孔垂思,李友勇,孫云南,尚衛(wèi)瓊,劉本英,楊 濤

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所,昆明 650205;2.云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,云南 勐海 666201;3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650205)

【研究意義】茶樹(shù)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,云南是中國(guó)茶樹(shù)資源最豐富的遺傳多樣性中心[1],氮、磷、鉀是植物生長(zhǎng)需求量較大的礦質(zhì)元素,是植物光合作用順利進(jìn)行的物質(zhì)基礎(chǔ)[2],作為葉用植物,氮、磷、鉀是茶樹(shù)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),土壤是茶樹(shù)生長(zhǎng)的保障,良好的土壤肥力是茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎(chǔ)。因此,揭示高氮磷鉀含量的不同品種茶樹(shù)土壤細(xì)菌群落多樣性形成機(jī)制,優(yōu)化茶樹(shù)種植技術(shù),對(duì)茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能提高茶新梢的光合效率[3-4],遮蔭網(wǎng)構(gòu)建的微氣候、葉面肥噴施、增施有機(jī)肥等措施能增加茶新梢的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。同時(shí)不同采摘標(biāo)準(zhǔn)對(duì)茶新梢的產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大[8],適量增施氮肥、遮蔭及有機(jī)肥均可提升茶新梢的香味品質(zhì)[9-10]。良好的根際微生態(tài)環(huán)境可以提升茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[11-13]。氮是茶樹(shù)需求量最大的營(yíng)養(yǎng)元素,缺氮時(shí)茶樹(shù)干物質(zhì)含量下降,缺磷會(huì)影響茶樹(shù)根莖葉營(yíng)養(yǎng)元素的含量及其分配[14];缺鉀會(huì)導(dǎo)致茶樹(shù)根莖葉重量減少,根冠比增加[15]。研究表明,茶園土壤有機(jī)質(zhì)、有效養(yǎng)分含量降低,會(huì)改變茶樹(shù)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素的平衡,導(dǎo)致碳含量增高,而氮、鉀、鎂、硫、鐵和鋅等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量降低,繼而降低茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[16]。近年來(lái),茶樹(shù)相關(guān)研究主要集中在茶樹(shù)土壤有機(jī)質(zhì)、茶樹(shù)土壤酸化、茶樹(shù)土壤微生物、茶樹(shù)土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面[17-19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前針對(duì)高養(yǎng)分含量不同品種茶樹(shù)的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇云南省西雙版納茶產(chǎn)區(qū)為主的代表性茶園,以不同茶樹(shù)品種為材料,綜合運(yùn)用植物營(yíng)養(yǎng)、土壤化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù),分析高養(yǎng)分含量不同品種茶樹(shù)與常規(guī)型茶樹(shù)土壤養(yǎng)分及其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的差異,闡明高養(yǎng)分含量茶樹(shù)根際土壤細(xì)菌群落多樣性的形成機(jī)制,為茶葉有機(jī)種植生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省西雙版納州勐海縣云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)基地,海拔1160 m,100°27′4.3″ E,21°57′35.6″ N,該區(qū)域?qū)儆跓釒?、亞熱帶西南季風(fēng)氣候,茶葉種植土壤為磚紅壤,土壤理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)48.34 g/kg,全氮1.84 g/kg,全磷0.74 g/kg,全鉀5.21 g/kg,水解性氮155.87 mg/kg,有效磷18.39 mg/kg,速效鉀101.01 mg/kg。

1.2 供試材料

供試材料為云南省西雙版納州勐?？h主栽茶樹(shù)品種,在勐海基地茶園選擇規(guī)模較大、種植多年的茶樹(shù)且種植成片的品種為研究材料,主要茶樹(shù)品種為云抗10號(hào)(MY)、紫娟(MZG)、佛香3號(hào)(MF)、大坪大葉茶(MD),均按照當(dāng)?shù)靥镩g管理進(jìn)行相同管理。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集及處理 在200 m2茶園內(nèi)取4種茶樹(shù)1芽2葉的新梢,每種茶樹(shù)取100株混合為1個(gè)樣品,3個(gè)重復(fù),干燥后用于測(cè)定新梢的氮磷鉀含量,同時(shí)通過(guò)5點(diǎn)取樣法,在對(duì)應(yīng)的茶樹(shù)根際土壤深15 cm處,取1.1 kg土樣,每個(gè)土樣分為2份,其中一份1 kg,用于測(cè)定土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀8個(gè)土壤理化指標(biāo);另一份0.1 kg,放在-80 ℃冰箱保存,用于測(cè)定根際土壤細(xì)菌群落多樣性。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 按照常規(guī)方法進(jìn)行土壤理化指標(biāo)檢測(cè)[20],土壤pH利用玻璃電極法檢測(cè),土壤有機(jī)質(zhì)利用硫酸-重鉻酸鉀容量法檢測(cè),土壤全氮利用凱氏定氮法檢測(cè),土壤全磷利用鉬銻抗比色法檢測(cè),土壤全鉀利用火焰光度法檢測(cè),土壤水解性氮利用堿解擴(kuò)散法檢測(cè),土壤有效磷利用分光光度法檢測(cè),土壤速效鉀利用火焰光度法檢測(cè)。

1.3.3 土壤根際細(xì)菌群落多樣性的16S rDNA高通量分析測(cè)定 每個(gè)樣品稱(chēng)取土樣0.5 g,使用Fast DNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals,LLC)試劑盒提取基因組DNA,并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量,條帶清晰、完整的可直接用于后續(xù)試驗(yàn)。50 μL PCR反應(yīng)體系:2 μL模板DNA、2 μL正向引物(10 μmol/L)、2 μL反向引物(10 μmol/L)、4 μL dNTPs (2.5 μmol/L)、5 μL 10×Pyrobest緩沖液、0.3 μL Pyrobest DNA聚合酶和34.7 μL ddH2O。細(xì)菌16S的PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物為16S:F:(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和R:(5′-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。利用電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

按照基因組DNA文庫(kù)制備程序,將匯集的DNA產(chǎn)物構(gòu)建配對(duì)末端文庫(kù),在Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序,測(cè)序讀長(zhǎng)為PE250。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控,包括低質(zhì)量過(guò)濾、長(zhǎng)度過(guò)濾,得到高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類(lèi),劃分OTUs/ASVs(后面統(tǒng)一稱(chēng)之為Feature),根據(jù)Feature序列組成特征得到其物種分類(lèi)結(jié)果,獲得各樣品在分類(lèi)學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)圖,并通過(guò)Alpha多樣性分析,研究樣品的Ace、Chao、Shannon及Simpson指數(shù)[21]。把不同品種茶樹(shù)新梢氮磷鉀含量、根際土壤理化性質(zhì)、根際土壤細(xì)菌群落作為變量,用軟件SPSS 23.0對(duì)茶樹(shù)新梢氮磷鉀含量、根際土壤養(yǎng)分、根際土壤細(xì)菌群落進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹(shù)品種新梢氮磷鉀差異分析

由表1可知,不同茶樹(shù)品種新梢氮含量最高的是大坪大葉茶(MD),為4.13%;最低的是云抗10號(hào)(MY),為3.77%,不同茶樹(shù)品種新梢氮含量差異顯著。不同茶樹(shù)品種新梢磷含量最高的是佛香3號(hào)(MF),為0.40%,與其它3個(gè)茶樹(shù)品種達(dá)到顯著差異,但3個(gè)茶樹(shù)品種間差異不顯著。不同茶樹(shù)品種新梢鉀含量最高的是紫娟(MZG),為2.78%;最低的是佛香3號(hào),為1.96%,不同茶樹(shù)品種新梢鉀含量差異顯著。

表1 不同茶樹(shù)品種新梢氮磷鉀含量的LSD分析

2.2 不同茶樹(shù)品種根際土壤養(yǎng)分差異分析

由表2可知,不同茶樹(shù)品種中,氮含量高的茶樹(shù)品種MD根際土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、水解性氮含量均較高,分別為5.17、68.50 g/kg、2.83 g/kg、241.33 mg/kg,高于其他茶樹(shù)品種。磷含量高的品種MF根際土壤的全磷、有效磷含量均較高,分別為1.63 g/kg、115.67 mg/kg,高于其他品種茶樹(shù)。鉀含量高的品種MZG根際土壤的全鉀、速效鉀含量較高,分別為5.20 g/kg、122.00 mg/kg。

表2 不同茶樹(shù)品種根際土壤養(yǎng)分的LSD分析

續(xù)表2 Continued table 2

2.3 不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌群落多樣性

針對(duì)不同茶樹(shù)品種根際土壤樣品細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序,共得到340 391條序列,過(guò)濾去除嵌合體后,得到339 219條序列,序列長(zhǎng)度以351～474 bp為主,其中氮含量高的茶樹(shù)品種MD獲得的序列最多,為 75 631條;品種MY獲得序列最少,為64 975條。

如圖1所示,不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)呈水平狀態(tài),說(shuō)明增加測(cè)序量,土壤樣本細(xì)菌的多樣性趨于穩(wěn)定,能反映茶樹(shù)根際土壤細(xì)菌群落多樣性水平。不同茶樹(shù)品種中,含氮量高的茶樹(shù)品種MD根際土壤Shannon指數(shù)最高,說(shuō)明其細(xì)菌群落多樣性水平最高。Simpson 指數(shù)分析(圖2)表明,氮含量高的茶樹(shù)品種MD根際土壤的Simpson 指數(shù)最低;與Shannon指數(shù)相反,Simpson 指數(shù)最低代表有高的細(xì)菌群落多樣性,表明氮含量高的茶樹(shù)根際土壤具有高的細(xì)菌群落多樣性。如圖3所示,不同茶樹(shù)品種中,鉀含量高的茶樹(shù)品種MZG根際土壤的Ace與Chao1 指數(shù)趨勢(shì)相同,其Ace及Chao1指數(shù)最高,分別為 1141、1168,表明鉀含量高的茶樹(shù)根際土壤具有高細(xì)菌群落豐富度。

圖1 不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)Fig.1 Shannon index of bacteria in rhizosphere soil of different tea tree varieties

圖2 不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌辛普森指數(shù)Fig.2 Simpson index of bacteria in rhizosphere soil of different tea tree varieties

圖3 不同茶樹(shù)品種土壤細(xì)菌豐富度比較Fig.3 Comparison of bacteria abundance in rhizosphere soil of different tea tree varieties

2.4 不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

如圖4所示,不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)基本相同,所有根際土壤主要含變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、Candidate_division_WPS-2、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)等。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群有變形桿菌門(mén)(占比22.32%～39.95%)、酸桿菌門(mén)(占比21.15%～36.68%)、放線(xiàn)菌門(mén)(占比13.19%～19.10%)、綠彎菌門(mén)(占比0.75%～4.05%)、疣微菌門(mén)(占比0.61%～4.10%)、擬桿菌門(mén)(占比0.50%～4.82%)、芽單胞菌門(mén)(占比0.51%～3.17%)、浮霉菌門(mén)(占比0.50%～3.21%)、Candidate_division_WPS-2(占比0.37%～2.03%);厚壁菌門(mén)(占比0.53%～1.12%);藍(lán)藻門(mén)(占比0.11%～2.17%);以上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群占總相對(duì)豐度的71.14%～89.53%。不同茶樹(shù)品種中,氮含量高的茶樹(shù)品種MD根際土壤中變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、疣微菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、浮霉菌門(mén)的相對(duì)豐度較高。磷含量高的茶樹(shù)品種MF根際土壤中放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)的相對(duì)豐度較高。鉀含量高的茶樹(shù)品種MZG根際土壤變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度較高。

圖4 不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌群落(門(mén)水平)Fig.4 The bacterial community in rhizosphere soil of different tea tree varieties (at phylum level)

2.5 茶樹(shù)新梢氮磷鉀含量與根際土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

由表3可知,茶樹(shù)新梢氮含量與根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.706、0.825,呈顯著正相關(guān)。茶樹(shù)新梢磷與根際土壤有效磷的相關(guān)系數(shù)為0.962,呈顯著正相關(guān)。新梢鉀含量與根際土壤全鉀、速效鉀的相關(guān)系數(shù)分別為0.965、0.852,均呈顯著正相關(guān)。

表3 茶樹(shù)新梢氮磷鉀含量與根際土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

2.6 茶樹(shù)新梢氮磷鉀含量與根際土壤細(xì)菌群落相關(guān)性分析

由表4可知,茶樹(shù)根際土壤變形桿菌門(mén)與新梢鉀含量的相關(guān)系數(shù)為0.798,呈顯著正相關(guān)。放線(xiàn)菌門(mén)與新梢磷含量的相關(guān)系數(shù)為0.995,呈極顯著正相關(guān)。綠彎菌門(mén)與新梢氮含量的相關(guān)系數(shù)為0.843,呈顯著正相關(guān)。浮霉菌門(mén)與新梢磷含量的相關(guān)系數(shù)為0.720,呈顯著正相關(guān)。厚壁菌門(mén)與新梢磷含量的相關(guān)系數(shù)為0.916,呈顯著正相關(guān)。藍(lán)藻門(mén)與新梢磷含量的相關(guān)系數(shù)為0.860,呈顯著正相關(guān)。

表4 茶樹(shù)新梢氮磷鉀含量與根際土壤細(xì)菌群落相關(guān)性分析

續(xù)表4 Continued table 4

2.7 茶樹(shù)根際土壤養(yǎng)分與根際土壤細(xì)菌群落相關(guān)性分析

由表5可知,茶樹(shù)根際土壤變形桿菌門(mén)與根際土壤速效鉀含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.678,放線(xiàn)菌門(mén)與根際土壤有效磷呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.616,綠彎菌門(mén)與pH、有機(jī)質(zhì)、水解性氮呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.707、0.887、0.852,浮霉菌門(mén)與根際土壤速效鉀含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.725,厚壁菌門(mén)與根際土壤有效磷含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.692,藍(lán)藻門(mén)與根際土壤有效磷含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.525。

表5 茶樹(shù)根際土壤養(yǎng)分與細(xì)菌群落相關(guān)性分析

3 討 論

茶樹(shù)生長(zhǎng)特性被認(rèn)為是茶園土壤酸化形成的原因之一[22]。本研究結(jié)果表明,不同茶樹(shù)品種新梢氮磷鉀含量達(dá)到顯著差異。不同茶樹(shù)品種根際土壤養(yǎng)分含量存在差異,土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全鉀、有效磷、速效鉀是造成茶樹(shù)養(yǎng)分差異的重要土壤因子,羅凡等[23]研究也表明,不同茶樹(shù)品種新梢氮磷鉀含量差異較大。

根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)、水解性氮、有效磷、速效鉀含量是對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大的環(huán)境因子,不同種類(lèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。不同茶樹(shù)品種既有與土壤酸度呈顯著正相關(guān)的細(xì)菌,也有與土壤酸度呈顯著負(fù)相關(guān)的細(xì)菌[24]。茶園土壤微生物主要以酸桿菌為主[25]。土壤氮及水解性氮是影響茶園土壤細(xì)菌多樣性的主要環(huán)境因子[26],本研究表明,不同茶樹(shù)品種根際土壤速效鉀含量是影響變形桿菌門(mén)相對(duì)豐度的因素之一;根際土壤有效磷含量是影響放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度的因素之一;根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)、水解性氮含量是影響綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度的因素之一;根際土壤速效鉀含量是影響浮霉菌門(mén)相對(duì)豐度的因素之一;根際土壤有效磷含量是影響厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度的因素之一;根際土壤有效磷含量是影響藍(lán)藻門(mén)相對(duì)豐度的因素之一。

細(xì)菌群落豐富度、細(xì)菌群落多樣性是不同茶樹(shù)品種養(yǎng)分差異形成的重要環(huán)境因子。研究表明,不同茶樹(shù)品種根際土壤細(xì)菌、優(yōu)勢(shì)菌群以變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)等為主[26],而本研究認(rèn)為,變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)是不同茶樹(shù)品種養(yǎng)分差異的主要土壤微生物因子。不同茶樹(shù)品種中,鉀含量高的茶樹(shù)根際土壤具有較高群落豐富度,且其根際土壤中變形桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)的相對(duì)豐度較高,主要是由于具有較高的土壤速效鉀含量。說(shuō)明提高根際土壤速效鉀含量,可提高土壤中變形桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)的相對(duì)豐度,從而提高了茶樹(shù)鉀含量。不同茶樹(shù)品種中,磷含量高的茶樹(shù)根際土壤中放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)的相對(duì)豐度較高,主要是由于較高的土壤有效磷含量。說(shuō)明通過(guò)提高根際土壤有效磷含量可提高根際土壤中放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)的相對(duì)豐度,從而提高茶樹(shù)磷含量。

不同茶樹(shù)品種中,氮含量高的茶樹(shù)根際土壤具有較高的細(xì)菌群落多樣性,且其根際土壤中綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度較高,主要是因其具有較高的土壤pH、有機(jī)質(zhì)和水解性氮含量。土壤pH、水解性氮是影響茶園土壤細(xì)菌多樣性的主要環(huán)境因子[24-26],通過(guò)根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)、水解性氮含量的提高,提高根際土壤中綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度,從而提高茶樹(shù)氮含量。pH較高的石灰?guī)r土壤栽培茶樹(shù),有利于其新梢的生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)葉綠素的合成,提高其新梢光合能力[28]。施用有機(jī)肥能明顯提高土壤有機(jī)質(zhì)含量,減小土壤容重,同時(shí)有減緩?fù)寥浪峄厔?shì),明顯提升茶園土壤質(zhì)量[29]。有研究表明,茶樹(shù)土壤的有機(jī)質(zhì)與水解性氮含量呈極顯著正相關(guān)[30]。適當(dāng)增加氮肥的施用能提高根際土壤的細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌數(shù)量,增加根際微生物數(shù)量,改善根際微生物群落多樣性水平[31]。

4 結(jié) 論

不同茶樹(shù)品種新梢氮磷鉀含量存在差異,其根際土壤養(yǎng)分含量也存在差異,在不同茶樹(shù)品種中,新梢氮磷鉀含量高的茶樹(shù)根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全鉀、有效磷、速效鉀的含量較高,進(jìn)而其細(xì)菌群落豐富度、細(xì)菌群落多樣性較大。在不同茶樹(shù)品種中,高養(yǎng)分含量茶樹(shù)根際土壤中變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)的細(xì)菌群落相對(duì)豐度較高。