宋皓瑜,張彬鋒,MAENG Yoo Jae

(樂金生活健康化妝品研發(fā)(上海)有限公司,上海 200233)

五味子是木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]的干燥成熟果實(shí),廣泛分布于我國(guó)東北部、韓國(guó)以及日本,具有止咳、鎮(zhèn)靜、保肝的功效。目前,已從五味子中分離鑒定出202種化合物,其中木脂素類有86種,是五味子的主要化學(xué)組分及重要藥理活性成分[1]。五味子乙素是一種聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素,具有保護(hù)肝臟[2]、抑制UVB導(dǎo)致的自由基累積、緩解Propionibacteriumacnes引發(fā)的痤瘡相關(guān)炎癥、減少細(xì)胞及胚胎中黑色素合成等功效[3-5],常被作為功效成分添加在化妝品中[6]。

雙水相體系是一種液-液分離技術(shù),利用不同大分子在互不相溶的兩個(gè)液相間分配系數(shù)的較大差異進(jìn)行分離。雙水相體系兩相的主要成分為水且反應(yīng)條件溫和,不僅有利于維持化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定,也展現(xiàn)出環(huán)保、低成本、易于放大生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)[7]。目前關(guān)于五味子的研究多集中在利用雙水相體系結(jié)合超聲技術(shù)提取五味子活性成分,而前處理過程與雙水相體系相結(jié)合的研究較少。酶法具有高效、環(huán)保、易操作等特點(diǎn),是有效的前處理手段,可與雙水相體系相結(jié)合。鑒于此,作者采用酶解-超聲雙輔助乙醇/硫酸銨雙水相體系制備五味子提取物,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝,并通過比較雙水相體系、酶輔助雙水相體系、超聲輔助雙水相體系及酶解-超聲雙輔助雙水相體系等方法對(duì)五味子乙素的提取效果,驗(yàn)證前處理對(duì)雙水相體系的積極作用,擬為五味子在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

五味子(批號(hào)2433910),購于遼寧,經(jīng)鑒定為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]的干燥成熟果實(shí)。粉碎后置于陰涼干燥處,備用。

五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RDD-W00101910028,純度>98%),成都瑞思芬德丹生物科技有限公司;纖維素酶(10 000 U·g-1);乙腈,色譜純;無水乙醇、硫酸銨、甲醇,分析純。

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;0406-1型臺(tái)式離心機(jī),上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠;UC-22.5H型加熱超聲波清洗器,上海泰坦科技股份有限公司;JP-300C型高速多功能粉碎機(jī),永康久品工貿(mào)有限公司;HWS26型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;S220-K型pH計(jì),上海亞津電子科技有限公司;RC7型磁力攪拌機(jī),上海久然儀器設(shè)備有限公司;ME104型電子天平,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.2 酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物

精密稱取一定量的五味子粉末于具塞錐形瓶中,加入3%(以五味子質(zhì)量計(jì))纖維素酶及一定量的水,調(diào)節(jié)pH值至5.0,于40 ℃水浴3 h后再沸水浴10 min;冷卻至室溫,加入一定量的無水乙醇及硫酸銨,置于超聲波清洗器中,于35 ℃、500 W處理一定時(shí)間;反應(yīng)液于4 000 r·min-1離心10 min,分別記錄上相、下相體積,收集上相。

1.3 五味子乙素得率的測(cè)定

1.3.1 五味子乙素對(duì)照溶液的配制

稱取5.4 mg五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至5 mL,搖勻,即得1.08 mg·mL-1五味子乙素對(duì)照溶液。

1.3.2 供試溶液的制備

精密吸取1.25 mL上相于5 mL容量瓶中,用50%乙醇定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,即得供試溶液。

1.3.3 色譜條件

Poroshell HPH-C18色譜柱(3 mm×100 mm,2.7 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫程序:0～5 min,35%～40%A;5～20 min,40%～45%A;20～25 min,45%～55%A;25～32 min,55%～75%A;32～37 min,75%～35%A;37～40 min,35%A;二極管陣列檢測(cè)器(DAD),檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm;流速1 mL·min-1;柱溫37 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取一定體積的1.08 mg·mL-1五味子乙素對(duì)照溶液,用甲醇稀釋至濃度分別為400 μg·mL-1、320 μg·mL-1、240 μg·mL-1、160 μg·mL-1、80 μg·mL-1、40 μg·mL-1,按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析;以五味子乙素濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得線性回歸方程為:y= 11.284x-86.437,R2=0.9995,表明五味子乙素濃度在40～400 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

1.3.5 五味子乙素得率及相比的計(jì)算

取供試溶液,按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析,分別按式(1)、(2)計(jì)算五味子乙素得率及相比:

(1)

(2)

式中:c為供試溶液中五味子乙素濃度,μg·mL-1;V1為上相體積,mL;n為稀釋倍數(shù);m為五味子粉末質(zhì)量,g;V2為下相體積,mL。

1.4 五味子提取物制備工藝的優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn),分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(15%、20%、25%、30%、35%)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(20%、22%、24%、26%、28%)、超聲時(shí)間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)及液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1,mL∶g,下同)對(duì)五味子乙素得率及相比的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),以五味子乙素得率為響應(yīng)值,進(jìn)一步對(duì)五味子提取物制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析,使用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜

五味子乙素對(duì)照溶液及供試溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 五味子乙素對(duì)照溶液(a)及供試溶液(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of schisandrin B control solution(a) and sample solution(b)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五味子乙素得率及相比的影響(圖2)

反應(yīng)條件:硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、液固比20∶1、超聲時(shí)間60 min

由圖2可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,五味子乙素得率及相比均逐漸升高;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從15%增至35%時(shí),五味子乙素得率從0.94 mg·g-1升至1.98 mg·g-1。這是因?yàn)?隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,上相體積增加,且其中乙醇含量增加,有利于富集醇溶性的五味子乙素[8]。但得率并非評(píng)價(jià)雙水相體系功效的唯一參數(shù),合適的相比同樣重要。在制備五味子提取物時(shí),相比過高不利于兩相分離,其維持在0.7～1.2對(duì)成分富集及實(shí)驗(yàn)操作更為有利[9]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí),相比為0.84,處于合理范圍內(nèi),此時(shí)五味子乙素得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)的得率無顯著性差異(P>0.05)。因此,綜合考慮五味子乙素得率、提取成本及實(shí)驗(yàn)可操作性,選取25%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)的中心點(diǎn)。

2.2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)五味子乙素得率及相比的影響(圖3)

反應(yīng)條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、液固比20∶1、超聲時(shí)間60 min

由圖3可知,隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,五味子乙素得率先升高后保持不變,相比則逐漸下降;當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%時(shí),五味子乙素得率達(dá)到最高,為1.71 mg·g-1,此時(shí)相比為0.84,處于合理范圍內(nèi)。這是因?yàn)?增加硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)促進(jìn)水分子在下相的聚集,使上相中乙醇含量增加,促進(jìn)五味子乙素在上相聚集[10];當(dāng)硫酸銨飽和后,繼續(xù)增加其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不會(huì)對(duì)體系產(chǎn)生影響[11]。綜合考慮五味子乙素得率及提取成本,選取26%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中心點(diǎn)。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)五味子乙素得率及相比的影響(圖4)

反應(yīng)條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、液固比20∶1

由圖4可知,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),五味子乙素得率先升高后降低,相比先穩(wěn)定不變后下降;當(dāng)超聲時(shí)間為45 min時(shí),五味子乙素得率達(dá)到最高,為1.72 mg·g-1,此時(shí)相比為0.83,處于合理范圍內(nèi)。這是因?yàn)?超聲波可破碎五味子細(xì)胞壁,加速成分溶出[12];同時(shí)促進(jìn)雙水相體系中上、下兩相的分相過程,使溶出的五味子乙素在乙醇中充分富集,因此在超聲處理前期五味子乙素得率升高[13];在較高超聲頻率下,超聲時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使五味子乙素得率降低,與Corbin等[14]的研究結(jié)果相吻合,可能是由于超聲導(dǎo)致五味子乙素的降解及異構(gòu)化[15]。綜合考慮,選取45 min作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間的中心點(diǎn)。

2.2.4 液固比對(duì)五味子乙素得率及相比的影響(圖5)

反應(yīng)條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、超聲時(shí)間45 min

由圖5可知,隨著液固比的增大,五味子乙素得率先升高后降低,相比逐漸升高;當(dāng)液固比為30∶1時(shí),五味子乙素得率達(dá)到最高,為1.73 mg·g-1,此時(shí)相比為0.84,處于合理范圍內(nèi)。這是因?yàn)?足量的溶劑可使五味子粉末充分溶脹,從而促進(jìn)溶劑滲入細(xì)胞內(nèi)部,細(xì)胞內(nèi)有效成分?jǐn)U散至細(xì)胞外[16],且溶劑與五味子粉末的充分接觸可強(qiáng)化超聲能量傳遞效率,促進(jìn)有效成分溶出[17];但是液固比過大時(shí),過多的溶劑吸收了超聲能量,使得作用于五味子粉末的能量相對(duì)降低,導(dǎo)致五味子乙素得率下降[18],且會(huì)耗費(fèi)大量的乙醇與硫酸銨。綜合考慮,選取30∶1作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)液固比的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1,設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到二次多項(xiàng)回歸模型方程為:Y=1.74+0.048A+0.027B+0.018C+0.027D-0.048AB-0.002500AC-0.040AD-0.013BC+0.020BD+0.010CD-0.048A2-0.023B2-0.013C2-0.065D2。

2.3.2 方差分析

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。

表3 方差分析

2.3.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)五味子乙素得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對(duì)五味子乙素得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on yield of schisandrin B

響應(yīng)曲面越陡峭、等高線近似橢圓形說明兩因素交互作用對(duì)五味子乙素得率的影響較大;反之則說明影響較小。圖6a和圖6c的響應(yīng)曲面對(duì)角走勢(shì)陡峭,等高線變化范圍大,且近似橢圓形,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液固比的交互作用對(duì)五味子乙素得率的影響顯著,與方差分析結(jié)果相吻合。

2.3.4 最佳工藝的確定及驗(yàn)證

通過Design-Expert軟件分析,酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物的最佳條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)27.45%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.82%、超聲時(shí)間56.30 min、液固比30.98∶1 ,此時(shí)五味子乙素的理論得率為1.76 mg·g-1。

考慮到實(shí)際操作可行性,將超聲時(shí)間調(diào)整為56 min,其它條件不變,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),五味子乙素平均得率為1.77 mg·g-1,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%,說明模型擬合準(zhǔn)確,所得最佳工藝穩(wěn)定、可行。

2.4 多種制備方法的比較

在確定的最佳條件下,分別采用雙水相體系、酶輔助雙水相體系、超聲輔助雙水相體系及酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物,五味子乙素得率(mg·g-1)大小依次為:酶解-超聲雙輔助雙水相體系(1.7600±0.0045)>超聲輔助雙水相體系(1.6300±0.0197)>酶輔助雙水相體系(1.6200±0.0117)>雙水相體系(1.5300±0.0174)。這是因?yàn)?纖維素酶作用于纖維素β-D-葡萄糖苷鍵,催化植物細(xì)胞壁中纖維素降解,促進(jìn)有效物質(zhì)釋放[19];超聲波削弱五味子細(xì)胞壁強(qiáng)度[12],同時(shí)加速雙水相體系的分相過程,使五味子粉末位于上、下兩相中間,形成液-固-液的萃取體系,促進(jìn)五味子乙素在上相的富集[13];酶解-超聲雙輔助雙水相體系同時(shí)具備酶解、超聲、雙水相提取的協(xié)同作用,可有效提高五味子乙素得率[20]。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以五味子乙素得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物的工藝條件,確定最佳條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)27.45%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.82%、超聲時(shí)間56 min、液固比30.98∶1(mL∶g),在此條件下,五味子乙素得率為1.77 mg·g-1,與模型預(yù)測(cè)值(1.76 mg·g-1)接近。酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備的五味子乙素得率顯著高于雙水相體系、酶輔助雙水相體系及超聲輔助雙水相體系,說明前處理可有效促進(jìn)雙水相體系對(duì)五味子乙素的富集。該研究建立的酶解-超聲雙輔助雙水相體系易操作、成本低,是制備五味子提取物的有效方式。