雒江菡

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所,黑龍江 哈爾濱 150076)

紫草是一種粗大、多毛多年生草本植物,作為藥材使用最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上、中、下三品中的中品,其藥性趨于甘、寒、咸性,歸心、肝經(jīng),具有清熱、活血、透疹消斑等作用,很早就被《中國藥典》收錄[1]。目前,對紫草化學(xué)成分的提取分離研究較多,主要包括水溶性的紫草多糖和脂溶性的單萜苯酚類、苯醌類、生物堿類、黃酮類、酯類等,還有部分酚酸類化合物[2-4],而對萘醌類化合物的提取分離研究較少[5-8]。紫草萘醌類化合物具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、保肝等功效,具有很高的藥用價值[9-10]。在此,作者采用加熱回流法提取紫草總萘醌,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新疆軟紫草,購于同仁堂,經(jīng)鑒定為新疆軟紫草全草。

左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)品,上海聯(lián)邁生物工程有限公司;無水乙醇,天津天力化學(xué)試劑有限公司。

T-6型紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于50 mL容量瓶中,用無水乙醇溶解并定容,得濃度為0.5 mg·mL-1的左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中,定容,用紫外可見分光光度計測定516 nm處吸光度。以濃度(c,mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 紫草總萘醌的提取

精密稱取干燥的紫草粉末于錐形瓶中,加入無水乙醇,水浴加熱提取一定時間;過濾,濾液用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容至100 mL;吸取10 mL,移入25 mL具塞試管中,加入無水乙醇定容至25 mL,搖勻,即得紫草總萘醌溶液,測定其在516 nm處吸光度,以乙醇為空白對照,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算紫草總萘醌濃度,按下式計算紫草總萘醌提取量(mg·g-1):

式中:c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算的紫草總萘醌濃度,mg·mL-1;n為稀釋倍數(shù);V為提取液體積,mL;m為紫草粉末質(zhì)量,g。

1.4 提取工藝的優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫草總萘醌提取量的影響;在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素,以紫草總萘醌提取量為考核指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化紫草總萘醌的提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

左旋紫草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 左旋紫草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of shikonin

對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合,得到線性方程:A=1.2094c-0.0055,R2=0.9993。表明左旋紫草素濃度在0～0.25 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度對紫草總萘醌提取量的影響

稱量5份紫草粉末各2 g,以80%乙醇為提取溶劑,料液比為1∶20(g∶mL,下同),分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃提取2 h,考察提取溫度對紫草總萘醌提取量的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對紫草總萘醌提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction amount of total naphthoquinones from Arnebia euchroma

由圖2可知,隨著提取溫度的升高,紫草總萘醌提取量先升高后降低,在80 ℃時達(dá)到最高。因此,提取溫度以80 ℃為宜。

2.2.2 料液比對紫草總萘醌提取量的影響

稱量5份紫草粉末各2 g,以80%乙醇為提取溶劑,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,在80 ℃提取2 h,考察料液比對紫草總萘醌提取量的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對紫草總萘醌提取量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total naphthoquinones from Arnebia euchroma

由圖3可知,隨著料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,紫草總萘醌提取量先升高后降低,在料液比為1∶40時達(dá)到最高。因此,料液比以1∶40為宜。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫草總萘醌提取量的影響

稱量5份紫草粉末各2 g,分別以50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為提取溶劑,料液比為1∶20,在80 ℃提取2 h,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫草總萘醌提取量的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫草總萘醌提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on extraction amount of total naphthoquinones from Arnebia euchroma

由圖4可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,紫草總萘醌提取量先升高后降低,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時達(dá)到最高。因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)以80%為宜。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化紫草總萘醌的提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1,結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知,各因素對紫草總萘醌提取量的影響大小依次為:提取溫度>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù),即提取溫度對紫草總萘醌提取量的影響最大,料液比次之,乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最小;最優(yōu)提取工藝組合為A3B3C3,即提取溫度90 ℃、料液比1∶50、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),紫草總萘醌提取量分別為29.41 mg·g-1、30.03 mg·g-1、28.89 mg·g-1,均大于正交實(shí)驗(yàn)中9組實(shí)驗(yàn)的提取量,RSD值為1.97%。表明優(yōu)化的提取工藝具有一定的可行性,且重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

用移液管精密移取左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于25 mL具塞試管中,用無水乙醇定容并搖勻,測定516 nm處吸光度,重復(fù)測定6次,分別為0.264、0.263、0.257、0.259、0.265、0.264,RSD值為1.2%。表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用移液管精密移取紫草總萘醌溶液5 mL于25 mL具塞試管中,用無水乙醇定容,測定516 nm處吸光度,每隔10 min測定1次,共測定6次,分別為0.284、0.277、0.287、0.289、0.285、0.277,RSD值為1.8%。表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用移液管精密移取同一紫草總萘醌溶液6份,用無水乙醇定容,測定516 nm處吸光度,分別為0.284、0.283、0.271、0.279、0.285、0.284,RSD值為1.9%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取含量已知的紫草總萘醌溶液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL,分別置于10 mL比色管中,加入左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL,混勻,測定516 nm處吸光度,計算加標(biāo)回收率,結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表3可知,平均加標(biāo)回收率為98.11%,RSD值為1.15%,符合要求。

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了紫草總萘醌的加熱回流提取工藝,確定最優(yōu)工藝為:提取時間2 h、提取溫度90 ℃、料液比1∶50(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%,在此條件下,紫草總萘醌提取量可以達(dá)到30.03 mg·g-1。為中藥材紫草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。