于汶莉,宋銀平,季乃云

(1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所,山東 煙臺(tái) 264003;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

木霉屬真菌種類及次級(jí)代謝產(chǎn)物具有多樣性、復(fù)雜性和豐富性特點(diǎn),已從木霉屬真菌中分離、鑒定了許多結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括萜類、聚酮類、甾體類、生物堿類、肽類等[1-2],其中萜類化合物含量較豐富[3]。近年來(lái),一些結(jié)構(gòu)骨架獨(dú)特、取代類型新穎的萜類化合物陸續(xù)在海洋木霉中被發(fā)現(xiàn)[4-5],這些新的萜類化合物具有多種生物活性,如抗菌活性、細(xì)胞毒活性以及對(duì)海洋浮游生物的抑制活性等[4-7]。

海洋來(lái)源的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)是已知次級(jí)代謝產(chǎn)物較為豐富的真菌,已鑒定出新化合物90多個(gè),結(jié)構(gòu)類型涵蓋倍半萜、二萜、甾體、聚酮、生物堿和肽類[8-16]。棘孢木霉cf44-2是從舟山群島褐藻門馬尾藻屬海藻(Sargassumsp.)的內(nèi)部組織中分離得到的1株內(nèi)生真菌,此前對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物研究時(shí)得到了包括甾體類衍生物(tricholumin A)、環(huán)橙花烷類倍半萜(9-cycloneren-3,7,11-triol、11-cycloneren-3,7,10-triol、7,10-epoxycycloneran-3,11,12-triol)、沒(méi)藥烷類倍半萜(trichaspin、trichaspside A、trichaspside B、bisabolan-1,10,11-triol、12-nor-11-acetoxybisabolen-3,6,7-triol)等新化合物[13-15],但從該菌株中發(fā)現(xiàn)的沒(méi)藥烷類倍半萜的數(shù)量少于其它同種菌株。為深入挖掘海洋藻棲棘孢木霉cf44-2中倍半萜類化合物的化學(xué)多樣性,作者通過(guò)改變培養(yǎng)條件,獲得一系列結(jié)構(gòu)多樣的沒(méi)藥烷類倍半萜衍生物,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

GF-254硅膠板、硅膠填料(100～200目、200～300目),青島海洋化工廠;Sephadex LH-20填料,GE公司;RP-18填料,YMC公司。

除色譜級(jí)甲醇和色譜級(jí)乙腈外,其余均為分析純有機(jī)試劑,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Bruker AVANCE Ⅲ 500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(1HNMR為500 MHz,13CNMR為125 MHz);Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)(Eclipese SB-C18色譜柱,9.4 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

棘孢木霉cf44-2,自舟山群島近岸采集的褐藻門馬尾藻屬海藻(Sargassumsp.)的內(nèi)生絲狀真菌,鑒定信息參見(jiàn)文獻(xiàn)[15],菌株序列已提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào):MG696741),現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC:M 2017360)。

大米固體培養(yǎng)基:1 L培養(yǎng)瓶中加入大米20 g、蒸餾水20 mL、陳海水20 mL、蛋白胨0.6 g。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

選用大米固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株cf44-2,共培養(yǎng)200瓶(1 L),在25 ℃下靜態(tài)培養(yǎng)40 d。

1.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

菌株cf44-2靜態(tài)培養(yǎng)40 d后,加入200 mL乙酸乙酯,浸泡48 h;抽濾,將菌絲體與液體分開(kāi);液體用乙酸乙酯反復(fù)萃取3次后,有機(jī)相減壓濃縮,即得發(fā)酵液粗提物;菌絲體自然風(fēng)干,粉碎后用二氯甲烷-甲醇(1∶1,體積比)浸泡提取,共提取3次,抽濾,有機(jī)相減壓濃縮,即得菌絲體粗提物;合并發(fā)酵液粗提物和菌絲體粗提物,即得總粗提物。

將總粗提物進(jìn)行硅膠柱層析,收集各組分;再經(jīng)反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、硅膠柱層析、制備薄層層析(TLC檢測(cè)用254 nm和365 nm暗箱三用紫外燈觀察,或采用硫酸-茴香醛顯色劑加熱顯色)、半制備高效液相色譜等方法分離純化。

1.3.3 純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)1HNMR、13CNMR分析并比對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù),對(duì)純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

從棘孢木霉cf44-2發(fā)酵產(chǎn)物中獲得8個(gè)沒(méi)藥烷類倍半萜衍生物,其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 8個(gè)沒(méi)藥烷類倍半萜衍生物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of eight bisabolane sesquiterpene derivatives

化合物1:無(wú)色油狀。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.61(1H,dt,J=0.2 Hz、1.5 Hz,H-2),5.52(1H,dt,J=10.1 Hz、1.1 Hz,H-1),5.10(1H,t,J=7.1 Hz,H-10),1.69(3H,s,H-13),1.60(3H,s,H-12),1.28(3H,t,J=2.8 Hz,H-15),0.85(3H,dd,J=12.2 Hz、6.8 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:134.7(C-2,CH),132.3(C-1,CH),131.5(C-11,C),124.8(C-10,CH),70.0(C-3,C),40.3(C-6,CH),38.5(C-4,CH2),36.4(C-7,CH),34.3(C-8,CH2),28.5(C-15,CH3),26.1(C-9,CH2),25.9(C-13,CH3),22.5(C-5,CH2),17.8(C-12,CH3),15.9(C-14,CH3)。通過(guò)比對(duì),化合物1的1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道化合物(3S*,6R*,7S*)-zingiberenol的數(shù)據(jù)一致。此前對(duì)棘孢木霉cf44-2的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中,同樣分離得到化合物1。

化合物2:無(wú)色油狀。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.85(1H,m,H-2),5.10(1H,tm,J=7.0 Hz,H-10),2.15(1H,dt,J=12.5 Hz、4.2 Hz,H-6),1.93(3H,m,H-15),1.67(3H,s,H-13),1.59(3H,s,H-12),1.29(2H,m,H-8),0.79(3H,d,J=6.8 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:201.3(C-1,C),161.4(C-3,C),131.6(C-11,C),127.3(C-2,CH),124.6(C-10,CH),50.0(C-6,CH),34.8(C-8,CH2),31.0(C-4,CH2),30.4(C-7,CH),26.1(C-9,CH2),25.9(C-9,CH2),24.3(C-13,CH3),22.5(C-5,CH),17.8(C-12,CH3),15.7(C-14,CH3)。通過(guò)比對(duì),化合物2的1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道化合物(6R*,7S*)-2,10-bisaboladien-1-one的數(shù)據(jù)一致。

化合物3:無(wú)色油狀。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.87(1H,s,H-2),3.54(1H,dd,J=10.3 Hz、2.5 Hz,H-10),2.15(1H,dt,J=13.1 Hz、3.9 Hz,H-6),1.95(3H,s,H-15),1.21(3H,s,H-13),1.15(3H,s,H-12),0.95(3H,d,J=6.7 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:202.3(C-1,C),162.6(C-3,C),127.2(C-2,CH),76.6(C-10,CH),73.0(C-11,C),51.8(C-6,CH),31.4(C-4,CH2),28.6(C-9,CH2),28.4(C-7,CH),28.2(C-8,CH2),26.7(C-13,CH3),24.3(C-15,CH3),23.4(C-12,CH2),22.6(C-5,CH2),17.2(C-14,CH3)。通過(guò)比對(duì),化合物3的1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道化合物trichodone A的數(shù)據(jù)一致。

化合物4～8:均為無(wú)色油狀。通過(guò)1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)分析并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)與trichobisabolin Z(4)、trichobisabolin Q(5)、trichobisabolin N(6)、trichobisabolin S(7)、trichobisabolin M(8)數(shù)據(jù)一致,相關(guān)波譜數(shù)據(jù)見(jiàn)文獻(xiàn)[20-21]。

2.2 討論

棘孢木霉是海洋木霉屬真菌中的重要一員。目前,涉及次級(jí)代謝產(chǎn)物的海洋來(lái)源棘孢木霉至少有6株(dl-34、Y6-2、A-YMD-9-2、cf44-2、Y19-07或17以及1株未編號(hào)的棘孢木霉),其中有4株為藻棲棘孢木霉。已報(bào)道的海洋來(lái)源棘孢木霉次級(jí)代謝產(chǎn)物具有高度的新穎性和多樣性,包括倍半萜及其衍生物、二萜、聚酮、多肽等。其中倍半萜及其衍生物占絕大多數(shù)且種類豐富,包括21個(gè)沒(méi)藥烷類倍半萜、24個(gè)環(huán)橙花烷類倍半萜、2個(gè)杜松烷類倍半萜等[4,8-16,22-24]。Song等[9-12]在研究藻棲棘孢木霉A-YMD-9-2的次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí),以大米為基質(zhì)對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)了7個(gè)新的沒(méi)藥烷類倍半萜、16個(gè)新的環(huán)橙花烷類倍半萜及4個(gè)已知的環(huán)橙花烷類倍半萜。

藻棲棘孢木霉cf44-2在此前的研究中以馬鈴薯為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),得到了包括1個(gè)甾體類衍生物、3個(gè)環(huán)橙花烷類倍半萜、5個(gè)沒(méi)藥烷類倍半萜在內(nèi)的新化合物[13-15],其中沒(méi)藥烷類倍半萜相較于其它同種菌株的數(shù)量較少。眾所周知,培養(yǎng)條件不同對(duì)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有顯著影響[25-26]?；诖?Shi等[16]以土豆為基質(zhì)對(duì)棘孢木霉Y6-2進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)了8個(gè)新的沒(méi)藥烷類衍生物。本研究通過(guò)改變培養(yǎng)條件,選用大米固體培養(yǎng)基對(duì)棘孢木霉cf44-2進(jìn)行培養(yǎng),除同樣獲得化合物1外,新代謝產(chǎn)生了7個(gè)新的沒(méi)藥烷類倍半萜衍生物,其中含5個(gè)降沒(méi)藥烷倍半萜。由此可以推測(cè),以大米為基質(zhì)對(duì)棘孢木霉cf44-2進(jìn)行培養(yǎng),在一定程度上可以增加其次級(jí)代謝產(chǎn)物中沒(méi)藥烷類倍半萜的數(shù)量及結(jié)構(gòu)多樣性;不同棘孢木霉的代謝產(chǎn)物類型受菌株自身代謝以及培養(yǎng)條件的影響。

本研究首次發(fā)現(xiàn)藻棲棘孢木霉cf44-2為產(chǎn)化合物1和2的木霉菌株,而此前該類化合物是在研究蝽蟲(Halyomorphahalys)信息素時(shí)獲得的[17-18]。trichodone A(3)則是在藥用植物三七(Panaxnotoginseng)的內(nèi)生棘孢木霉中首次被發(fā)現(xiàn)[19],可見(jiàn)化合物3存在于不同來(lái)源的棘孢木霉中。本研究獲得的8個(gè)沒(méi)藥烷類倍半萜衍生物中,包含5個(gè)降沒(méi)藥烷倍半萜,化合物4為在C11位連氧的降倍半萜,化合物5～8均為含吡喃環(huán)降倍半萜,化合物4～8在不同種類的海洋藻棲木霉中均有發(fā)現(xiàn)[19-20]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,化合物4、5和7對(duì)4種海洋浮游植物(Amphidiniumcarterae、Chattonellamarina、Heterosigmaakashiwo、Prorocentrumdonghaiense)均有抑制作用,IC50值為0.54～8.4 μg·mL-1,部分化合物對(duì)檸檬假交替單胞菌(Pseudoalteromonascitrea)及某些海洋弧菌具有抑制作用[20]。化合物6和8也具有一定抗菌活性,但對(duì)海洋浮游植物的抑制活性較弱[21]。

3 結(jié)論

在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究了海洋藻棲棘孢木霉cf44-2中倍半萜類化合物的化學(xué)多樣性,以改變培養(yǎng)條件的方式,對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)改變培養(yǎng)條件誘導(dǎo)菌株cf44-2產(chǎn)生了7個(gè)新的沒(méi)藥烷類倍半萜衍生物,其中部分化合物具有一定的生物活性。表明,改變培養(yǎng)條件是使棘孢木霉中萜類代謝產(chǎn)物多樣化的有效途徑,為今后進(jìn)一步深入挖掘棘孢木霉次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了依據(jù)。