馮冬霞,奚 晶,楊振斌,劉亞芹,胡茜瑩

乙型肝炎肝硬化患者營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)較差,免疫力低下,極易出現(xiàn)各種感染。自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是失代償期肝硬化患者最易發(fā)生的腹腔感染,是指病原微生物侵入腹腔,造成明顯損傷的感染,可迅速發(fā)展為肝腎功能衰竭,導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化,是肝硬化等終末期肝病患者死亡的主要原因之一[1,2]。有報(bào)道顯示,炎癥介質(zhì)參與了SBP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體主要由NLRP3和半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)組成,可參與促炎因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)的成熟和釋放過(guò)程[3,4]。相關(guān)研究指出,機(jī)體NLRP3炎性小體活化可導(dǎo)致白細(xì)胞介素大量釋放,激活Caspase-1凋亡通路,引起炎癥反應(yīng)的放大[5]。本研究旨在探究乙型肝炎肝硬化并發(fā)SBP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)NLRP3和Caspase-1水平變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 2018年1月～2020年5月我院診治的乙型肝炎肝硬化并發(fā)SBP患者65例,男42例,女23例;年齡為41～73歲,平均年齡為(53.5±3.1)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],SBP符合《肝硬化腹水及相關(guān)并發(fā)癥的診療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7,8]:(1)有以下癥狀或體征之一:①急性腹膜炎的表現(xiàn):出現(xiàn)嘔吐、腹瀉,腹部壓痛或反跳痛,腹肌張力增高;②全身炎癥反應(yīng)綜合征的表現(xiàn):發(fā)熱或體溫不升、寒戰(zhàn)、心動(dòng)過(guò)速等;③無(wú)誘因肝功能指標(biāo)惡化;④肝性腦病;⑤休克;⑥頑固性腹水或腎功能衰竭;⑦急性胃腸道出血。(2)有以下實(shí)驗(yàn)室檢查異常之一:①腹水多形核白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥0.25×109/L;②腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性;③血清降鈣素原(procalcitonin,PCT)>0.5 ng/mL。根據(jù)嚴(yán)重程度將SBP分為輕癥組和重癥組。滿足以下任何2項(xiàng)者,診斷為SBP重癥感染:①體溫>39℃;②感染性休克;③急性呼吸窘迫綜合征;④不明原因的急性腎損傷3期;⑤外周血白細(xì)胞>10.0×109/L ;⑥血清降鈣素原>2 ng/mL。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他臟器器質(zhì)性疾病;(2)肝細(xì)胞癌;(3)其他病因?qū)е碌母斡不?(4)合并自身免疫性疾病、酒精性肝病或藥物性肝損傷;(5)合并消化道出血。本研究符合《赫爾辛基宣言》及其附錄準(zhǔn)則。

1.2 PBMCs NLRP3和Caspase-1水平檢測(cè) 入院24 h內(nèi)采集空腹靜脈血3 ml,置于EDTA抗凝管中靜置,以1:1將人外周血與淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司)混合,使用LB-5000型醫(yī)用離心機(jī)(上海趙迪生物科技有限公司)3000 r/m離心10 min,分離PBMCs。再將Trizol加入裝有PBMCs的試管,保存于-80℃、備用。應(yīng)用大連寶生物有限公司提供的mRNA提取試劑盒提取PBMCs 總RNA,使用康為世紀(jì)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,qPCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)和合成(表1)。使用大連寶生物有限公司熒光定量試劑盒建立反應(yīng)體系,使用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technoligies Holdings Pte Ltd)檢測(cè)PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平。

表1 引物序列

1.3 血清IL-1β和IL-18水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清IL-1β和IL-18水平(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 輕癥與重癥組PBMCs NLRP3和Caspase-1及血清白介素水平比較 重癥組PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于輕癥組(P<0.05,表2)。

表2 兩組PBMCs NLRP3和Caspase-1及血清白介素水平比較

2.2 各指標(biāo)評(píng)估病情嚴(yán)重程度的價(jià)值 PBMCs NLRP3聯(lián)合Caspase-1水平評(píng)估SBP患者病情嚴(yán)重的AUC顯著大于各指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(cè)(P<0.05,表3、圖1)。

圖1 各指標(biāo)評(píng)估病情嚴(yán)重程度的ROC曲線

表3 各指標(biāo)評(píng)估病情嚴(yán)重程度的價(jià)值

2.3 死亡組與生存組PBMCs NLRP3和Caspase-1及血清白介素水平比較 死亡組NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于生存組(P<0.05,表4)。

表4 死亡組與生存組NLRP3和Caspase-1及白介素水平比較

2.4 PBMCsNLRP3和Caspase-1及血清白介素水平預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值 應(yīng)用PBMCs NLRP3聯(lián)合Caspase-1水平預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC顯著大于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05,表5、圖2)。

圖2 各指標(biāo)預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線

表5 各指標(biāo)預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值

3 討論

SBP是指在肝病伴有腹水的基礎(chǔ)上,無(wú)腹腔內(nèi)感染灶和臟器破損,也無(wú)其他直接污染途徑存在時(shí)發(fā)生的腹膜細(xì)菌感染。在肝硬化腹水患者較常見(jiàn),也發(fā)生于急性肝衰竭或腎病綜合征的[9,10]。肝硬化腹水患者因長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良及免疫功能低下,單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和中性粒細(xì)胞系統(tǒng)功能減弱、肝功能受損導(dǎo)致抗感染能力下降,易并發(fā)SBP[11]。近年來(lái),炎癥小體及下游炎性因子在肝炎等肝臟疾病發(fā)病過(guò)程中的作用受到廣泛關(guān)注。炎癥小體是NLRP及其形成的多蛋白水解復(fù)合物,在多種疾病發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[12,13]。NLRP3炎性小體屬于NLRs家族,是一種由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和Caspase-1組成的蛋白復(fù)合體。NLRP3可通過(guò)刺激細(xì)胞表面Toll受體或激活凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白方式,促進(jìn)NLRP3炎性小體形成,進(jìn)而促使NLRP3和Caspase-1 mRNA水平上調(diào)。IL-18和IL-1β是NLRP3炎性小體分泌的炎性因子,IL-18可促進(jìn)肥大細(xì)胞等分泌Th2細(xì)胞因子,以增強(qiáng)免疫應(yīng)答;IL-1β可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞聚集,維持相關(guān)細(xì)胞因子水平[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn),重癥SBP組PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于輕癥組,提示PBMCs NLRP3和Caspase-1水平與SBP嚴(yán)重程度有關(guān),主要是因?yàn)榧?xì)菌感染可激活NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子,加重肝臟炎癥反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染時(shí),炎癥小體可作用于關(guān)鍵的調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄因子,激活炎性介質(zhì),加重局部炎癥反應(yīng),促進(jìn)肝臟病變進(jìn)展。另外,本研究結(jié)果顯示,應(yīng)用NLRP3和Caspase-1水平聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估病情嚴(yán)重程度的AUC為0.899,提示聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乙型肝炎肝硬化并發(fā)SBP患者病情嚴(yán)重程度具有評(píng)估價(jià)值。

SBP是肝硬化腹水患者的一種常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥,多見(jiàn)于晚期肝硬化和其它一些重癥肝炎患者,是終末期肝病患者的重要死亡原因之一[16]。隨著對(duì)SBP早期診斷和治療水平的提高,其病死率有所下降,但整體病死率仍處于較高水平。相關(guān)研究指出,SBP患者肝臟炎癥狀態(tài)與預(yù)后相關(guān)[17,18]。NLRP3可影響體內(nèi)炎癥信號(hào)通路激活,促進(jìn)IL-18等炎癥介質(zhì)釋放,導(dǎo)致肝臟間質(zhì)細(xì)胞纖維化改變[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn),死亡組PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于生存組,提示它們可能與患者預(yù)后有關(guān)。NLRP3和Caspase-1異常水平可導(dǎo)致肝臟上皮細(xì)胞線粒體損傷和線粒體膜完整性破壞,并可促進(jìn)局部炎性介質(zhì)釋放,加劇炎性細(xì)胞對(duì)肝臟上皮組織的損害,而進(jìn)一步促進(jìn)肝臟上皮細(xì)胞凋亡和壞死[21,22]。抑制機(jī)體NLRP3和Caspase-1水平上調(diào),減輕局部炎性介質(zhì)對(duì)肝臟組織的損傷,或可起到延長(zhǎng)患者生存期和改善預(yù)后的作用。本研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用PBMCs NLRP3和Caspase-1水平聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC為0.916,表明聯(lián)合檢測(cè)對(duì)并發(fā)SBP患者預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值,提示或可將它們的監(jiān)測(cè)應(yīng)用于預(yù)測(cè)乙型肝炎肝硬化并發(fā)SBP患者的預(yù)后。

綜上所述,乙型肝炎肝硬化并發(fā)SBP患者存在PBMCs NLRP3和Caspase-1水平升高現(xiàn)象,且聯(lián)合檢測(cè)對(duì)患者預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值。