王彥倉 彭二雄

微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物。在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)和應(yīng)用微生物，需要依據(jù)微生物繁殖和代謝的生物學(xué)規(guī)律，提供菌種生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件，同時(shí)需要注意對(duì)種類眾多、分布廣泛的其他微生物進(jìn)行控制。由于材料特殊、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、操作要求較高，高中生物中的微生物實(shí)驗(yàn)往往對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與細(xì)節(jié)操作有著更嚴(yán)格的要求。這就需要教師在微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)創(chuàng)設(shè)真實(shí)、有效的情境，承載實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、有序的任務(wù)引領(lǐng)教學(xué)過程，在準(zhǔn)確把握實(shí)驗(yàn)原理和深刻理解設(shè)計(jì)思路的基礎(chǔ)上進(jìn)行規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作，從而提升學(xué)生的學(xué)科素養(yǎng)。

一、教學(xué)內(nèi)容

微生物的數(shù)量測(cè)定是微生物培養(yǎng)及應(yīng)用的重要內(nèi)容，在食品衛(wèi)生、水源污染度的檢驗(yàn)和土壤含菌量的測(cè)定等方面有著廣泛應(yīng)用。該部分內(nèi)容既包含運(yùn)用選擇培養(yǎng)基篩選目的菌種、運(yùn)用稀釋涂布平板法分離單菌落和進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的理論知識(shí)，也包含了應(yīng)用這些基本原理進(jìn)行土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與探究實(shí)踐，體現(xiàn)了以知促行、知行合一，讓學(xué)生在做中學(xué)、學(xué)中思。

二、教學(xué)目標(biāo)

1.依照科學(xué)探究的要求，應(yīng)用稀釋涂布平板法進(jìn)行微生物數(shù)量測(cè)定的方法，設(shè)計(jì)從土壤中分離分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方案。

2.依據(jù)設(shè)計(jì)的方案，運(yùn)用無菌操作技術(shù)、微生物培養(yǎng)和計(jì)數(shù)的方法分離目標(biāo)菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.嘗試運(yùn)用稀釋涂布平板法和細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法解決生產(chǎn)生活中相關(guān)的實(shí)際問題。

三、教學(xué)設(shè)計(jì)思路（見圖1）

四、教學(xué)過程

（一）復(fù)習(xí)舊知，延續(xù)任務(wù)

師：上節(jié)課學(xué)習(xí)了運(yùn)用稀釋涂布平板法分離土壤中分解尿素的細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)原理和方案，具體過程主要包含哪些環(huán)節(jié)或步驟呢？

生：包括土壤取樣、梯度稀釋、涂布接種、培養(yǎng)觀察。

師：通過以上實(shí)驗(yàn)步驟，我們?cè)谕坎加泻线m濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。運(yùn)用稀釋涂布平板法不但可以分離單菌落，還常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。本節(jié)課主要學(xué)習(xí)運(yùn)用稀釋涂布平板法如何進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定。

（二）問題引導(dǎo)，情境支架

師：結(jié)合下列兩個(gè)問題，觀看應(yīng)用稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣液中大腸桿菌數(shù)目的實(shí)驗(yàn)操作視頻，初步形成應(yīng)用稀釋涂布平板法對(duì)土壤中尿素分解菌計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)思路。

［問題1］請(qǐng)歸納和概述視頻中應(yīng)用稀釋涂布平板法對(duì)大腸桿菌菌液計(jì)數(shù)的環(huán)節(jié)要點(diǎn)。

生：需要先對(duì)擬計(jì)數(shù)樣液進(jìn)行梯度稀釋，選擇一定稀釋范圍的樣液涂布接種；在適宜條件進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察菌落形態(tài)并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目；選擇恰當(dāng)平板的菌落數(shù)目作為結(jié)果，計(jì)算樣液中活菌的數(shù)目。

［問題2］該視頻是對(duì)實(shí)驗(yàn)室中大腸桿菌樣液進(jìn)行的計(jì)數(shù)操作，若要選擇培養(yǎng)土壤中分解尿素的細(xì)菌并計(jì)數(shù)，應(yīng)如何修正實(shí)驗(yàn)操作呢？

生：首先，進(jìn)行接種的菌液并非實(shí)驗(yàn)室保藏，而是土壤取樣后梯度稀釋的樣液。其次，培養(yǎng)過程篩選和分離尿素分解菌，應(yīng)制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。

師：基于以上分析，我們可以形成基本的實(shí)驗(yàn)思路（見圖2）。

（三）任務(wù)驅(qū)動(dòng)，完善方案

［任務(wù)1］與平板劃線法相比，稀釋涂布平板法接種形成的菌落有何特點(diǎn)？為什么通過統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)就能推斷接種樣液中的細(xì)菌數(shù)量呢？

生：在一定稀釋倍數(shù)菌液涂布接種的平板上，菌落分布比較分散和相對(duì)均勻，較少出現(xiàn)相互連接和重疊的現(xiàn)象。當(dāng)樣品稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，我們通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。

教師歸納：這就是稀釋涂布平板法用于測(cè)定微生物數(shù)量的基本原理。因此，這種方法也叫作“活菌計(jì)數(shù)法”。

［任務(wù)2］該實(shí)驗(yàn)操作視頻中，為什么要選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？

生：選擇菌落數(shù)目在30～300之間的平板計(jì)數(shù)，一方面可以避免菌落太多，難以觀察和統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，另一方面也可避免菌落太少而產(chǎn)生的較大誤差。

［任務(wù)3］影響平板上菌落數(shù)目的主要因素是什么？如何得到30～300菌落數(shù)的平板呢？

生：平板上的菌落數(shù)理論上即是接種的樣品稀釋液中活菌的數(shù)，主要受樣品中微生物初始濃度和樣品稀釋倍數(shù)等因素影響。為了得到菌落數(shù)在30～300的平板，我們應(yīng)選用一定稀釋范圍的樣液進(jìn)行接種培養(yǎng)。測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104、105、106倍稀釋的樣液涂布培養(yǎng)。

教師補(bǔ)充：土壤中不同種類微生物的數(shù)量和體積差別較大，這使得統(tǒng)計(jì)微生物數(shù)目時(shí)對(duì)土壤樣液稀釋倍數(shù)的要求也有一定差異。例如，放線菌一般選103、104、105倍的稀釋液，真菌則往往選102、103、104倍的稀釋液。為保證能選擇出菌落為30～300、適于計(jì)數(shù)的平板，我們也可以將稀釋涂布的范圍放寬一點(diǎn)。

［任務(wù)4］該實(shí)驗(yàn)操作視頻中，同一稀釋度的菌液涂布了幾個(gè)平板？為什么？

生：同一稀釋度的菌液至少要涂布3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求該稀釋度下的菌落數(shù)目，以使菌落數(shù)目的統(tǒng)計(jì)更科學(xué)、準(zhǔn)確。

［任務(wù)5］如何判斷平板上生長(zhǎng)的菌落就是分解尿素的細(xì)菌？

生：尿素分解菌將尿素分解成氨，會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH值升高。因此，我們?cè)谥苽湟阅蛩貫槲ㄒ坏吹倪x擇培養(yǎng)基時(shí)，可加入酚紅指示劑來進(jìn)行鑒別。

教師補(bǔ)充：此外，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物往往會(huì)表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征（如形狀、大小和顏色等）。分解尿素的細(xì)菌也有獨(dú)特的菌落特征，我們根據(jù)這些特征可以初步甄別尿素分解菌。

［任務(wù)6］在對(duì)尿素分解菌計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，某實(shí)驗(yàn)小組將10g土樣加入90mL無菌水中制成樣液，再將稀釋105倍的0.1mL菌液涂布培養(yǎng)，得到了菌落數(shù)分別為212、235、228的三個(gè)平板，請(qǐng)估算1g土樣中能分解尿素的細(xì)菌數(shù)是多少。

生：三個(gè)平板的平均菌落數(shù)為225個(gè)。每克土樣中分解尿素的細(xì)菌數(shù)=某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)的平均值÷涂布平板時(shí)吸取的稀釋液體積×稀釋倍數(shù)，則1g土樣中能分解尿素的細(xì)菌數(shù)約為2.25×109個(gè)。

教師：應(yīng)用稀釋涂布平板法估算的微生物數(shù)量，一般比實(shí)際值偏大還是偏小，為什么？

生：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落，因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果常用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。

［任務(wù)7］若某小組測(cè)定土壤中分解尿素細(xì)菌的數(shù)量時(shí)，實(shí)驗(yàn)組平板上菌落平均數(shù)為225個(gè)/平板，而空白對(duì)照組的一個(gè)平板上出現(xiàn)了6個(gè)菌落，能否將219（225-6，即用各平板菌落數(shù)的平均值減去空白平板上的菌落數(shù)）個(gè)/平板作為本組菌落數(shù)的平均值？為什么？

生：不可以。空白平板出現(xiàn)菌落說明實(shí)驗(yàn)中存在一定的污染，但污染原因未知，不同平板上雜菌污染情況不一定相同。

［任務(wù)8］甲、乙兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定某一土壤樣品中微生物的數(shù)量，在同一稀釋倍數(shù)下得到以下結(jié)果：甲同學(xué)涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是110、140和149，取平均值133；乙同學(xué)涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是27、169和176，取平均值124。你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果可信度低，為什么？

生：乙同學(xué)的結(jié)果可信度低。取自同一土樣進(jìn)行規(guī)范操作得到的數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。乙同學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中其中一個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另外兩個(gè)相差懸殊，結(jié)果的重復(fù)性差。

［任務(wù)9］除了稀釋涂布平板法，我們還學(xué)習(xí)過微生物計(jì)數(shù)的什么方法嗎？

生：應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌直接計(jì)數(shù)的方法。

師：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室的高度為0.1 mm，適用于酵母菌、霉菌等相對(duì)較大的細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，還有計(jì)數(shù)室高度在0.02 mm的細(xì)菌計(jì)數(shù)室，可用于對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察和計(jì)數(shù)。二者的計(jì)數(shù)原理相同。

師：與活菌計(jì)數(shù)法相比，該估算結(jié)果偏大還是偏小？為什么？

生：應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)的方法無法區(qū)分死菌與活菌，統(tǒng)計(jì)結(jié)果往往比實(shí)際值偏大。

（四）實(shí)踐操作，拓展應(yīng)用

［實(shí)驗(yàn)操作］在以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上涂布接種104、105、106倍稀釋樣液及蒸餾水對(duì)照組后，每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為依據(jù)，計(jì)算1 g土樣中分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量。

［結(jié)果分析］對(duì)所有小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，分析不同小組結(jié)果差異的原因。

生：取自同一土樣進(jìn)行操作得到的數(shù)據(jù)應(yīng)比較接近。如果差異較大，原因可能是不同小組取樣來源不一樣，也可能是培養(yǎng)計(jì)數(shù)過程中操作不規(guī)范，或者配制的選擇培養(yǎng)基成分不合理等。

［課后任務(wù)］微生物的數(shù)量測(cè)定在實(shí)際的生產(chǎn)生活中有著廣泛應(yīng)用。請(qǐng)選擇身邊與微生物計(jì)數(shù)有關(guān)的實(shí)際問題，或從下列項(xiàng)目中選做一個(gè)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）空氣中微生物總數(shù)（或某細(xì)菌數(shù)目）的檢測(cè)；（2）自來水中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)；（3）牛奶（或酸奶）中細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)；（4）土壤中真菌（或放線菌）的分離與計(jì)數(shù)……

五、教學(xué)反思

與其他實(shí)驗(yàn)更注重原理和步驟不同，微生物實(shí)驗(yàn)需要在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中模擬微生物生長(zhǎng)繁殖的條件來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌種進(jìn)行快速生長(zhǎng)繁殖的過程，同時(shí)需要極力避免無處不在、種類繁多的雜菌的污染。因此，微生物實(shí)驗(yàn)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮湍繕?biāo)菌種的特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)之前設(shè)計(jì)詳盡的實(shí)驗(yàn)方案。本實(shí)驗(yàn)借助對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存樣液中大腸桿菌數(shù)量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)操作情境，引導(dǎo)學(xué)生應(yīng)用類比法掌握對(duì)土壤中分解尿素細(xì)菌的數(shù)量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)思路與基本操作，通過層層遞進(jìn)的任務(wù)群引導(dǎo)學(xué)生應(yīng)用分析與綜合等思維方法，分析應(yīng)用稀釋涂布平板法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)需要注意的細(xì)節(jié)要點(diǎn)，以幫助學(xué)生制訂完整、具體的實(shí)驗(yàn)方案，同時(shí)，為學(xué)生解決有關(guān)的實(shí)際問題提供方法支撐和路徑支持。

（作者單位：甘肅省天水市第一中學(xué)）

編輯：陳鮮艷