述蔬菜、水果酵素初液中添加質量分數(shù)10%醋酸菌液，打開密閉容器，常溫發(fā)酵50~70 d，每周攪拌1 次，至乙醇體積分數(shù)低于0.5%，然后過濾除渣制得酵素。

1.4 實驗方法

1.4.1 總黃酮質量濃度的測定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法[15]測定總黃酮質量濃度。黃酮類化合物是一類具有苯并吡喃環(huán)結構的天然化合物的總稱，能在堿性條件下與鋁離子反應生成紅色絡合物，該物質在510 nm 波長處有最大吸收。 利用硝酸鋁作為測定黃酮類化合物的顯色劑，通過在510 nm 波長處測定樣品的吸光度，與蘆丁標準品比較，對樣品中總黃酮質量濃度進行測定。 以蘆丁標準液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到的標準曲線方程為：y=1.496 2x+0.001 4，標準曲線的相關系數(shù)R2=0.999。 在96 孔板中加入200 μL 待測樣品溶液，用酶標儀在510 nm 波長處測定吸光度，每組樣品做3 次平行，然后根據(jù)蘆丁標準曲線得出酵素樣品中總黃酮的質量濃度（mg/mL）。

1.4.2 總多酚質量濃度的測定 采用酒石酸亞鐵法[16]測定總多酚質量濃度。 多酚是一類結構中帶有多個酚羥基的化合物的總稱，能與酒石酸亞鐵產生絡合反應，生成穩(wěn)定的深紫色絡合物，該物質在540 nm 波長處有最大吸收。 通過在540 nm 波長處測定樣品的吸光度，并與兒茶酚標準品比較，對樣品中總多酚質量濃度進行定量測定。 以兒茶酚標準液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，通過測定得到的標準曲線方程為：y=0.196 6x+0.007 3，標準曲線的相關系數(shù)R2=0.997。 每組樣品做3 次平行，根據(jù)兒茶酚標準曲線計算出樣品中總多酚的質量濃度（mg/mL）。

1.4.3 有機酸質量濃度的測定 取酵素樣品1.5 mL，經0.22 μm 濾膜過濾處理后，裝入標記好的進樣瓶備用。 色譜分離柱：沃特世公司AQ-C18 色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相A：乙腈；流動相B：20 mmol/L pH 2.2 的磷酸鹽緩沖液；柱溫：40 ℃；流量0.5 mL/min； 進樣量為10 μL； 檢測波長：210 nm。 根據(jù)相應標準品標準曲線計算有機酸的質量濃度（mg/mL）。

1.4.4 體外抑菌活性分析 取酵素樣品，經無菌0.22 μm 微孔濾膜過濾處理后，裝入標記好的滅菌管中，按5%的接種體積分數(shù)將金黃色葡萄球菌液接種于酵素樣品中，每個樣品設置3 組平行實驗作為實驗組；按同樣比例將金黃色葡萄球菌液接種于LB 培養(yǎng)基中作為對照組。 37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別測定實驗組和對照組的0 h 和24 h 的OD600，以對照組的抑制率為0，通過計算對比實驗組對金黃色葡萄球菌的生長的抑制率，對不同藥材果蔬發(fā)酵產品的抑菌活性做出初步評價。

1.4.5 體外抗腫瘤活性分析 采用CCK-8 法檢測細胞存活率[17]。 用胰酶消化貼壁生長的人肝癌細胞（Hep G2），細胞計數(shù)調整其濃度為5×104個/mL 的細胞懸液。 取96 孔板，每孔加入100 μL 細胞懸液，即按5 000 個細胞/孔鋪板，邊緣孔用無菌DPBS 填充，然后置于含體積分數(shù)5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞鋪板培養(yǎng)12 h 后，棄去細胞培養(yǎng)液，空白組加入200 μL 細胞培養(yǎng)液，實驗組加入200 μL 按照1∶1 000 比例稀釋的含藥（酵素樣品）培養(yǎng)液，每組設6 個副孔。 加藥培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在避光條件下將孔板置于含體積分數(shù)5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Graph Pad Prism 軟件進行單因素方差分析（ANOVA） 和Duncan’s 多重比較差異顯著性檢驗，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（Mean±SD），*P<0.05為具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 總多酚和總黃酮的質量濃度測定

如圖1，總黃酮質量濃度較高的幾種酵素產品是：枸杞酵素、丁香酵素、花椒酵素、金銀花酵素、蒲公英酵素、余甘子酵素，其中枸杞酵素的總黃酮質量濃度最高，相當于4.28 mg/mL 的蘆丁標準液。 玫瑰酵素和丁香酵素的總多酚質量濃度顯著高于其他酵素產品的質量濃度，以兒茶酚作為標準對照品，二者的總多酚質量濃度均大于5 mg/mL，其他酵素均小于1 mg/mL，見圖2。

圖1 24 種酵素的總黃酮質量濃度Fig. 1 Total flavonoid content of 24 fermented juice

圖2 24 種酵素的總多酚質量濃度Fig. 2 Total polyphenol content of 24 fermented juice

圖3 不同酵素產品的總酸質量濃度Fig. 3 Total acid content of 24 different fermented juice

人體與外界接觸的過程中，環(huán)境污染、射線照射、不良的生活習慣等因素等都會導致體內產生的自由基增加。 研究表明，過量的活性自由基會使機體的抗氧化平衡體系被破壞，這種氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡被稱為氧化應激[18]。 活性自由基會損傷生物活性分子，導致機體的正常生理生化反應受到干擾。 此外，氧化應激是人類慢性疾病，如糖尿病、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病和癌癥等形成和發(fā)展的關鍵因素[19]。 膳食來源的抗氧化化合物對人體具有重要意義，因為它們可以中和或消除活性自由基，避免自由基積累而產生的不良影響。 酵素產品中多酚類和黃酮類化合物的還原能力是發(fā)酵產品發(fā)揮抗氧化作用的關鍵物質，其含量的高低與發(fā)酵產品的抗氧化活性強弱有一定關系[20]。 枸杞酵素、玫瑰酵素、丁香酵素等產品含有較多的多酚黃酮類物質，具有抗氧化活性，可以清除自由基，有助于減少氧化應激，為抗衰老保健品和護膚品的研發(fā)提供新的思路。

2.2 有機酸質量濃度的測定

利用精密pH 計測定酵素產品的酸堿度，然后采用超高效液相色譜檢測了24 酵素產品中草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、蘋果酸和丙酸的質量濃度。 實驗結果表明，酵素產品呈酸性，pH 值均在2.8~3.4。6種酸中余甘子酵素所含的總酸質量濃度最高。 從有機酸的組成和質量濃度方面來看，幾乎所有酵素產品都含有草酸、乳酸、乙酸和丙酸，且乳酸和乙酸的質量濃度相對較多，2 種酸在總酸中的占比與酵素種類有關，例如紅棗酵素中的乳酸質量濃度占被檢測的總酸質量濃度的90.98%，黃精酵素中的乙酸質量濃度占被檢測的總酸質量濃度的79.48%；草酸和丙酸的質量濃度相對較少，但其中玫瑰酵素中丙酸質量濃度高達70.83 mg/mL，明顯高于其他酵素產品；僅有少數(shù)酵素產品未檢出蘋果酸，但是產品所含的蘋果酸質量濃度不高，在被檢測的總酸質量濃度中的占比均小于15%；大多數(shù)酵素產品中都未檢出或者不含有琥珀酸，能檢出的琥珀酸質量濃度極微，琥珀酸質量濃度最高的酵素是花椒酵素，質量濃度為3.83 mg/mL。

紫蘇酵素和薄荷酵素相較于其他產品所含的草酸較多，而草酸被人體攝入后不易被氧化分解，過量攝入草酸不但會影響鈣和鋅的吸收，甚至會造成結石嚴重影響人體健康[21]。 對于人體來說從外界攝入適量的乳酸能夠刺激胃液分泌，促進腸道蠕動，避免體內毒素堆積，抑制有害菌生長[22]。 蘋果酸能夠參與人體新陳代謝和能量轉化[23]，可以促進營養(yǎng)物質在人體內吸收與代謝[24]。包括乙酸、丙酸在內的短鏈脂肪酸，在人體腸黏膜屏障的維持、腸道動力的調節(jié)及免疫調節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用，對腸道疾病的預防與治療有十分重要的研究價值[25]。在口感和風味方面，乳酸的酸味溫和適中，柔和爽快，可以增強酸味和清爽口感[26]；琥珀酸的鈉鹽是一種良好調味劑，具有鮮香的風味[27]；乙酸是一種揮發(fā)性的弱酸；丙酸帶有刺激性的氣味。 其中乙酸作為揮發(fā)性酸是產生醇厚感的主要物質，而以琥珀酸為主的非揮發(fā)性酸是產生回味的主要物質[28]，只有在一定量的各種酸的共同作用下才能產生酸甜爽口，回味醇厚的口感[29]。 實驗結果表明，24 種酵素含有多種有機酸，適量攝入此類產品有助于人體代謝的正常運行，對維持腸道菌群的平衡具有重要意義。

2.3 體外抑菌活性分析

由于微生物發(fā)酵產品含有一定的抑菌成分，所以本身具有抑菌活性，能夠抑制腸道內有害微生物的生長，同時促進益生菌生長和繁殖，維持腸道菌群的平衡[30]。 金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病菌，是典型的革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中。 金黃色葡萄球菌在一定條件下會產生腸毒素，而腸毒素在體內的積累則會引起食物中毒[31]。我國國標規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌含量的限量標準，其合格與否是食品安全檢測的一項重要指標，因此選擇金黃色葡萄球菌對酵素產品的抑菌活性進行初步研究。

由圖4 可知，24 種酵素產品對金黃色葡萄球菌生長有顯著的抑制作用，但不能完全抑制其生長。經過24 h 培養(yǎng)后，以對照組的抑制率為0，各樣品對金黃色葡萄球菌的抑制率在85.0%~97.0%，其中黃精酵素和白扁豆酵素對金黃色葡萄球菌生長抑制作用最大，抑制率分別為94.5%和96.3%，而余甘子酵素對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用最小，其抑制率僅為80.0%。 酵素產品對金黃色葡萄球菌生長的良好抑制作用，能夠為新型防腐劑的研發(fā)開辟新途徑，對于延長發(fā)酵產品的保質期也具有一定指導意義。

圖4 24 種酵素產品對金黃色葡萄球菌的生長抑制情況Fig. 4 Growth inhibition rate of 24 different fermented juice to Staphylococcus aureus

2.4 體外抗腫瘤活性分析

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的有關癌癥的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，癌癥是世界第二大死亡疾病。 癌癥的發(fā)生與發(fā)展與多種因素有關。 近年來的研究表明，水果、蔬菜及中藥發(fā)酵液可以在一定程度上降低癌癥的發(fā)病率，提高機體免疫調節(jié)功能，從而顯著提高抗腫瘤作用，具有良好的應用前景[32]。

考慮到酵素樣品具體濃度難以確定和統(tǒng)一，作者采用不含藥的DMEM 培養(yǎng)基稀釋1 000 倍后對Hep G2 細胞進行處理。 由圖5 可以看出，在所有實驗組中，人肝癌細胞的細胞存活率均低于對照組，說明這24 中藥材果蔬發(fā)酵產品對人肝癌細胞的生長具有一定的抑制作用。 除了黃精酵素、烏梅酵素和紅棗酵素對人肝癌細胞的生長影響較小之外，其他21 種酵素產品與對照組之間都存在顯著差異，其中沙棘酵素、槐花酵素、丁香酵素、廣藿香酵素和桔梗酵素對人肝癌細胞的生長抑制作用最明顯，細胞存活率均低于80%。 在發(fā)酵過程中，微生物可以分解和轉化原料中蛋白質、糖類等成分，生成一些水溶性的小分子活性物質，同時植物的細胞壁被破壞，使細胞里水溶性成分溶解出來，從而產生相應的藥理作用。 抗癌作用的發(fā)揮可能依賴于酵素產品多種物質成分的共同作用，具體作用機理還有待深入研究。

圖5 24 種酵素的抗腫瘤活性評價Fig. 5 Anti-tumor activity of 24 different fermented juice

3 結 語

實驗結果表明，在24 種酵素產品中含有生物活性物質種類眾多，成分復雜，除了含有黃酮類化合物和多酚類化合物，還含有多種有機酸類。 這些活性成分的種類和含量與酵素產品的功效密切相關。 枸杞酵素和玫瑰酵素分別是總黃酮和總多酚質量分數(shù)最高的酵素產品。 不同酵素產品所含的有機酸種類大致相同，但不同有機酸的質量分數(shù)差異比較大，余甘子酵素的質量分數(shù)是24 種酵素產品中最高的。 由于發(fā)酵起始原料的物質成分和質量分數(shù)不同，所得酵素產品在生物活性物質質量分數(shù)和種類上也存在不少區(qū)別。 這24 種酵素產品對金黃色葡萄球菌生長均有顯著的抑制作用，其中黃精酵素和白扁豆酵素對金黃色葡萄球菌生長抑制作用的最大，抑制率分別為94.5%和96.3%。 體外抗腫瘤活性評價結果顯示，沙棘酵素、槐花酵素、丁香酵素、廣藿香酵素和桔梗酵素這5 種酵素產品對人肝癌細胞的生長影響較大，其抑制率高于20.0%。本研究結果為新型功能性酵素產品的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)，能夠為抗衰老和抗癌保健品的研發(fā)提供新思路。