王 月,栗婷婷,李曉露,高月麒,安蘭蘭,程啟東

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 石家莊 052165;2.華北制藥華勝有限公司,河北 石家莊 052160)

達(dá)托霉素為玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種脂肽類(lèi)抗生素,早期由美國(guó)Lilly公司開(kāi)發(fā)生產(chǎn),由13個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀β-氨基酸肽鏈N-末端的L-色氨酸與1個(gè)十碳癸酸連接而成(圖1)[1]。達(dá)托霉素對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)效,但由于其獨(dú)特的Ca2+濃度依賴(lài)的作用機(jī)制對(duì)具有多重耐藥性的革蘭氏陽(yáng)性菌具有良好的抑制作用[2],極大程度上解決了耐藥菌的感染問(wèn)題。這也使達(dá)托霉素作為復(fù)雜的皮膚感染和金黃色葡萄球菌感染的菌血癥和心內(nèi)膜炎的治療藥物在臨床上得到了青睞[3]。

圖1 達(dá)托霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 Fig.1 Chemical structure of Daptomycin

目前,達(dá)托霉素的生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法,產(chǎn)物體系中次級(jí)代謝產(chǎn)物復(fù)雜,從來(lái)源上決定了達(dá)托霉素分離純化難度大;而且因?yàn)檫_(dá)托霉素穩(wěn)定性較差,在純化過(guò)程中易受pH值、溫度的影響產(chǎn)生脫水達(dá)托霉素和β-異構(gòu)達(dá)托霉素等多種雜質(zhì)[4],導(dǎo)致達(dá)托霉素的分離純化難度進(jìn)一步加大。雖然目前關(guān)于達(dá)托霉素分離純化國(guó)內(nèi)外已有大量研究,主要方法有溶媒萃取、離子交換、色譜分離、膜分離、大孔樹(shù)脂分離和結(jié)晶等[5-7],但是,隨著國(guó)際高端市場(chǎng)對(duì)產(chǎn)品雜質(zhì)限度要求越來(lái)越嚴(yán)格,應(yīng)用上述方法進(jìn)行達(dá)托霉素分離純化往往難以達(dá)到要求。為了開(kāi)發(fā)出一種收率高、產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)良的高效液相色譜純化工藝,作者采用高效液相色譜法對(duì)達(dá)托霉素粗品進(jìn)行純化,對(duì)反相硅膠種類(lèi)、洗脫劑濃度、洗脫速度、上樣量進(jìn)行優(yōu)選,并對(duì)關(guān)鍵雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制,以期得到滿(mǎn)足高端客戶(hù)要求的達(dá)托霉素產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

達(dá)托霉素發(fā)酵液(發(fā)酵單位2 060 μg·mL-1),自制;反相硅膠UniSil C18、UniSil C18 Ultra、UniSil C8,蘇州納微科技股份有限公司。

乙醇、乙腈為制備級(jí),其它試劑均為分析純。

e2695型分析液相色譜系統(tǒng),Waters公司;NP7000型制備液相色譜系統(tǒng),漢邦科技有限責(zé)任公司;Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,Heidolph公司;XSR105 DualRange型分析天平,Mettler Toledo公司;SCIENTZ-30F/A型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 達(dá)托霉素粗品的制備

將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)pH值至2.0～4.5,經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾得到澄清濾液;濾液過(guò)D312大孔吸附樹(shù)脂柱,用一定濃度的乙醇洗脫,收集達(dá)托霉素濃度大于200 μg·mL-1的解吸液;將解吸液減壓濃縮,調(diào)節(jié)濃縮液pH值至6.5,上樣于NMQ陰離子交換樹(shù)脂層析柱,用含鹽水溶液進(jìn)行梯度洗脫,根據(jù)色譜峰收集洗脫液;洗脫液經(jīng)納濾、濃縮、結(jié)晶、干燥,得到達(dá)托霉素粗品。

1.3 達(dá)托霉素粗品的純化

將一定質(zhì)量的達(dá)托霉素粗品,用適量水溶解后加入2%氯化鈉,上樣于反相硅膠色譜柱,收集洗脫液;將洗脫液用10%的醋酸調(diào)pH值至6.0～6.2,經(jīng)濃縮、凍干,得到達(dá)托霉素精粉。

對(duì)達(dá)托霉素粗品純化過(guò)程中的反相硅膠種類(lèi)、洗脫劑濃度、洗脫速度、上樣量進(jìn)行優(yōu)選。

1.4 色譜條件

分析液相色譜系統(tǒng):Phenomenex IB-Sil C8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.45%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.25)-乙腈(67∶33,體積比),流速1.5 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 反相硅膠種類(lèi)的選擇

分別取預(yù)處理好的反相硅膠UniSil C18、UniSil C18 Ultra、UniSil C8各100 mL,按重力沉降法裝柱,用2%～3%的乙醇平衡系統(tǒng)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取達(dá)托霉素粗品1.0 g,用適量水溶解后加入2%氯化鈉,分別上樣于3種反相硅膠色譜柱;然后用0%～80%的乙醇梯度洗脫,制備液相色譜檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè),根據(jù)色譜圖收集洗脫液;合并達(dá)托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計(jì)算洗脫收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 反相硅膠種類(lèi)對(duì)達(dá)托霉素洗脫收率的影響(n=3)

由表1可知,UniSil C18 Ultra反相硅膠色譜柱的pH使用范圍最廣,達(dá)托霉素的洗脫收率最高。故,選擇UniSil C18 Ultra反相硅膠色譜柱純化達(dá)托霉素。

2.2 洗脫劑濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),洗脫劑乙醇濃度在6%～12%時(shí),主產(chǎn)物被集中洗脫。為進(jìn)一步確定乙醇濃度,選擇反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱,按2.1方法分別采用6%、8%、10%、12%的乙醇進(jìn)行等度洗脫,分管收集洗脫液,合并達(dá)托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計(jì)算洗脫收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 洗脫劑濃度對(duì)達(dá)托霉素洗脫收率的影響(n=3)

由表2可知,用6%、8%的乙醇洗脫時(shí),洗脫液中主要是極性大的雜質(zhì);用10%乙醇洗脫時(shí),雜質(zhì)去除率高,達(dá)托霉素的分離純化效果最好,達(dá)托霉素HPLC含量和洗脫收率均達(dá)到最高;用12%乙醇洗脫時(shí),極性小的雜質(zhì)與達(dá)托霉素一同洗脫下來(lái),達(dá)托霉素HPLC含量和洗脫收率有所降低。因此,選擇10%乙醇作為洗脫劑。

2.3 洗脫速度的選擇

選擇反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱、10%乙醇作為洗脫劑,按2.1方法分別以洗脫速度14 mL·min-1、16 mL·min-1、18 mL·min-1、20 mL·min-1進(jìn)行等度洗脫,分管收集洗脫液,合并達(dá)托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計(jì)算洗脫收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 洗脫速度對(duì)達(dá)托霉素洗脫收率的影響(n=3)

洗脫速度慢則分離純化耗時(shí)較長(zhǎng)。由表3可知,隨著洗脫速度的加快,達(dá)托霉素洗脫收率先升高后降低;當(dāng)洗脫速度為16 mL·min-1時(shí),洗脫收率達(dá)到最高;當(dāng)洗脫速度為18 mL·min-1時(shí),洗脫收率略微下降。綜合考慮,選擇洗脫速度為16～18 mL·min-1。

2.4 上樣量的選擇

選擇反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱、10%乙醇作為洗脫劑、洗脫速度16～18 mL·min-1,上樣量分別為8 mg·mL-1、10 mg·mL-1、12 mg·mL-1、14 mg·mL-1,按2.1方法進(jìn)行洗脫,分管收集洗脫液,合并達(dá)托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計(jì)算洗脫收率,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 上樣量對(duì)達(dá)托霉素洗脫收率的影響(n=3)

由表4可知,當(dāng)上樣量小于10 mg·mL-1時(shí),樣品分散程度好,但填料利用率低,成本高;當(dāng)上樣量大于12 mg·mL-1時(shí),色譜峰變寬,目標(biāo)物與雜質(zhì)交叉嚴(yán)重,HPLC含量和洗脫收率均降低。因此,在保證分離度的前提下,選擇上樣量為10～12 mg·mL-1。

2.5 精粉制備與含量測(cè)定

取達(dá)托霉素粗品20.0 g,在上述優(yōu)選純化條件(反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱,洗脫劑為10%乙醇,洗脫速度為16～18 mL·min-1,上樣量為10～12 mg·mL-1)下,使用DAC100(2L)色譜柱制備液相色譜進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。采用HPLC法檢測(cè)達(dá)托霉素含量,合并合格洗脫液,用10%的醋酸將洗脫液pH值調(diào)至6.0～6.2,濃縮、凍干,得到達(dá)托霉素精粉14.2 g,HPLC含量99.2%,HPLC圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 達(dá)托霉素精粉的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of Daptomycin fine powder

2.6 工藝驗(yàn)證

在優(yōu)選純化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),按色譜條件測(cè)定達(dá)托霉素HPLC含量,計(jì)算收率;并測(cè)定達(dá)托霉素精粉中有關(guān)物質(zhì)含量,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 達(dá)托霉素純化工藝驗(yàn)證(n=3)

由表5可知,在優(yōu)選純化條件下,達(dá)托霉素精粉中有關(guān)物質(zhì)含量均低于企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn),HPLC含量超過(guò)99.0%,收率超過(guò)70.0%。表明優(yōu)選純化條件分離效果好,可實(shí)現(xiàn)連續(xù)制備,并能夠精準(zhǔn)把控關(guān)鍵雜質(zhì)。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法分離純化達(dá)托霉素。以反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱、以10%乙醇為洗脫劑、洗脫速度為16～18 mL·min-1、上樣量為10～12 mg·mL-1,在此條件下,達(dá)托霉素精粉的HPLC含量超過(guò)99.0%,收率超過(guò)70.0%。該方法分離制備效率高,有機(jī)溶劑用量少,純化精粉中的有關(guān)物質(zhì)均滿(mǎn)足質(zhì)量要求,為高質(zhì)量達(dá)托霉素的規(guī)模化生產(chǎn)提供了重要參考,具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。