張二豪,達(dá)瓦秋宗,徐雨婷,尹 秀,祿亞洲,蔡 皓

(西藏農(nóng)牧學(xué)院,西藏 林芝 860000)

【研究意義】根際是植物根系、土壤和微生物三者緊密結(jié)合、相互影響的微區(qū)域[1]。根際土壤作為植物營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)發(fā)育的重要場(chǎng)所,其微生物群落結(jié)構(gòu)組成及土壤理化因子直接或間接影響藥用植物產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。濕生扁蕾[Gentianopsispaludosa(Hook. f.) Ma]藏藥名“機(jī)合斗”,是一種傳統(tǒng)藏藥材,其味苦、性寒,富含豐富的口山酮類、黃酮類和三萜類化合物[4],具有利膽消黃、清熱解毒,治療膽囊炎、肝炎、腎炎、腸胃炎、腹瀉和流感等功效[5],有重要的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。因此,研究藥用植物根際土壤微生物群落組成與土壤理化因子間的相關(guān)性對(duì)指導(dǎo)濕生扁蕾人工種植和篩選益生微生物類群具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根際土壤微生物在土壤物質(zhì)循環(huán)、能量代謝、植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病和抗逆境等方面扮演重要角色[6]。江美彥等[7]研究表明,根際土壤細(xì)菌芽孢桿菌(Bacillus)和克雷伯氏菌(Klebsiellagrimont)對(duì)白芷的生長(zhǎng)和產(chǎn)量均有顯著的促進(jìn)作用。柴加麗等[8]研究表明,根際土壤細(xì)菌華西腸桿菌(Enterobacterhuaxiensis)和假單胞菌屬(Pseudomonas)對(duì)牧草具有多種促生特性。根際土壤益生微生物不僅能促進(jìn)植物生長(zhǎng),還能促進(jìn)植物中有效活性成分的合成和積累,如圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)和印度梨狀芽孢桿菌(Piriformosporaindica)能顯著提高黃花蒿的生物量及活性成分青蒿素的含量[9];叢枝菌根真菌能促進(jìn)薄荷植物中薄荷醇及羅勒植物中香精油的合成[10-11];嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)和熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)能激發(fā)貫葉連翹次生代謝能力,進(jìn)而提高其藥用成分的產(chǎn)量[12]。根際土壤微生物群落的改變與土壤理化因子密切相關(guān)。研究表明,土壤全氮、全磷、全鉀、速效磷和有機(jī)質(zhì)是影響4種豆科植物根際土壤真菌群落組成的主要環(huán)境因素[13];土壤pH、氮和磷含量影響喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成[14];環(huán)境因子和植物種類是影響藥用植物根際細(xì)菌群落多樣性的主要驅(qū)動(dòng)因素[15]。【本研究切入點(diǎn)】濕生扁蕾作為傳統(tǒng)藏藥材,相關(guān)研究主要集中在對(duì)其有效化學(xué)成分及藥理學(xué)特性等方面,而有關(guān)其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏3個(gè)地區(qū)的濕生扁蕾根際土壤微生物群落組成進(jìn)行分析,探明其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子間的相關(guān)性,旨在為指導(dǎo)濕生扁蕾人工種植及益生微生物菌群的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本試驗(yàn)樣地位于西藏林芝市的工布江達(dá)縣、巴宜區(qū)和察隅縣,各采樣點(diǎn)的地理位置、氣候類型和生態(tài)系統(tǒng)類型如表1所示。

表1 樣地基本概況

1.2 樣品采集

2020年8月在每個(gè)試驗(yàn)樣地按照隨機(jī)多點(diǎn)混合的原則,選擇健康、生長(zhǎng)一致、處于花期的濕生扁蕾植株9株,采用抖根法收集濕生扁蕾根際土壤樣品,并過(guò)直徑2 mm濾篩,將混勻的根際土壤裝入無(wú)菌袋中,并置入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室,每個(gè)采樣地3個(gè)樣品重復(fù),-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 根際土壤理化性質(zhì)測(cè)定

參考鮑士旦[16]的方法測(cè)定根際土壤理化性質(zhì),其中,pH采用酸度電位法進(jìn)行檢測(cè),土壤總磷含量測(cè)定采用鉬銻顯色法,速效磷含量測(cè)定采用鹽酸-氟化銨法,總氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法,速效氮含量測(cè)定采用氯化鉀浸提-分光光度法,總鉀含量測(cè)定采用火焰光度法,速效鉀含量測(cè)定采用醋酸銨浸提-火焰光度計(jì)法,土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法。

1.4 根際土壤樣品總DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用土壤基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司,DP336)對(duì)土壤樣品總DNA進(jìn)行提取,0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA質(zhì)量,用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific, Wilmington,USA)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)利用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增,真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally transcribed spacer,ITS)利用通用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件參考接偉光等[17]的方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和膠回收后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

基于QIIME2(2019.4)分析平臺(tái)對(duì)高通量測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪、去嵌合體、拼接和質(zhì)控處理以獲得高質(zhì)量有效序列;在97%相似度水平下,利用Uparse(7.0.1090)對(duì)OTU(Operational Taxonomic Units)進(jìn)行聚類分析,采用RDP classifier(2.11)貝葉斯算法基于細(xì)菌Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/)和真菌UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 8.0,https://unite.ut.ee/)對(duì)代表OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析,利用Mothur(1.30.2)進(jìn)行Alpha多樣性分析,基于QIIME2(2019.4)分析平臺(tái)和R語(yǔ)言(3.3.1)進(jìn)行物種組成、Beta多樣性和環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析。基于Spearman相關(guān)系數(shù)(|r|>0.6,P<0.05),利用Gephi軟件(V0.9.7)計(jì)算根際土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)性和拓?fù)涮匦訹18-20],利用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

1.6 核心微生物類群的界定

核心微生物類群可以從菌群共存、OTU豐度、功能冗余和系統(tǒng)發(fā)育等多個(gè)角度考慮,本研究參考許國(guó)琪等[21]的方法將3個(gè)樣地中共存的微生物菌群定義為核心微生物菌群?；赗語(yǔ)言(3.3.1)繪制Venn圖來(lái)展示樣本間存在或不存在密切相關(guān)的分類單元,以實(shí)現(xiàn)對(duì)核心微生物菌群的探索[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤理化性質(zhì)

從表2可知,3個(gè)樣地根際土壤pH在6.457～7.530,CY樣品pH最低,偏酸性,而GB和BY樣品偏堿性;CY樣品中總磷和總氮含量最高,顯著高于BY和GB樣品,GB樣品中總磷和總氮含量最低;GB樣品中總鉀含量最高,CY樣品次之,BY樣品最低;CY樣品中速效氮和速效磷含量最高,顯著高于BY和GB樣品,但BY和GB樣品間無(wú)顯著差異;CY樣品中速效鉀含量最高,但與GB樣品無(wú)顯著差異,BY樣品中速效鉀含量最低,且顯著低于CY和GB樣品;3個(gè)樣地根際土壤樣品中有機(jī)質(zhì)含量無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明,3個(gè)樣地根際土壤理化因子存在差異。

表2 濕生扁蕾根際土壤理化因子特征

2.2 根際土壤微生物樣品測(cè)序結(jié)果及多樣性分析

由表3可知,3個(gè)樣地根際土壤細(xì)菌共獲得42 924條有效序列,GB、CY和BY樣品中的有效序列數(shù)均為14 308條,其測(cè)序平均長(zhǎng)度分別為377、377和376 bp,測(cè)序覆蓋度在97.29%～98.02%;3個(gè)樣地根際土壤真菌共獲得144 852條有效序列,GB、CY和BY樣品中的有效序列數(shù)均為48 284條,其測(cè)序平均長(zhǎng)度分別為232、237和238 bp,測(cè)序覆蓋度在99.53%～99.87%,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能反映樣品中真實(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性。在97%相似度水平下,3個(gè)樣地根際土壤共檢測(cè)到4738個(gè)細(xì)菌OTUs,其中GB、CY和BY樣品中分別檢測(cè)到1369、1637和1732個(gè)OTUs;真菌共檢測(cè)到3600個(gè)真菌OTUs,其中GB、CY和BY樣品中分別檢測(cè)到916、1367和1317個(gè)真菌OTUs?？傮w而言,GB樣品中檢測(cè)到的OTUs數(shù)最少,BY樣品中檢測(cè)到的細(xì)菌OTUs數(shù)最多,CY樣品中檢測(cè)到的真菌OTUs數(shù)最多。從圖1可知,GB、CY和BY樣品中共存803個(gè)細(xì)菌OTUs和170個(gè)真菌OTUs,分別占總數(shù)的16.95%和4.72%,GB、CY和BY樣品特有的細(xì)菌OTUs數(shù)分別為158、239和451個(gè),特有的真菌OTUs數(shù)分別為521、753和762個(gè),說(shuō)明不同地區(qū)濕生扁蕾根際土壤微生物群落組成存在差異。從圖2可知,BY樣品根際土壤細(xì)菌和真菌豐富度指數(shù)最高,顯著高于GB樣品,但與CY樣品無(wú)顯著差異;CY樣品根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)最高,顯著高于GB樣品,CY與BY樣品中根際土壤細(xì)菌多樣性無(wú)顯著差異,但其真菌多樣性差異顯著,說(shuō)明不同地區(qū)濕生扁蕾根際土壤微生物多樣性存在差異。主成分分析結(jié)果如圖3所示,PC1和PC2對(duì)根際土壤細(xì)菌的差異解釋率分別為63.42%和29.60%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)93.02%,GB、CY和BY樣品位于不同象限中且距離較遠(yuǎn),說(shuō)明3個(gè)樣地濕生扁蕾根際土壤細(xì)菌群落組成差異較大;PC1和PC2對(duì)根際土壤真菌的差異解釋率分別為59.71%和32.55%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)92.26%,GB、CY和BY樣品位于不同象限中且距離較遠(yuǎn),說(shuō)明3個(gè)樣地濕生扁蕾根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。以上結(jié)果表明,不同地區(qū)濕生扁蕾根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

表3 濕生扁蕾根際土壤微生物OTUs及相關(guān)序列指數(shù)

圖1 濕生扁蕾根際土壤微生物OTUs韋恩圖Fig.1 Venn diagrams of microbial OTUs detected in the rhizosphere soil of G. paludosa

圖2 濕生扁蕾根際土壤微生物Alpha多樣性指數(shù)Fig.2 Alpha diversity indexes of microbial community in rhizosphere soil of G. paludosa

圖3 濕生扁蕾根際土壤微生物主成分分析Fig.3 Principal component analysis of microbial community in the rhizosphere soil of G. paludosa

2.3 根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)根際土壤微生物基因組DNA測(cè)序結(jié)果,4738個(gè)細(xì)菌OTUs隸屬30門(mén)78綱188目308科593屬,3600個(gè)真菌OTUs隸屬15門(mén)51綱133目295科634屬。在門(mén)分類水平,由圖4-A可知,在相對(duì)豐度>1%條件下,GB、CY和BY樣品細(xì)菌共注釋到7個(gè)門(mén),分別是放線菌門(mén)(Actinobacteriota)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)、粘球菌門(mén)(Myxococcota)和芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadota)。在相對(duì)豐度>1%條件下,GB樣品細(xì)菌共注釋到4個(gè)門(mén),分別是放線菌門(mén)(55.21%)、變形菌門(mén)(20.07%)、厚壁菌門(mén)(20.24%)和芽單胞菌門(mén)(1.25%);CY樣品細(xì)菌共注釋到7個(gè)門(mén),分別是放線菌門(mén)(41.70%)、變形菌門(mén)(32.28%)、厚壁菌門(mén)(12.06%)、綠彎菌門(mén)(3.83%)、酸桿菌門(mén)(3.41%)、粘球菌門(mén)(1.20%)和芽單胞菌門(mén)(1.79%);BY樣品細(xì)菌共注釋到6個(gè)門(mén),分別是放線菌門(mén)(37.70%)、變形菌門(mén)(28.68%)、厚壁菌門(mén)(14.19%)、綠彎菌門(mén)(10.99%)、酸桿菌門(mén)(1.50%)和粘球菌門(mén)(2.32%)。以上結(jié)果表明,3個(gè)樣地濕生扁蕾根際土壤細(xì)菌的第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相同,均為放線菌門(mén),但其相對(duì)豐度差異較大,且次優(yōu)勢(shì)菌門(mén)類型和相對(duì)豐度存在差異。由圖4-B可知,在相對(duì)豐度>1%條件下,GB、CY和BY樣品真菌共注釋到6個(gè)門(mén),其中能準(zhǔn)確分類的有5個(gè)門(mén),分別是子囊菌門(mén)(Ascomycota)、被孢菌門(mén)(Mortierellomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、羅茲菌門(mén)(Rozellomycota)和球囊菌門(mén)(Glomeromycota)。在相對(duì)豐度>1%條件下,GB樣品真菌共注釋到5個(gè)門(mén),其中能準(zhǔn)確分類的有4個(gè)門(mén),分別是子囊菌門(mén)(33.89%)、被孢菌門(mén)(29.25%)、擔(dān)子菌門(mén)(28.86%)和羅茲菌門(mén)(4.40%);CY樣品真菌共注釋到4個(gè)門(mén),其中能準(zhǔn)確分類的有3個(gè)門(mén),分別是子囊菌門(mén)(70.42%)、被孢菌門(mén)(13.85%)和擔(dān)子菌門(mén)(13.93%);BY樣品真菌共注釋到6個(gè)門(mén),其中能準(zhǔn)確分類的有5個(gè)門(mén),分別是子囊菌門(mén)(58.99%)、被孢菌門(mén)(8.32%)、擔(dān)子菌門(mén)(5.63%)、羅茲菌門(mén)(16.31)和球囊菌門(mén)(2.74%)。以上結(jié)果表明,3個(gè)樣地濕生扁蕾根際土壤第一優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)相同,均為子囊菌門(mén),但其相對(duì)豐度差異顯著,且次優(yōu)勢(shì)菌門(mén)類型和相對(duì)豐度存在明顯差異。綜上所述,3個(gè)地區(qū)濕生扁蕾根際土壤微生物群落組成存在差異。

圖4 基于門(mén)分類水平濕生扁蕾根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Composition of microbial community in the rhizosphere soil of G. paludosa at phylum level

由圖5-A可知,在GB樣品中,norank_f_67-14是第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,其相對(duì)豐度為9.80%,土壤紅桿菌屬(Solirubrobacte)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)和固定桿菌屬(Conexibacter)是次優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,其相對(duì)豐度分別為8.17%、7.74%和7.66%;芽孢桿菌屬(Bacillus)是CY樣品中的第一優(yōu)勢(shì)菌屬,其相對(duì)豐度為9.47%,鏈霉菌屬(Streptomyces)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)是次優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,其相對(duì)豐度分別為4.40%和4.22%;羅姆布茨菌屬(Romboutsia)是BY樣品中的第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,其相對(duì)豐度為7.21%,norank_f_67-14和固定桿菌屬是次優(yōu)勢(shì)菌屬,其相對(duì)豐度分別為5.77%和4.33%。由圖5-B可知,在GB樣品中,被孢霉屬(Mortierella)是第一優(yōu)勢(shì)菌真屬,其相對(duì)豐度為29.26%,產(chǎn)油菌屬(Solicoccozyma)、青霉菌屬(Penicillium)和擔(dān)子菌酵母屬(Naganishia)是次優(yōu)勢(shì)真菌屬,其相對(duì)豐度分別為11.01%、6.18%和4.41%;在CY樣品中,被孢霉屬是第一優(yōu)勢(shì)菌屬,其相對(duì)豐度為13.84%,燒瓶狀霉屬(Lecythophora)、赤霉菌屬(Gibberella)和截盤(pán)多毛孢屬(Truncatella)是次優(yōu)勢(shì)真菌屬,其相對(duì)豐度分別為5.33%、5.23%和5.09%;在BY樣品中,未分類羅茲菌門(mén)(unclassified_p_Rozellomycota)是第一優(yōu)勢(shì)菌屬,其相對(duì)豐度為15.85%,被孢霉屬和截盤(pán)多毛孢屬是次優(yōu)勢(shì)菌屬,其相對(duì)豐度分別為8.17%和6.19%。以上結(jié)果表明,不同地區(qū)濕生扁蕾根際土壤優(yōu)勢(shì)微生物菌群及其相對(duì)豐度存在明顯差異。

2.4 樣品根際土壤核心微生物菌群分析

由圖6-A可知,在屬分類水平,3個(gè)樣地中共存的核心細(xì)菌屬有322個(gè),占總數(shù)的59.74%,其相對(duì)豐度前10的有norank_f_67-14、固定桿菌屬、芽孢桿菌、土壤紅桿菌屬、Gaiella屬、norank_f_norank_o_Gaiellales、鏈霉菌屬、短芽孢桿菌屬、羅姆布茨菌屬和慢生根瘤菌屬。由圖6-B可知,3個(gè)樣地中共存的核心真菌屬有175個(gè),占總數(shù)的27.60%,其相對(duì)豐度前10的有被孢霉屬、unclassified_p_Rozellomycota、產(chǎn)油菌屬、截盤(pán)多毛孢屬、赤霉菌屬、unclassified_p_Ascomycota、古根菌屬(Archaeorhizomyces)、青霉菌屬、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)和燒瓶狀霉屬。

基于Pearson算法對(duì)根際土壤理化因子與相對(duì)豐度前20的核心微生物菌群進(jìn)行相關(guān)性分析,由圖7-A可知,AK含量與鏈霉菌屬、慢生根瘤菌屬和假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等5個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān),與羅姆布茨菌屬、分枝桿菌屬(Mycobacterium)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)等5個(gè)屬呈顯著負(fù)相關(guān);AP含量與慢生根瘤菌屬、假諾卡氏菌屬和芽孢桿菌屬等4個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān);pH與芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、慢生根瘤菌屬和假諾卡氏菌屬等5個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān),而與分枝桿菌屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān);TK含量與固定桿菌屬、土壤紅桿菌屬、鏈霉菌屬和短芽孢桿菌屬等9個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān),與羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、分支桿菌屬和類諾卡氏菌屬等5個(gè)屬的相對(duì)豐度顯呈著負(fù)相關(guān);TN和TP含量與類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、固定桿菌屬和norank_f_67-14等5個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān),而與芽孢桿菌屬和慢生根瘤菌屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān);AN含量與固定桿菌屬和norank_f_67-14的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān),與慢生根瘤菌屬和norank_f_norank_o_norank_c_MB-A2-108的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān);但SOM含量與相對(duì)豐度前20的核心細(xì)菌菌群間無(wú)顯著相關(guān)性。由圖7-B可知,AK含量與Tausonia屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān),而與Ramophialophora屬、unclassified_k_Fungi和unclassified_p_Rozellomycota的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān);赤霉菌屬和燒瓶狀霉屬等4個(gè)屬的相對(duì)豐度與AP含量顯著正相關(guān);pH與燒瓶狀霉屬和unclassified_p_Ascomycota的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān),而與unclassified_p_Rozellomycota和unclassified_k_Fungi呈顯著正相關(guān);TK含量與被孢霉屬、產(chǎn)油菌屬、青霉菌屬和擔(dān)子菌酵母屬(Naganishia)等7個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān),而與截盤(pán)多毛孢屬(Truncatella)、古根菌屬和Ramophialophora屬等5個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān);TN和TP含量與赤霉菌屬、燒瓶狀霉菌屬和光黑殼屬等6個(gè)屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān),而與青霉菌屬、莖點(diǎn)霉屬、unclassified_o_GS11和擔(dān)子菌酵母屬的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān);AN含量與光黑殼屬、燒瓶狀霉菌屬和unclassified_p_Ascomycota的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān),而與莖點(diǎn)霉屬的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明,SOM含量不影響根際土壤微生物的相對(duì)豐度,但其它環(huán)境因子與微生物的相對(duì)豐度密切相關(guān)。

圖6 基于屬分類水平濕生扁蕾根際土壤微生物韋恩圖Fig.6 Venn diagrams of microbial genus detected in the rhizosphere soil of G. paludosa

*表示P<0.05, **表示P<0.01,***表示P<0.001。下同。* represents P<0.05, ** represents P<0.01, and *** represents P<0.001.The same as below.

2.5 根際土壤微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

從圖8-A可知,3個(gè)樣地根際土壤細(xì)菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在696個(gè)節(jié)點(diǎn)和8950條邊,平均度為25.718,網(wǎng)絡(luò)直徑為13,平均路徑長(zhǎng)度為4.38,平均聚類系數(shù)為0.493,模塊化指數(shù)為0.541,網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu),根際土壤細(xì)菌菌群相對(duì)聚集,其正相關(guān)關(guān)系占比68.22%,負(fù)相關(guān)關(guān)系占比31.78%,說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)中細(xì)菌屬的協(xié)同作用大于拮抗作用。根際土壤細(xì)菌以變形菌門(mén)(35.63%)、放線菌門(mén)(34.91%)、綠彎菌門(mén)(6.47%)、厚壁菌門(mén)(5.46%)、酸桿菌門(mén)(5.32%)和粘球菌門(mén)(4.45%)為主。由圖8-B可知,3個(gè)樣地根際土壤真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在230個(gè)節(jié)點(diǎn)和1737條邊,平均度為15.104,網(wǎng)絡(luò)直徑為16,平均路徑長(zhǎng)度為5.703,平均聚類系數(shù)為0.579,模塊化指數(shù)為0.587,網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu),其正相關(guān)關(guān)系占比79.97%,負(fù)相關(guān)關(guān)系占比20.03%,說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)中真菌屬的協(xié)同作用大于拮抗作用。根際土壤真菌以子囊菌門(mén)(69.13%)、擔(dān)子菌門(mén)(14.78%)和被孢霉門(mén)(6.52%)為主。

由圖9-A可知,核心細(xì)菌與普通細(xì)菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在526個(gè)節(jié)點(diǎn)和4378條邊,平均度為16.646,網(wǎng)絡(luò)直徑為12,平均路徑長(zhǎng)度為4.343,平均聚類系數(shù)為0.627,模塊化指數(shù)為0.699,網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu),核心細(xì)菌屬相對(duì)分散,但與普通細(xì)菌間的相互作用較高,占網(wǎng)絡(luò)總邊數(shù)的49.863%,根際土壤細(xì)菌菌群間以正相關(guān)關(guān)系為主,占比76.31%。從整個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖來(lái)看,根際土壤核心細(xì)菌屬中的隱孢囊菌屬(Cryptosporangium)、貪噬菌屬(Variovorax)、長(zhǎng)孢菌屬(Longispora)、酸桿菌屬(Acidibacter)和Candidatus等處于關(guān)鍵地位。由圖9-B可知,核心真菌與普通真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在567個(gè)節(jié)點(diǎn)和4360條邊,平均度為13.379,網(wǎng)絡(luò)直徑為13,平均路徑長(zhǎng)度為4.399,平均聚類系數(shù)為0.755,模塊化指數(shù)為0.858,網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu),核心真菌屬相對(duì)分散且與普通真菌間的相互作用較低,占網(wǎng)絡(luò)總邊數(shù)的15.688%,根際土壤真菌菌群間以正相關(guān)關(guān)系為主,占比90.41%。從整個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖來(lái)看,根際土壤核心真菌中的Dactylonectria屬、黑星菌屬(Venturia)、Paracylindrocarpon和擔(dān)子菌酵母屬(Naganishia)等處于關(guān)鍵地位。

綠色連線表示負(fù)相關(guān),紅色連線表示正相關(guān),節(jié)點(diǎn)大小與平均度呈正比。下同。The green line indicates the negative correlation, the red line indicates the positive correlation, and the size of node is proportional to the degree.The same as below.

A.核心細(xì)菌-普通細(xì)菌互作分析;B.核心真菌-普通真菌互作分析。A. Interaction analysis of core bacteria-common bacteria; B. Interaction analysis of core fungi-common fungi.

2.6 根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子相關(guān)性分析

由圖10-A可知,根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與pH、AK、TK、TP、TN和AN含量呈顯著正相關(guān),但與SOM含量無(wú)顯著相關(guān)性;根際土壤細(xì)菌α多樣性與TK、TP和TN含量呈顯著正相關(guān),但與其它環(huán)境因子無(wú)顯著相關(guān)性。由圖10-B可知,根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成與SOM含量無(wú)顯著相關(guān)性,但與其它環(huán)境因子呈顯著正相關(guān),根際土壤真菌α多樣性與TK、TP 、TN和AN含量呈顯著正相關(guān),但與其它環(huán)境因子無(wú)顯著相關(guān)性。以上結(jié)果表明,SOM含量不影響根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和α多樣性,TK、TP 和TN含量是影響根際土壤微生物多樣性的關(guān)鍵因子。

圖10 根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和α多樣性與土壤理化因子相關(guān)性Fig.10 Correlation between physical and chemical properties and composition and alpha of microbial community in the rhizosphere soil

3 討 論

根際土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在土壤物質(zhì)循環(huán)、能量代謝、植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病和抗逆境等方面扮演重要角色[6]。微生物多樣性有利于維持微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能多樣性,而微生物群落結(jié)構(gòu)組成調(diào)控土壤行使不同的生態(tài)功能,進(jìn)而影響土壤質(zhì)量[23-24]。研究表明,根際土壤微生物群落組成和多樣性與植物類型、產(chǎn)地、海拔和生態(tài)區(qū)氣候等因素密切相關(guān)[25-26]。本研究結(jié)果表明,3個(gè)產(chǎn)地濕生扁蕾根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性存在差異,共有的細(xì)菌OTUs和真菌OTUs分別為803和170個(gè),僅占總數(shù)的16.95%和4.72%,BY樣品根際土壤細(xì)菌和真菌豐富度指數(shù)最高,而CY樣品根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)最高。根際土壤理化因子是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的關(guān)鍵因素。李茜等[27]研究表明,全鉀含量是影響3年生人參根際土壤細(xì)菌群落組成的主要環(huán)境因子;李思等[28]研究表明pH和全磷影響白木香根際土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性;蘇貝貝等[13]研究表明,全氮、全磷、全鉀、速效磷和有機(jī)質(zhì)是影響4種豆科植物根際土壤真菌群落組成的主要環(huán)境因子。本研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)產(chǎn)地濕生扁蕾根際土壤理化因子存在差異,且TK、TP和TN含量影響根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。在群落結(jié)構(gòu)組成上,3個(gè)產(chǎn)地濕生扁蕾根際土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物類群主要集中在放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、子囊菌門(mén)、被孢霉門(mén)和擔(dān)子菌門(mén),但其相對(duì)豐度差異較大。說(shuō)明根際土壤理化因子和空間因素是導(dǎo)致不同產(chǎn)地濕生扁蕾根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異的關(guān)鍵因素。

有研究表明,核心微生物類群在維持土壤生態(tài)功能穩(wěn)定性和抵御病原菌入侵中扮演重要角色[29-31]。目前,有關(guān)核心微生物組的研究主要集中在屬及屬以上分類水平[32],本研究將3個(gè)產(chǎn)地濕生扁蕾根際土壤中共有的微生物屬定義為核心微生物菌群,從微生物類型上來(lái)看,濕生扁蕾根際土壤核心細(xì)菌菌群種類明顯多于核心真菌菌群。norank_f_67-14、固定桿菌屬、芽孢桿菌、土壤紅桿菌屬、Gaiella屬、norank_f_norank_o_Gaiellales、鏈霉菌屬、短芽孢桿菌屬、羅姆布茨菌屬和慢生根瘤菌屬等是濕生扁蕾根際土壤中的核心細(xì)菌菌群;被孢霉屬、unclassified_p_Rozellomycota、產(chǎn)油菌屬、截盤(pán)多毛孢屬、赤霉菌屬、unclassified_p_Ascomycota、古根菌屬(Archaeorhizomyces)、青霉菌屬、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)和燒瓶狀霉屬等是濕生扁蕾根際土壤中的核心真菌菌群。有研究表明,固定桿菌屬有助于提高土壤可溶性有機(jī)碳含量[33];芽孢桿菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)和藥用成分的合成[34-35];土壤紅桿菌屬與土壤質(zhì)量提升密切相關(guān)[36];慢生根瘤菌屬是禾本科植物中重要的聯(lián)合固氮菌[37];鏈霉菌對(duì)番茄生長(zhǎng)和抗性有促進(jìn)作用[38];青霉菌屬能夠抑制植物病害,并促進(jìn)櫻桃和玉米等植物的生長(zhǎng)[39-40]。以上結(jié)果表明,濕生扁蕾根際土壤核心微生物菌群可能在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、藥用成分合成及增強(qiáng)植物抗逆性和抗病性中扮演重要角色。

微生物網(wǎng)絡(luò)互作分析已被廣泛用于各種環(huán)境微生物間的潛在相互作用研究,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦钥梢苑从澄⑸锶郝浣M成的多樣性和復(fù)雜性,探索微生物群落中的關(guān)鍵類群;關(guān)鍵類群是指生態(tài)功能與相對(duì)豐度不呈正比但在群落中有巨大影響的微生物類群[41-42]。有研究表明,微生物互作對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病原微生物入侵等具有重要意義[43-44]。本研究結(jié)果表明,濕生扁蕾根際土壤微生物具有較強(qiáng)的模塊化結(jié)構(gòu)且以協(xié)同作用為主,根際土壤細(xì)菌關(guān)鍵類群包括變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和粘球菌門(mén),其中變形菌門(mén)和放線菌門(mén)中的關(guān)鍵類群最多,根際土壤真菌關(guān)鍵類群包括子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和被孢霉,其中子囊菌門(mén)中的關(guān)鍵類群最多,這與Wang等[45]的研究結(jié)果相似。變形菌門(mén)和放線菌門(mén)具有固氮、生防、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等功能[46-47],子囊菌門(mén)是參與土壤有機(jī)質(zhì)分解的主要真菌群落,與植物根際氮循環(huán)、植物菌根的形成和植物的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)[48],說(shuō)明這些關(guān)鍵類群在根際土壤中扮演著重要的生物學(xué)功能。核心微生物菌群相對(duì)分散,其核心微生物關(guān)鍵類群主要包括相對(duì)豐度較低的隱孢囊菌屬、貪噬菌屬、長(zhǎng)孢菌屬、Dactylonectria屬、黑星菌屬(Venturia)、Paracylindrocarpon和擔(dān)子菌酵母屬等,說(shuō)明這些相對(duì)豐度較低的核心微生物菌群在根際土壤中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能[41-42]。有研究表明,生物和非生物因子直接作用于核心微生物菌群,通過(guò)微生物群落之間的相互作用將影響傳遞給整個(gè)微生物群落[44],微生物群落間的互作是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息傳遞的基礎(chǔ)[49]。本研究發(fā)現(xiàn),根際土壤核心微生物與普通微生物間具有典型的模塊化結(jié)構(gòu)且以協(xié)同作用為主,這與許國(guó)琪等[21]的研究結(jié)果一致。濕生扁蕾根際土壤核心細(xì)菌與普通細(xì)菌間的互作程度高于核心真菌與普通真菌間的互作程度,說(shuō)明根際土壤細(xì)菌比真菌更加活躍,這可能與根際細(xì)菌參與真菌群落結(jié)構(gòu)塑造有關(guān)[45]。

4 結(jié) 論

不同產(chǎn)地濕生扁蕾根際土壤細(xì)菌和真菌群落組成及多樣性存在差異;總鉀、總磷和總氮含量是影響根際土壤微生物群落組成及多樣性的關(guān)鍵因子;濕生扁蕾根際土壤微生物菌群具有模塊化結(jié)構(gòu)且以協(xié)同作用為主,其關(guān)鍵類群主要包括變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)。本研究闡明了濕生扁蕾根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征,分析了根際土壤理化因子與微生物群落組成、α多樣性和核心微生物菌群間的相關(guān)性,對(duì)充分挖掘益生微生物資源和指導(dǎo)濕生扁蕾人工種植具有重要理論意義。