郭雨軒，陳 騁*，師希雄，郭兆斌，馬國(guó)源，張玉斌，張 麗，余群力

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牛肉的嫩度作為評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的適口性指標(biāo)，是決定消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)意向的重要因素[1]，而宰后冷藏過(guò)程中糖酵解對(duì)嫩度的改善發(fā)揮著重要作用。動(dòng)物屠宰放血后，肌肉細(xì)胞能量代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧糖酵解，后者引起肌肉內(nèi)環(huán)境酸化進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白變性、降解以及細(xì)胞凋亡，這些變化最終破壞肌肉結(jié)構(gòu)，從而改善嫩度[2]。近年來(lái)，大量學(xué)者從飼喂管理、屠宰工藝以及宰后冷藏等方面對(duì)影響糖酵解反應(yīng)的因素進(jìn)行調(diào)控和干預(yù)，以改善肉的嫩度及相關(guān)品質(zhì)。例如，在飼料中增加直鏈淀粉含量可影響糖酵解底物濃度和關(guān)鍵酶活性，間接調(diào)節(jié)pH值變化速率，從而減少豬肉的滴水損失和蒸煮損失[3]。屠宰后利用低壓電刺激促進(jìn)糖酵解反應(yīng)，能夠加速pH值下降、激活鈣蛋白酶，有效促進(jìn)牛肉的宰后嫩化進(jìn)程[4]。此外，有研究指出宰后冷藏初期調(diào)控牛肉蛋白質(zhì)翻譯后修飾（乙?；?、磷酸化）水平能夠改變糖酵解速率而影響肉的嫩度[5]。由此可見(jiàn)，宰后動(dòng)物糖酵解水平直接影響肉的嫩度，而糖酵解反應(yīng)受到眾多因素影響，且具體影響機(jī)制尚不完全清楚。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為分子氧還原過(guò)程的產(chǎn)物，在宰后動(dòng)物肌肉細(xì)胞中大量積累，并參與包括糖酵解在內(nèi)的多種生化反應(yīng)調(diào)控[6]。近期研究指出，ROS可能通過(guò)以下途徑參與宰后動(dòng)物肌肉糖酵解反應(yīng)的調(diào)控：一是引起細(xì)胞基質(zhì)中Ca2＋釋放，后者通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路提升糖酵解水平[7]；二是通過(guò)激活低氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路間接誘導(dǎo)糖酵解限速酶活化，加速宰后初期糖原向乳酸的轉(zhuǎn)變[8]。此外，有研究指出癌細(xì)胞中的ROS可以通過(guò)調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3的表達(dá)提升糖酵解底物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，以此提高糖酵解能力[9]。糖酵解是由10 種酶催化的復(fù)雜反應(yīng)過(guò)程，該過(guò)程可能為ROS提供了多個(gè)調(diào)控位點(diǎn)。因此，有必要深入研究ROS影響牛肉糖酵解進(jìn)程的具體機(jī)制及其靶點(diǎn)蛋白質(zhì)。

一項(xiàng)研究通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)肌肉細(xì)胞中與糖酵解相關(guān)的酶可作為肌肉關(guān)鍵品質(zhì)的生物標(biāo)志物[10]。例如，張?zhí)m等[11]利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出磷酸甘油激酶、己糖激酶等7 種蛋白是調(diào)節(jié)牦牛低氧適應(yīng)性的關(guān)鍵表達(dá)因子，為低氧適應(yīng)性的研究提供了一定理論基礎(chǔ)。Gao Xiaoguang等[12]利用組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)參與糖酵解的丙酮酸激酶和腺苷酸激酶同工酶1可作為肉色的生物標(biāo)志物，為肉類(lèi)變色提供了預(yù)測(cè)因子。但是，ROS是否能夠引起宰后牛肉糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)水平及嫩度的差異尚未得到證實(shí)。

因此，本研究選取牛胴體背最長(zhǎng)肌，分別采用ROS激活劑過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和生理鹽水處理新鮮肉樣，探究宰后不同冷藏時(shí)間（0.5、6、12、24、48 h）ROS對(duì)牛肉糖酵解代謝水平和嫩度的影響，并利用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)宰后冷藏24 h的H2O2處理組和對(duì)照組樣品的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定與定量分析，篩選出糖酵解通路中的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而明確ROS調(diào)控糖酵解通路的機(jī)制及其在牛肉嫩化過(guò)程中的作用，以期進(jìn)一步完善肉品質(zhì)形成和調(diào)控理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉樣采于甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，選取健康無(wú)病、體質(zhì)量（500±50）kg、飼養(yǎng)條件相同且平均年齡3 歲的安格斯雜交公牛6 頭。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、尿素、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM） 美國(guó)Sigma公司；TMT試劑盒上海晶萊生物技術(shù)有限公司；H2O2、NAC 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（100 U/mg） 美國(guó)Promega公司；糖原、乳酸檢測(cè)試劑盒 上海梵態(tài)生物科技有限公司；甲酸、磷酸二氫鉀、氯化鉀 無(wú)錫市晶科化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive System質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1000超高效液相色譜儀、C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國(guó)賽默飛世爾科技公司；MK-40A離心機(jī) 湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RH-N50肉品嫩度測(cè)定儀 廣州潤(rùn)湖儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與處理

肉牛擊暈后以頸部三管齊斷方式屠宰，并于45 min內(nèi)取右側(cè)胴體背最長(zhǎng)肌，剔除筋膜，每個(gè)背最長(zhǎng)肌分別切取5 份質(zhì)量約為100 g的肉塊（6 cm×6 cm×3 cm）。將所有肉塊（30 塊）隨機(jī)分為H2O2處理組、NAC處理組和對(duì)照組，每組10 塊肉樣。各組肉樣分別用注射器按照肉樣質(zhì)量與注射體積比為5∶1的比例均勻注射20 mmol/L H2O2溶液、20 mmol/L NAC溶液和0.9 g/100 mL生理鹽水。每塊肉樣分多次注射，針頭扎入深度約1.5 cm（肉樣厚度一半）、注射距離間隔2 cm，注射后在注射部位緩慢揉壓30 s，使其充分均勻擴(kuò)散。處理后的肉樣在4 ℃冷藏0.5、6、12、24 h和48 h，并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定pH值和嫩度指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3 次。同時(shí)取適量肉樣立即用液氮冷凍，在－80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 糖酵解指標(biāo)的測(cè)定

參考Wang Huajie等[13]的方法并略作修改，稱(chēng)取2 g肉樣置于離心管中，加入18 mL 0.9 g/100 mL氯化鈉溶液（pH 7.1）冰浴勻漿，勻漿液以3 500×g、4 ℃離心10 min，棄去沉淀保留上清液，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定糖原和乳酸含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.3 肉品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

pH值：參考李華健等[14]的方法，首先使用標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，肉樣吸除多余水分，使用pH計(jì)探頭在肉樣隨機(jī)部位測(cè)定3 次，記錄讀數(shù)。

剪切力：參考Suliman等[15]的方法，將肉樣置于水浴鍋中蒸煮至中心溫度達(dá)到75 ℃，取出后冷卻至室溫，然后沿著肌纖維方向切成長(zhǎng)2 cm、直徑1.27 cm的柱狀體。使用嫩度儀測(cè)定剪切力，測(cè)定結(jié)果單位為N，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）：參考Weimer等[16]的方法，取適量肉樣切碎，稱(chēng)取2 g，加入18 mL緩沖液（含100 mmol/L氯化鉀、1 mmol/L氯化鎂、11.2 mmol/L磷酸氫二鉀、8.8 mmol/L磷酸二氫鉀、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L疊氮化鈉，下同）混合，冰浴勻漿，勻漿液以1 000×g、4 ℃離心15 min，棄去上清液，上述步驟重復(fù)2 次。沉淀加入10 mL緩沖液，以200 目篩過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液蛋白質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，再于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按照下式計(jì)算MFI，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.4 TMT蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.4.1 蛋白提取和肽段酶解

參考馬聰聰?shù)萚17]的方法提取蛋白質(zhì)，用蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。取100 μg蛋白樣品，加入4 倍體積10 mmol/L DTT溶液于56 ℃還原1 h。待冷卻至室溫后，添加55 mmol/L IAM溶液避光孵育30 min，然后將溶液轉(zhuǎn)移到超濾裝置（10 kDa），在4 ℃、7 500×g條件下離心15 min，棄去洗脫液，滴加1 mL緩沖液（8 mol/L尿素、150 mmol/L氯化氫緩沖液，pH 8.0），相同條件下離心20 min，重復(fù)上述操作兩次。加入100 μL胰蛋白酶混勻，在37 ℃下孵育過(guò)夜后，用體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液酸化，使用C18Cartridge移液器吸頭對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽處理，完成后加入40 μL裂解緩沖溶液復(fù)溶。

1.3.4.2 TMT標(biāo)記和色譜分級(jí)

每個(gè)處理樣品取100 μg肽段，按照TMT試劑盒操作方法進(jìn)行同位素標(biāo)記。TMT標(biāo)記的多肽混合后進(jìn)行層析分級(jí)。將多肽置于流動(dòng)相A（體積分?jǐn)?shù)25%甲酸-10 mmol/L磷酸二氫鉀，pH 2.7）中溶解，利用流動(dòng)相B（500 mmol/L氯化鉀-10 mmol/L磷酸二氫鉀-體積分?jǐn)?shù)25%甲酸，pH 2.7）以恒定流速（1 mL/min）進(jìn)行梯度洗脫：0～25 min、0%～10%；25～32 min、10%～20%；32～42 min、20%～45%；42～52 min、45%～100%；52～60 min、100%。間隔1 min收集餾分冷凍干燥，在C18Cartridge色譜柱上脫鹽。

1.3.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

使用Easy-nLC 1000超高效液相色譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分離，色譜條件為：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈（16∶84，V/V）為流動(dòng)相A，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，流速250 nL/min，梯度洗脫程序：0～50 min、0%～35% A；50～58 min、35%～100% A；58～60 min、100% A。待分離完成后，樣品通過(guò)Q-Exactive System質(zhì)譜儀分析處理，使用多肽片段和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)，質(zhì)譜掃描范圍為300～1 800m/z、分辨率為70 000，全質(zhì)譜掃描自動(dòng)增益控制為3×106，選擇前10 個(gè)肽段離子進(jìn)入高能碰撞誘導(dǎo)解離（high-energy dissociation，HCD）碎裂，進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜并采集數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配，設(shè)置肽段鑒定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于等于0.01，一級(jí)離子質(zhì)量容差為±20×10－6，二級(jí)離子質(zhì)量容差為0.1 Da。根據(jù)差異倍數(shù)大于1.5或小于0.667且P＜0.05篩選差異表達(dá)蛋白。

1.3.4.4 生物信息學(xué)分析

使用基因本體論（gene ontology，GO）注釋、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集差異表達(dá)蛋白，并利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作（protein-protein interaction，PPI）分析，篩選糖酵解通路差異表達(dá)蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以3 次重復(fù)測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，差異顯著性水平P＜0.05。采用OriginPro 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后冷藏過(guò)程中牛肉糖酵解水平變化

宰后冷藏過(guò)程中肌肉內(nèi)正常的氧氣供應(yīng)中斷，能量代謝方式從有氧氧化轉(zhuǎn)化為無(wú)氧糖酵解，糖原和乳酸作為糖酵解反應(yīng)的底物和產(chǎn)物，其含量的變化直接反映了糖酵解水平和速率[18]。如圖1A所示，3 組樣品的糖原含量均隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其中H2O2處理組的糖原含量在6～24 h內(nèi)顯著低于對(duì)照組和NAC處理組（P＜0.05）。H2O2處理組在6～24 h的糖原凈消耗分別是對(duì)照組和NAC處理組的1.31 倍和1.84 倍。如圖1B所示，隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，3 組樣品乳酸含量呈顯著上升趨勢(shì)，H2O2處理組乳酸含量在6～24 h內(nèi)顯著高于其余兩組（P＜0.05），并在12 h達(dá)到最高水平，其0.5～12 h乳酸含量增量分別比NAC處理組和對(duì)照組高9.21%和4.96%，這與圖1A中糖原的快速消耗相對(duì)應(yīng)。上述結(jié)果表明H2O2處理顯著提升了牛肉糖酵解水平，使糖原消耗和乳酸積累速率加快，而NAC處理則抑制了糖酵解進(jìn)程。Luo Ya等[19]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖誘導(dǎo)的高水平ROS會(huì)加速肌肉糖原代謝速率，使糖原分解和乳酸積累顯著提高，與本研究的結(jié)果一致。此外，Chen Zuodong等[20]研究指出，外源H2O2處理能夠誘導(dǎo)牛肉中內(nèi)源ROS生成，后者通過(guò)激活己糖激酶和磷酸果糖激酶提升宰后冷藏初期肌肉糖酵解水平。值得注意的是，Ma Jibing等[21]比較快速和慢速糖酵解牛肉中MFI的差異，發(fā)現(xiàn)快速糖酵解牛肉冷藏過(guò)程中MFI水平顯著提升，有利于牛肉的嫩化進(jìn)程。因此，本研究推測(cè)H2O2處理提升宰后冷藏初期牛肉的糖酵解水平，可能對(duì)肉嫩度產(chǎn)生一定影響。

圖1 宰后冷藏過(guò)程中牛肉糖酵解水平的變化Fig.1 Changes in glycolysis level of bovine muscle during postmortem cold storage

2.2 宰后冷藏過(guò)程中牛肉品質(zhì)指標(biāo)變化

為探究ROS是否通過(guò)調(diào)控糖酵解水平影響牛肉的嫩度，對(duì)肉樣的pH值、剪切力和MFI進(jìn)行測(cè)定。由圖2A可以看出，3 組樣品的pH值在0.5 h時(shí)沒(méi)有顯著差異，但隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，其中H2O2處理組pH值在6～24 h顯著低于其余兩組（P＜0.05），并在12 h達(dá)到極限pH值，比對(duì)照組和NAC處理分別提前了12 h和36 h。這與乳酸含量的變化趨勢(shì)（圖1B）相符，說(shuō)明H2O2處理能夠提升宰后冷藏初期牛肉糖酵解水平，加速乳酸積累并引起pH值迅速下降。pH值變化速率直接影響肉的嫩度，在肉品質(zhì)的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。pH值降低使肌肉內(nèi)環(huán)境酸化，促使肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白形成永久橫橋，肌肉收縮而導(dǎo)致宰后僵直[23]。此外，pH值降低引起肌漿網(wǎng)功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子過(guò)載，引起鈣蛋白酶、組織蛋白酶和細(xì)胞凋亡蛋白酶的活化，進(jìn)而使這些酶迅速分解肌原纖維蛋白質(zhì)，最終改善肉的嫩度[24-25]。

圖2 宰后冷藏過(guò)程中牛肉品質(zhì)指標(biāo)變化Fig.2 Changes in meat quality attributes of bovine muscle during postmortem cold storage

從圖2B可以看出，3 組樣品的剪切力隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中，H2O2組的剪切力在12 h時(shí)達(dá)到最大（宰后僵直過(guò)程），比其余兩組提前12 h，表明H2O2能夠縮短僵直期，從而使肌肉嫩化進(jìn)程提前。這可能與H2O2組較快的pH值下降速率有關(guān)。宰后冷藏過(guò)程中，當(dāng)pH值下降到6.0以下時(shí)，肌肉細(xì)胞中μ-鈣蛋白酶被激活，后者迅速水解肌原纖維蛋白質(zhì)，導(dǎo)致肌肉剪切力迅速下降[26]。上述作用可能是H2O2處理組在12 h時(shí)pH值達(dá)到最低且剪切力呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)的原因。此外，Zhao Yan等[27]研究發(fā)現(xiàn)，宰后冷藏24 h內(nèi)pH值快速下降能夠促進(jìn)肌肉僵直，并且使最終剪切力顯著降低。邢通[28]指出較高初始濃度的ROS可通過(guò)激活磷酸葡萄糖變位酶等代謝蛋白加快糖酵解反應(yīng)，破壞肌肉結(jié)構(gòu)進(jìn)而使剪切力顯著下降，這與本研究結(jié)果一致。

MFI可反映肌原纖維降解的程度，是評(píng)價(jià)肌肉嫩度的主要指標(biāo)。由圖2C可以看出，3 組樣品的MFI均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，6～48 h內(nèi)H2O2處理組的MFI顯著高于對(duì)照組和NAC處理組（P＜0.05）。相反，NAC處理組MFI在6～48 h內(nèi)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。MFI與肌肉纖維的破壞程度呈正相關(guān)，肌肉pH值的下降會(huì)激活μ-鈣蛋白酶、Caspases-3和組織蛋白酶B/D/L等重要的蛋白酶，進(jìn)而加速肌原纖維結(jié)構(gòu)蛋白的分解，造成肌原纖維及肌節(jié)的橫向斷裂，最終導(dǎo)致MFI上升和剪切力下降[29]。Ma Jibing等[21]研究發(fā)現(xiàn)，較高的ROS水平和pH值的快速下降是引起宰后冷藏期間牛肉MFI增加的主要原因，由此推測(cè)ROS通過(guò)加快糖酵解過(guò)程，從而間接促進(jìn)了牛肉的嫩化進(jìn)程。本研究同樣發(fā)現(xiàn)H2O2處理加速了牛肉pH值的降低，顯著縮短了肌肉僵直期并促進(jìn)了MFI的升高。因此，較高的ROS水平可以通過(guò)加快糖酵解反應(yīng)改善肉的嫩度。但是，關(guān)于ROS調(diào)控糖酵解通路的具體分子機(jī)制和靶點(diǎn)蛋白質(zhì)仍不明確。

2.3 糖酵解差異蛋白鑒定結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)H2O2處理能夠提升宰后冷藏初期牛肉糖酵解水平，并且有利于肉嫩度的改善。為探究ROS在復(fù)雜糖酵解反應(yīng)進(jìn)程中的作用機(jī)制，進(jìn)一步采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)冷藏24 h時(shí)H2O2處理組和對(duì)照組樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。如表1所示，從兩組樣品共得到二級(jí)質(zhì)譜譜圖總數(shù)170 424 個(gè)，鑒定肽段匹配到的譜圖數(shù)26 711 個(gè)，肽段總數(shù)7 090 個(gè)。在扣除空白值、確定可信蛋白的基礎(chǔ)上，以上調(diào)倍數(shù)大于1.5或下調(diào)倍數(shù)小于0.667、P＜0.05的條件篩選差異表達(dá)蛋白。如圖3所示，共篩選出271 個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白135 個(gè)，下調(diào)蛋白136 個(gè)。

表1 冷藏24 h時(shí)H2O2處理組和對(duì)照組樣品蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果Table 1 Statistics of protein identification results in H2O2 treated versus control groups during 24 hours of refrigeration

圖3 冷藏24 h時(shí)H2O2處理組和對(duì)照組樣品蛋白質(zhì)分析火山圖Fig.3 Volcano plot of differential proteins in H2O2 treated versus control groups during 24 hours of refrigeration

為確定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，使用層次聚類(lèi)算法對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖4所示，H2O2處理組的樣品聚為一類(lèi)并與對(duì)照組樣品分離，且H2O2處理組差異表達(dá)蛋白A0A4W2CXP9到A0A3Q1M3G5表達(dá)量（黃綠色區(qū)域）高于對(duì)照組，但對(duì)照組差異表達(dá)蛋白L8IJH1到A0A4W2CB58表達(dá)量（黃綠色區(qū)域）卻高于H2O2處理組，表明不同處理樣品的蛋白組具有顯著差異。同時(shí)，不同處理組之間層次分明，表明差異表達(dá)蛋白的合理性，驗(yàn)證了差異表達(dá)蛋白生物性重復(fù)良好。

圖4 H2O2處理組和對(duì)照組樣品差異表達(dá)蛋白聚類(lèi)熱圖Fig.4 Cluster heatmap of differentially expressed proteins between H2O2 treated versus control groups

2.4 生物信息學(xué)分析結(jié)果

為明確ROS調(diào)控糖酵解改善肉嫩度的差異表達(dá)蛋白，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋、KEGG功能富集、PPI分析。GO注釋分為細(xì)胞成分、生物過(guò)程、分子功能，其中前10 個(gè)條目如圖5A所示。不同處理下差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞、細(xì)胞部分，所參與的生物過(guò)程集中在代謝和單生物過(guò)程，涉及的分子功能有催化活性和結(jié)合。肌肉細(xì)胞內(nèi)不同通路互相協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為。對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到197 條通路，其中丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、肌肉收縮通路富集最為顯著（圖5B）。通過(guò)GO注釋與KEGG富集篩選出糖酵解差異表達(dá)蛋白，使用String 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行PPI分析，結(jié)果如圖5C所示，差異表達(dá)蛋白磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM）、醛脫氫酶7家族成員A1（aldehyde dehydrogenase 7 family member A1，ALDH7A1）、醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2 family member，A L D H 2）、醛脫氫酶3 家族成員A 2（a l d e h y d e dehydrogenase 3 family member A2，ALDH3A2）、2-磷酸-D-甘油酸水解酶（enolase，ENO）、丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit β，PDHB）、果糖-二磷酸醛縮酶C（aldolase C, fructose-bisphosphate，ALDOC）、乳酸脫氫酶B（lactate dehydrogenase B，L D H B）、丙酮酸脫氫酶E 1 亞基α（p y r u v a t e dehydrogenase E1 subunit α，PDHA）、丙酮酸激酶M1/2（pyruvate kinase M1/2，PKM2）形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，彼此之間相互交叉，其中以PGAM、ENO、PDHB為主要節(jié)點(diǎn)，共同作用激活糖酵解酶相關(guān)基因，加速糖酵解的表達(dá)。

圖5 H2O2處理組和對(duì)照組樣品差異表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果Fig.5 Annotation enrichment analysis of differential proteins in H2O2 treated versus control groups

2.5 ROS調(diào)控糖酵解通路機(jī)制

通過(guò)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析，確定差異表達(dá)蛋白參與的生物過(guò)程與富集通路，并對(duì)富集的糖酵解通路進(jìn)行PPI分析，在此基礎(chǔ)上篩選出10 種糖酵解關(guān)鍵表達(dá)蛋白，H2O2處理使其中8 種蛋白表達(dá)上調(diào)、2 種蛋白表達(dá)下調(diào)，具體如表2所示。

表2 通過(guò)PPI分析篩選出的10 種糖酵解相關(guān)差異表達(dá)蛋白Table 2 Differential proteins associated with glycolysis screened by protein-protein interaction (PPI) analysis

從生物信息學(xué)分析結(jié)果來(lái)看，不同ROS水平下PGAM、ENO和PDHB是調(diào)控糖酵解反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白（圖5C）。其中PGAM催化3-磷酸甘油酸反應(yīng)生成2-磷酸甘油酸，是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶[30]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PGAM可作為一種重要蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)肉的嫩度、色澤、pH值，與乳酸積累呈顯著正相關(guān)[31]。Li等[32]指出，高表達(dá)的PGAM會(huì)在線粒體外膜上積累，導(dǎo)致代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，而?dāng)采用蒿甲醚處理抑制PGAM活性時(shí)，能夠檢測(cè)到糖酵解水平顯著降低[33]。因此，推斷PGAM是調(diào)控糖酵解改善嫩度的關(guān)鍵蛋白之一。ENO是由ENO1、ENO2等復(fù)合的一種多功能蛋白。過(guò)量表達(dá)的ENO1會(huì)激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B及其下游信號(hào)，從而上調(diào)糖酵解進(jìn)程[34]。羅建杰[35]利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ENO1、丙酮酸羧激酶2和磷酸甘油酸激酶1的上調(diào)增強(qiáng)了肉仔雞的能量代謝水平，在改善肌肉色澤和風(fēng)味方面發(fā)揮重要作用。PDH是丙酮酸還原酶復(fù)合物的組成部分，負(fù)責(zé)催化丙酮酸產(chǎn)生乙酰輔酶A參與三羧酸循環(huán)。通過(guò)免疫印跡分析表明，脯氨酰羥化酶3可以與PDHB相互作用上調(diào)PDH，提高細(xì)胞氧化磷酸化途徑的能量代謝水平[36]。

除上述3 個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白外，ALDH7A1、ALDH3A2、ALDH2同屬于醛脫氫酶，醛脫氫酶是多種酶的復(fù)合體，主要存在細(xì)胞質(zhì)、線粒體等位置[37-39]。GO注釋表明分子功能為氧化還原酶活性，可將醛、氧基團(tuán)中的輔酶I磷酸化為輔酶II，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖酵解、脂肪酸氧化等途徑。同時(shí)，過(guò)表達(dá)的醛脫氫酶會(huì)加快糖酵解和三羧酸循環(huán)[40-41]，對(duì)肉品質(zhì)的改善發(fā)揮積極作用。有研究指出，醛脫氫酶與ENO相互作用對(duì)穩(wěn)定癌細(xì)胞糖酵解途徑的能量供應(yīng)發(fā)揮重要作用[42]。ALDOC作為糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化果糖-1,6-二磷酸向甘油醛-3-磷酸和磷酸二羥基丙酮的可逆轉(zhuǎn)化。Wang Gang等[43]探究發(fā)現(xiàn)，高糖酵解水平下的烯醇化酶會(huì)磷酸化蛋白激酶B，進(jìn)而上調(diào)ALDOC等糖酵解酶的表達(dá)，改善肉的嫩度。Chang Yuchan等[44]對(duì)惡性腫瘤影響因素的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果證實(shí)了ALDOC與糖酵解信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，前者的積累會(huì)加快乳酸的釋放，促使糖酵解反應(yīng)提前完成。LHD是調(diào)控細(xì)胞中乳酸積累的關(guān)鍵酶，具有LDHA和LDHB兩種亞型，后者催化丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為乳酸鹽[45]。Wang Feng等[46]通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定得到8 個(gè)糖酵解相關(guān)基因，其中就包括LDHB，這與本研究篩選的關(guān)鍵糖酵解差異表達(dá)蛋白一致。Jeong等[47]發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下LDHB活力顯著升高，促使葡萄糖消耗和乳酸積累加劇，導(dǎo)致pH值下降、糖酵解反應(yīng)提前完成。上述研究表明調(diào)控LDHB對(duì)肉嫩度的改良具有重要借鑒意義。而PDHA表達(dá)量的下調(diào)則會(huì)降低丙酮酸和乙酰輔酶A產(chǎn)生還原型輔酶I的速率，進(jìn)而反向促進(jìn)無(wú)氧糖酵解途徑的能量代謝水平[48]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。結(jié)合上述關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白的調(diào)控機(jī)制及糖酵解、嫩度的結(jié)果，可以推測(cè)H2O2處理可促進(jìn)上述糖酵解通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提升宰后冷藏初期牛肉的糖酵解水平，導(dǎo)致pH值下降速率加快，為牛肉嫩度的改善創(chuàng)造了有利條件。

3 結(jié) 論

宰后冷藏初期H2O2處理能夠提高牛肉糖原消耗和乳酸積累速率，使肌肉快速達(dá)到極限pH值，縮短宰后僵直期。同時(shí)，與對(duì)照組和NAC處理組相比，H2O2處理顯著提升了牛肉MFI，顯著降低了牛肉成熟后期的剪切力，說(shuō)明ROS可通過(guò)促進(jìn)糖酵解發(fā)揮改善嫩度的作用。進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理使牛肉糖酵解通路中的8 種蛋白表達(dá)上調(diào)、2 種蛋白表達(dá)下調(diào)，其中以PGAM、ENO、PDHB為核心的8 種上調(diào)蛋白與下調(diào)的PDHA相互協(xié)調(diào)，加快糖酵解進(jìn)程。由此證實(shí)，ROS通過(guò)調(diào)控糖酵解通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)提升牛肉糖酵解水平，進(jìn)而間接促進(jìn)肉嫩度的改善。上述機(jī)制的發(fā)現(xiàn)有助于完善宰后冷藏過(guò)程中基于能量代謝的肉品質(zhì)形成機(jī)理，為預(yù)測(cè)和改善肉品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。