律夢偉,劉鑫榕,蘭 衛(wèi)*,武嘉林,2,3*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830017;2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830002;3.新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司,新疆 烏魯木齊 830011)

毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)為菊科菊苣屬草本植物,主要分布于我國新疆南疆地區(qū),是當(dāng)?shù)鼐用癯Ｓ盟幉腫1]。據(jù)記載,毛菊苣以地上部分入藥,性味苦寒,具有清肝、健胃、利尿等功效,主要用于治療黃疸、胃痛、水腫、尿少等病癥[2]。毛菊苣含有黃酮類、酚酸類、多糖類、萜類、苯丙素類等多種有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,毛菊苣總黃酮和總多酚具有保肝、降糖、降脂、抗氧化、抗菌等作用,是治療非酒精性脂肪肝、糖尿病等的潛在活性成分[3-4]。因此,最大限度地提取毛菊苣總黃酮和總多酚意義重大。

目前,毛菊苣總黃酮或總多酚的提取主要采用回流法,其工藝優(yōu)化以正交實驗為主,但提取效率普遍較低[5-7]。秦冬梅[8]采用乙醇回流法提取毛菊苣根中總黃酮,通過正交實驗優(yōu)化提取工藝,在最佳條件下,毛菊苣浸膏得率為5.255%±0.052%,總黃酮得率為0.849%±0.027%。相較于回流提取法,超聲提取法具有設(shè)備簡單、溶劑用量少、對熱敏性成分友好、提取時間短、提取效率高等優(yōu)點[9]。近年來,響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分提取工藝的優(yōu)化,與正交實驗相比,具有建模速度快、目標(biāo)組分得率高、回歸方程精密度高等優(yōu)勢[10-11]。目前,關(guān)于毛菊苣地上部分總黃酮和總多酚的提取工藝優(yōu)化尚未見報道。因此,作者以通過熵權(quán)法[12]計算的毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量的綜合評分為評價指標(biāo),采用響應(yīng)面法對毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為毛菊苣總黃酮和總多酚的提取及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

毛菊苣,購自新疆昌吉吉木薩爾縣天郝成業(yè)中藥材種植合同社,由新疆醫(yī)科大學(xué)盛萍教授鑒定為菊科菊苣屬毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)的地上部分。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,批號:A05GB145263、MUST-17041504),上海源葉生物科技有限公司;福林酚試劑,新疆醫(yī)科大學(xué)實驗室;無水乙醇、Na2CO3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3均為分析純。

722S型可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;AB135-S型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司。

1.2 毛菊苣提取物的制備

將毛菊苣藥材粉碎,過4號篩(65目),備用。準(zhǔn)確稱取2.00 g毛菊苣粉末于200 mL錐形瓶中,按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,超聲提取一定時間,提取2次,合并提取液,抽濾,烘干,即得毛菊苣提取物。

1.3 毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量的測定

1.3.1 浸膏得率的測定

采用減重法測定毛菊苣浸膏得率。將蒸發(fā)皿洗凈晾干后置于60 ℃烘箱中干燥3.5 h,取出,冷卻至室溫,稱重;將毛菊苣提取物倒入干燥的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干至提取物觸之不沾手,稱重。按下式計算浸膏得率:

式中:m2為蒸發(fā)皿和提取物烘干后的質(zhì)量;m1為蒸發(fā)皿烘干后的質(zhì)量;m0為毛菊苣粉末質(zhì)量。

1.3.2 總黃酮含量的測定[13]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:稱取15.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用60%乙醇溶解并定容至50 mL,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,加入2 mL 60%乙醇;依次加入0.3 mL NaNO2溶液和0.3 mL Al(NO3)3溶液,混勻后靜置6 min;再加入4 mL NaOH溶液,用60%乙醇定容至刻度,靜置10 min,測定510 nm處吸光度;以60%乙醇代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照,同法操作,測定510 nm處吸光度。以蘆丁濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、 吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得回歸方程:A=0.0119c+0.019,R2=0.9995。表明,蘆丁濃度在 15～75 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系較好。

取25.00 mg毛菊苣提取物,用60%乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;吸取1.5 mL溶液,按上述方法測定510 nm處吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮含量。

1.3.3 總多酚含量的測定[13]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:稱取5.00 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水溶解并定容至50 mL,得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于10 mL容量瓶中,加入6 mL蒸餾水,搖勻;加入0.5 mL福林酚試劑,搖勻后靜置1 min;再加入20%Na2CO3溶液1.5 mL,用蒸餾水定容至刻度,75 ℃水浴10 min;冷卻至室溫,測定765 nm處吸光度。以沒食子酸濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、 吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得回歸方程:A=0.1666c-0.0015,R2=0.9993。表明,沒食子酸濃度在0～5 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系較好。

取25.00 mg毛菊苣提取物,用蒸餾水溶解并定容于10 mL容量瓶中;吸取0.2 mL溶液,按上述方法測定765 nm處吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總多酚含量。

1.4 綜合評分的計算

由于總黃酮和總多酚極性相差不大,提取過程中會相互影響,因此以單一活性成分含量作為評價指標(biāo)不合理;且浸膏得率能夠反映樣品的整體質(zhì)量水平,因此以熵權(quán)法計算的浸膏得率和活性成分含量的綜合評分作為評價指標(biāo)最為可靠[14]。根據(jù)熵權(quán)法進(jìn)行賦權(quán),得到毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量的權(quán)重值分別為0.521 2、0.238 4、0.240 4,綜合評分=浸膏得率×0.5212+總黃酮含量×0.2384+總多酚含量×0.2404。

1.5 提取工藝的優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

采用單因素實驗,分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、90%)、超聲時間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,g∶mL,下同)對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量和總多酚含量的影響。每組實驗做3個平行。

1.5.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時間(B)、料液比(C)為考察因素,以綜合評分為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝。

1.6 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel和Origin 2021版進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖,運用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

在料液比為1∶30、超聲時間為30 min的條件下,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響,結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extract yield,total flavonoids content,and total polyphenols content of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet

由圖1可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分均逐漸升高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時,四者均達(dá)到最高;繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù),總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分均顯著降低,而浸膏得率降低后又升高,整體變化不明顯。這是因為,根據(jù)“相似相溶”原理,乙醇體積分?jǐn)?shù)越大,其它脂溶性成分就越易溶出,而黃酮類和多酚類成分因極性較大在提取時就會受到抑制[15]。因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)對毛菊苣總黃酮和總多酚含量的影響較大,但對浸膏得率的影響不顯著。綜合考慮,選擇60%作為響應(yīng)面實驗乙醇體積分?jǐn)?shù)的中心點。

2.1.2 超聲時間的選擇

在料液比為1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下,考察超聲時間對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時間對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extract yield,total flavonoids content,and total polyphenols content of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet

由圖2可知,隨著超聲時間的延長,浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分均逐漸升高,當(dāng)超聲時間為30 min時,四者均達(dá)到最高;繼續(xù)延長超聲時間,總黃酮含量明顯降低,而浸膏得率、總多酚含量及綜合評分略微降低后趨于穩(wěn)定?？赡苁且驗?超聲時間過長,毛菊苣中其它成分溶出,造成總黃酮含量明顯降低[16];而多酚類成分具有強(qiáng)抗氧化性,僅部分因為超聲時間過長被氧化,造成總多酚含量僅略微降低[17];總體導(dǎo)致浸膏得率也略微降低。綜合考慮,選擇30 min作為響應(yīng)面實驗超聲時間的中心點。

2.1.3 料液比的選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲時間為30 min的條件下,考察料液比對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extract yield,total flavonoids content,and total polyphenols content of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet

由圖3可知,隨著料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分整體均逐漸升高,當(dāng)料液比為1∶50時,四者均達(dá)到最高;繼續(xù)增加溶劑用量,浸膏得率、總黃酮含量及綜合評分降低,總多酚含量變化不大?？赡苁且驗?溶劑用量增加,有利于細(xì)胞破碎和胞內(nèi)物質(zhì)溶出;但溶劑用量過大會使傳質(zhì)效率降低,穿透細(xì)胞壁能力減弱,從而使溶出速率減慢[15,17]。綜合考慮,選擇1∶50作為響應(yīng)面實驗料液比的中心點。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

響應(yīng)面實驗的因素與水平見表1,設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實驗的因素與水平

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果(n=3)

2.2.2 回歸模型與方差分析

使用Design-Expert 12.0 軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到回歸模型方程:Y=33.062+1.06A+0.34B+0.49C-0.0009AB+0.0011AC+0.0021BC-0.0097A2-0.0057B2-0.0062C2。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知,模型的P=0.0001<0.01,失擬項P=0.6860>0.05,表明該模型極顯著,擬合程度好。此外,一次項A、B,二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值的影響極顯著,說明這些因素對響應(yīng)值的影響很大。由于F值與影響強(qiáng)度呈正相關(guān)[14],根據(jù)F值可知,各因素對毛菊苣總黃酮和總多酚提取的影響大小順序為:A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>B(超聲時間)>C(料液比)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between various factors on comprehensive score

響應(yīng)曲面越陡,等高線越接近橢圓形,說明兩因素的交互作用越顯著。由圖4可知,交互作用強(qiáng)弱順序為BC>AC>AB。最終得到毛菊苣總黃酮和總多酚的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)56.37%、超聲時間35.82 min、料液比1∶50.61,在此條件下,浸膏得率為16.660%、總黃酮含量為17.067 mg·g-1、總多酚含量為9.248 mg·g-1,綜合評分預(yù)測值為14.974。

2.3 最佳工藝驗證

考慮到實際操作的可行性,將毛菊苣總黃酮和總多酚的提取工藝調(diào)整為:乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、超聲時間35 min、料液比1∶50。在此條件下進(jìn)行驗證實驗,浸膏得率為16.333%、總黃酮含量為17.977 mg·g-1、總多酚含量為9.150 mg·g-1,綜合評分為14.998,與預(yù)測值(14.974)接近,其相對誤差為0.16%。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法優(yōu)化了毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝。結(jié)果表明,乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分的影響最大,是毛菊苣總黃酮和總多酚提取工藝優(yōu)化的關(guān)鍵因素。最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、超聲時間35 min、料液比1∶50(g∶mL),在此條件下,浸膏得率為16.333%、總黃酮含量為17.977 mg·g-1、總多酚含量為9.150 mg·g-1,綜合評分為14.998。與秦冬梅[8]的研究結(jié)果(浸膏得率為5.255%±0.052%,總黃酮得率為0.849%±0.027%)相比,浸膏得率提高3倍多,總黃酮得率提高2倍多。此外,發(fā)現(xiàn)在相同提取條件下,總黃酮含量約為總多酚含量的2倍。該研究為今后毛菊苣總黃酮和總多酚的提取及活性研究提供了依據(jù)。