吳育龍,莊見(jiàn)齊,劉志成,馬俠檳

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。全球有超過(guò)4億HBV感染者,每年近100萬(wàn)患者死于HBV感染導(dǎo)致的肝衰竭、肝硬化和肝癌[1]。核苷(酸)類(lèi)似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]是臨床治療CHB患者最常用的抗病毒藥物,經(jīng)持續(xù)治療后,血清肝功能正常,HBV DNA陰轉(zhuǎn),肝組織炎癥和纖維化等均可得到有效控制[2,3]。盡管NAs是多數(shù)患者抗病毒治療的主要選擇,但由于多方面因素的影響,也存在完全應(yīng)答率不理想和停藥后復(fù)發(fā)的問(wèn)題[4]。因此,如何早期精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)NAs抗病毒治療的療效是目前研究的重點(diǎn)課題。血清HBsAg轉(zhuǎn)陰是目前公認(rèn)的抗HBV治療的理想目標(biāo),但大量研究數(shù)據(jù)表明應(yīng)用現(xiàn)行的抗病毒藥物治療1年,僅有不到3%CHB患者血清HBsAg轉(zhuǎn)陰,絕大多數(shù)患者難以獲得停藥的目標(biāo)[5]。研究[6,7]發(fā)現(xiàn),HBV前基因組核糖核酸(HBV pregenomic ribonucleic acid,HBVpgRNA)是HBV復(fù)制的中間產(chǎn)物,與影響抗病毒治療療效、導(dǎo)致停藥后復(fù)發(fā)的肝細(xì)胞內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸(covalently closed circular deoxyribonucleic acid,cccDNA)轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān),可反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)?；谏鲜霰尘?本研究主要比較了接受NAs抗病毒治療后不同應(yīng)答和停藥后是否復(fù)發(fā)的CHB患者血清HBV pgRNA等相關(guān)指標(biāo)的變化差異,以探討HBV pgRNA水平與NAs抗病毒治療療效和停藥后病情復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019年9月～2021年9月我院收治的CHB患者78例,男性56例,女性22例;年齡為19～62歲,平均年齡為(34.9±15.8)歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[8]的標(biāo)準(zhǔn)。納入患者均為初始治療者。排除合并原發(fā)性肝癌、其他嗜肝病毒感染、酒精或非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病等其他肝病、艾滋病、妊娠或哺乳期婦女、重要器官疾病者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療與隨訪 依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》給予所有患者NAs抗病毒治療。隨訪截止時(shí)間為2022年10月1日。

1.3 療效評(píng)估 同時(shí)出現(xiàn)病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答者為完全應(yīng)答,其中,病毒學(xué)應(yīng)答為血清HBV DNA載量較基線下降≥2 lg IU/mL或<500 IU/mL;生化學(xué)應(yīng)答為血清ALT水平降至40 U/L以下水平。

1.4 血清檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)血清HBV DNA和HBV pgRNA水平。清晨采集空腹外周靜脈血5 mL,3000r/m離心10 min,分離血清。應(yīng)用核酸提取純化試劑(廣州海力特生物科技有限公司)采用磁珠法提取血清總RNA,檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度,應(yīng)用cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Science,Waltham)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用Lightcler 2.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏公司)和HBV核苷酸定量檢測(cè)配套試劑盒(上海復(fù)興長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)檢測(cè)血清HBV DNA水平;使用宏石SLAN96P熒光定量PCR儀和HBV pgRNA定量檢測(cè)試劑盒(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)檢測(cè)血清HBV pgRNA水平;使用日本日立公司生產(chǎn)的HITACHI 7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo);采用ELISA法檢測(cè)血清HBsAg水平(美國(guó)Bio-TEK公司生產(chǎn)的ELX800全自動(dòng)酶聯(lián)儀和廈門(mén)英科新創(chuàng)科技有限公司試劑)。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者經(jīng)NAs抗病毒治療后的療效情況 78例CHB患者均接受NAs抗病毒治療,在48周末,獲得病毒學(xué)應(yīng)答75例(96.2%),生化學(xué)應(yīng)答70例(89.7%),獲得完全應(yīng)答66例(84.6%)。

2.2 完全應(yīng)答與未完全應(yīng)答患者有關(guān)指標(biāo)比較 入組時(shí),完全應(yīng)答患者血清HBV DNA載量、HBsAg和HBV pgRNA水平顯著低于未完全應(yīng)答患者(P<0.05,表1)。

表1 兩組有關(guān)指標(biāo)比較

2.3 影響抗病毒治療CHB患者療效的風(fēng)險(xiǎn)Cox回歸分析 將治療不應(yīng)答作為因變量(1=不應(yīng)答發(fā),0=應(yīng)答),經(jīng)Cox回歸分析顯示,入組時(shí)血清HBsAg和HBV pgRNA水平為影響抗病毒治療的CHB患者療效的因素(P<0.05,表2)。

表2 影響抗病毒治療CHB患者療效的Cox回歸分析

2.4 血清HBV pgRNA預(yù)測(cè)NAs抗病毒治療CHB患者療效的ROC曲線分析 經(jīng)ROC分析顯示,血清HBV pgRNA預(yù)測(cè)NAs治療CHB患者完全應(yīng)答的最佳截?cái)帱c(diǎn)為4.8 lg copies/mL,其AUC值為0.825(95%CI:0.722～0.902),預(yù)測(cè)的靈敏度為89.4%,特異度為83.3%(圖1)。

圖1 血清 HBV pgRNA預(yù)測(cè)NAs抗病毒治療CHB患者完全應(yīng)答的ROC分析

3 討論

最大限度地長(zhǎng)期抑制或消除HBV感染是臨床治療CHB患者的主要目標(biāo)。NAs作為臨床抗HBV治療的主要藥物,具有抑制HBV復(fù)制、減輕肝細(xì)胞炎性、延緩肝纖維化發(fā)生和進(jìn)展等作用[9]。在本研究,78例CHB患者經(jīng)NAs抗病毒治療48周,完全應(yīng)答率為84.6%,與既往研究[10]結(jié)果相近,進(jìn)一步證實(shí)NAs抗病毒治療對(duì)CHB患者具有較好的臨床療效。目前,國(guó)內(nèi)外各指南主要依據(jù)血清HBV DNA載量、HBsAg和HBeAg水平對(duì)NAs抗病毒治療療效進(jìn)行評(píng)估,并制定了治療終點(diǎn),但臨床實(shí)踐證明,超過(guò)1/3患者在達(dá)到指南治療終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)后停藥的半年時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生病毒學(xué)反彈,相關(guān)治療終點(diǎn)指標(biāo)的應(yīng)用存在局限性[11,12]。因此,尋求更為有效的生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)NAs抗病毒治療的療效,對(duì)優(yōu)化治療方案,改善患者預(yù)后意義重大。

HBV cccDNA是反映HBV復(fù)制狀態(tài)的指標(biāo),其半衰期長(zhǎng)、不易降解,是HBV持續(xù)復(fù)制的重要因素[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn),HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄生成的HBV pgRNA參與了病毒核心顆粒反轉(zhuǎn)錄為子代DNA負(fù)鏈的過(guò)程,不僅可反映HBV cccDNA水平和轉(zhuǎn)錄活性,還能指導(dǎo)CHB患者抗病毒治療前和治療過(guò)程中對(duì)療效的判斷。本研究發(fā)現(xiàn),入組時(shí),完全應(yīng)答患者血清HBV DNA載量、HBsAg和HBV pgRNA水平顯著低于未完全應(yīng)答患者,提示NAs抗病毒治療前較低水平的血清HBsAg及HBV DNA和HBV pgRNA載量患者可能在接受NAs抗病毒治療后獲得較好的應(yīng)答率。有研究也發(fā)現(xiàn),接受NAs抗病毒治療后,應(yīng)答患者血清HBV DNA載量、HBsAg和HBV pgRNA水平與不應(yīng)答患者存在顯著性差異,且不同NAs治療CHB患者應(yīng)答率相當(dāng),認(rèn)為血清HBV pgRNA水平下降能較敏感地反映NAs抗病毒治療的療效[15]。既往研究[16]發(fā)現(xiàn),血清HBsAg的來(lái)源不僅是HBV cccDNA,整合到人類(lèi)基因組中的HBV DNA片段也可以產(chǎn)生HBsAg,導(dǎo)致血清HBsAg水平不穩(wěn)定,不能正確地反映NAs抗病毒治療的效果。血清HBV pgRNA僅來(lái)源于HBV cccDNA,以衣殼化病毒顆粒的形式存在于血清中,因此在反映治療窗內(nèi)的病毒學(xué)應(yīng)答方面,效果優(yōu)于血清HBsAg[17]。本研究經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示,當(dāng)血清HBV pgRNA最佳截?cái)帱c(diǎn)為4.8 lg copies/mL時(shí),其預(yù)測(cè)NAs抗病毒治療CHB患者完全應(yīng)答的靈敏度和特異度分別為89.4%和83.3%,進(jìn)一步表明血清HBV pgRNA在預(yù)測(cè)NAs抗病毒治療CHB患者臨床療效方面,具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)指南均明確指出應(yīng)用NAs治療CHB患者的適應(yīng)證和停用標(biāo)準(zhǔn),但部分達(dá)到停藥標(biāo)準(zhǔn)的患者仍存在一定的病情復(fù)發(fā)的可能。一項(xiàng)有關(guān)[18]CHB患者停用NAs抗病毒藥物后病情復(fù)發(fā)的回顧性研究發(fā)現(xiàn),患者停藥后持續(xù)病毒學(xué)抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,停藥后12個(gè)月病情復(fù)發(fā)率為32.5%。有關(guān)NAs停用后引發(fā)的不同臨床結(jié)局已成為臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。NAs治療CHB患者需要長(zhǎng)期治療,短期內(nèi)不能停藥,也找不到可以預(yù)測(cè)停藥后病情不復(fù)發(fā)的指標(biāo)。Cox回歸分析顯示,入組時(shí)血清HBsAg和HBV pgRNA水平為CHB患者接受抗病毒治療后影響應(yīng)答的因素。血清HBV pgRNA水平來(lái)源的單一性使得HBV pgRNA具備代替HBsAg能反映肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA載量和HBV活躍程度的準(zhǔn)確率更高,而血清HBV pgRNA載量持續(xù)低于檢測(cè)下限提示HBV cccDNA可能處于轉(zhuǎn)錄靜默狀態(tài)或被潛在清除,患者獲得病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答的概率較高[19,20]。在本研究,血清HBV DNA、ALT等指標(biāo)不是影響CHB患者抗病毒治療應(yīng)答的影響因素,與既往研究[21]結(jié)論存在某些差異,考慮與納入患者樣本量、地域、病情和納入標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

綜上所述,檢測(cè)血清HBV pgRNA水平預(yù)測(cè)CHB患者應(yīng)用NAs抗病毒治療后的療效具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值,其水平高低可作為選擇CHB患者抗病毒治療的納入條件。但HBV pgRNA本身的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律還不清楚,檢測(cè)血清HBV pgRNA載量的方法還初步應(yīng)用于臨床,其準(zhǔn)確性還有待于證實(shí)。