李小鳳,韋 悠,羅思思,謝志勤,阮志華,張民秀,黃嬌玲,李 丹,萬(wàn)麗軍,李 孟,任紅玉,謝麗基,謝芝勛

(廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(guó)(廣西)—東盟跨境動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530001)

【研究意義】禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)通常感染5周齡以下的肉雞[1],被感染肉雞呈現(xiàn)心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HHS),其病理特征是心包內(nèi)有透明或草莓色積液,肺水腫,肝臟腫脹變色,腎臟膨脹,伴有局灶性壞死和點(diǎn)狀出血。近年來(lái),FAdV-4疫情在中國(guó)雞群中多次暴發(fā),致死率高達(dá)80%[1-2],對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅。病毒在感染宿主后,宿主會(huì)啟動(dòng)抗病毒的免疫應(yīng)答系統(tǒng)來(lái)抑制病毒復(fù)制。了解FAdV-4編碼蛋白與宿主感染之間的相互作用有利于闡釋致病機(jī)制和開發(fā)新穎、有效的治療方案?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】禽腺病毒為無(wú)囊膜雙鏈DNA病毒,病毒粒子直徑70～90 nm,呈正二十面體結(jié)構(gòu),每個(gè)病毒粒子由252個(gè)衣殼粒組成[3]。其中,Hexon、Peton和Fiber是衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白,核衣殼蛋白還包括pX、pⅥ、pⅦ和pVⅢ。Hexon蛋白因其抗原決定簇和中和血清的特性,常被用作研究分子流行病學(xué)的靶標(biāo)[4]。Penton蛋白在感染過(guò)程中附著于宿主細(xì)胞,依賴宿主細(xì)胞表面整合素介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞[5];Shah等[6]研究表明,Penton蛋白作為亞單位疫苗免疫2周齡無(wú)特定病原(Specific pathogen free,SPF)雞,對(duì)攻毒試驗(yàn)雞有90%的保護(hù)率,說(shuō)明其有作為亞單位疫苗的潛力。纖突蛋白Fiber分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域(頭部、頸部、尾部),不同血清型的Fiber蛋白差異較大,FAdV-1、FAdV-4和FAdV-10有2個(gè)纖突蛋白,分別為Fiber-1和Fiber-2。Pan等[7]研究表明,在病毒感染過(guò)程中,Fiber-1蛋白頭部與宿主受體CAR結(jié)合促進(jìn)病毒侵入宿主,Fiber-2促進(jìn)病毒復(fù)制;韋悠等[8]研究發(fā)現(xiàn)Fiber-2截短重組蛋白及單克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性和特異性,可用于FAdV-4病毒檢測(cè)試劑盒研發(fā)。Ⅲα蛋白調(diào)節(jié)病毒侵入宿主細(xì)胞,協(xié)助病毒粒子的組裝成熟[9]。pX是由腺病毒晚期編碼的一種富含精氨酸殘基的高堿性蛋白[10],包含核和核仁定位信號(hào)序列[11]。此外,pX含有2個(gè)腺病毒蛋白酶切割位點(diǎn)[12],且其前體非共價(jià)結(jié)合病毒[13],并與病毒其他核心蛋白一起參與濃縮病毒基因組[14];人腺病毒pX能調(diào)節(jié)E2蛋白的積累[12];pX在病毒復(fù)制過(guò)程中參與將線性雙鏈DNA基因組帶到衣殼的過(guò)程[15-16];Zhao等[17]研究證實(shí),FAdV-4 pX是誘導(dǎo)雞肝癌細(xì)胞(LMH)壞死的主要因子。以上研究證實(shí),pX和其他編碼蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但pX與宿主的天然免疫關(guān)系尚不清楚。病毒感染宿主后,宿主細(xì)胞啟動(dòng)天然免疫系統(tǒng)利用一系列模式識(shí)別受體(Patterns recognition receptors,PPRs)識(shí)別病毒。PRRs包括Toll樣受體、MDA5和cGAS受體[18-19]。PRRs識(shí)別病毒核酸后,激活下游信號(hào)通路,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)及炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6、IL-8和IL-15)產(chǎn)生,抑制病毒復(fù)制。雖然FAdV-4能引起宿主的天然免疫應(yīng)答,但是也能逃避宿主強(qiáng)大的先天免疫反應(yīng),甚至進(jìn)化出各種防御機(jī)制來(lái)保證自身的生存和復(fù)制。為研究FAdV-4編碼蛋白與宿主天然免疫信號(hào)通路的關(guān)系,廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室先后進(jìn)行FAdV-4全病毒感染LMH細(xì)胞試驗(yàn)及病毒Fiber-1、Peton、22k、52k等重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞后病毒感染試驗(yàn),檢測(cè)天然免疫相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平[20]。綜上所述,FAdV-4編碼蛋白在逃逸宿主天然免疫系統(tǒng)的識(shí)別和影響病毒感染進(jìn)程等方面發(fā)揮著重要作用。【本研究切入點(diǎn)】在廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)室課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)FAdV-4強(qiáng)毒株感染LMH細(xì)胞和SPF雞后,Toll樣受體及效應(yīng)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化[21-22],說(shuō)明FAdV-4感染與宿主的天然免疫模式識(shí)別受體及其效應(yīng)因子產(chǎn)生密切相關(guān)。已有研究表明pX具有結(jié)合病毒的功能[13],并參與濃縮病毒基因組[14],但在這些過(guò)程中,宿主天然免疫系統(tǒng)的作用尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以FAdV-4 pX蛋白為研究對(duì)象,構(gòu)建pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)10種Toll樣受體及6種效應(yīng)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平,探討FAdV-4 pX蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中和宿主天然免疫之間的相互作用,為進(jìn)一步闡釋FAdV-4感染致病機(jī)制和免疫應(yīng)答機(jī)理提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 FAdV-4(FAdV-4-GX2019-010株)、LMH細(xì)胞和PEF1α-HA載體均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 PrimeSTAR?GXL PremiX Fast、Prime Script RT Master MiX、PMD18-T載體、TaKaRa DNA Ligation Kit Long、EcoR Ⅰ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine 3000)、HA標(biāo)記小鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;Universal Genomic DNA Kit購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;Gene JET RNA Purification Kit、2×SYBR Green Master MiX購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像分析儀(型號(hào)為Gel DocTMXR+)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;超微量分光光度計(jì)(型號(hào)NanoDrop2000)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)Quant Studio 5)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;倒置熒光顯微鏡(型號(hào)ECLIPSETi2-U)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考廣西獸醫(yī)生物技術(shù)室分離FAdV-4-GX2019-010株(登錄號(hào)MW439 040)已測(cè)得的X基因編碼區(qū)序列,使用Oligo 7.37設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。上游引物:5′-ccggaattcggATGCCCGCCGTGCTTTTGAC-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),下游引物:5′-cccggtaccTCACTTGTTGCCATACAACTTATTG-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點(diǎn)),引物委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA抽提與X基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增 參照病毒Universal Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明書對(duì)FAdV-4病毒液進(jìn)行DNA提取。以提取的DNA為模板,用PCR擴(kuò)增X基因編碼區(qū)序列。反應(yīng)體系為50 μL:2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL,上下游引物各1 μL(引物濃度10 μmol/L),DNA模板3 μL,無(wú)核酸酶水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離得到目的條帶。

1.2.3 pEF1α-HA-X表達(dá)載體構(gòu)建 目的條帶經(jīng)膠回收后,與pMD18-T載體于16 ℃連接過(guò)夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,篩選陽(yáng)性克隆,搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定,將鑒定正確的樣品送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序,正確的重組質(zhì)粒命名為T-X。

在37 ℃恒溫下,用EcoR Ⅰ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶酶切pEF1α-HA載體和T-X重組質(zhì)粒4 h,切膠回收目的片段,并將二者于16 ℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證,篩選插入完全正確的表達(dá)質(zhì)粒,并命名為pEF1α-HA-X。

1.2.4 pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞 LMH細(xì)胞按約1×106個(gè)/mL的數(shù)量接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待LMH細(xì)胞鋪滿80%～90%,棄掉培養(yǎng)基,PBS洗2遍。分別將質(zhì)粒pEF1α-HA-X(試驗(yàn)組)和pEF1α-HA(對(duì)照組)與轉(zhuǎn)染試劑混勻(2 μg/孔),孵育30 min后轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞,作用4 h,補(bǔ)加2 mL 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,LMH細(xì)胞狀態(tài)良好,以MOI=0.01的FAdV-4進(jìn)行刺激1～2 h,棄去病毒液,加入病毒維持液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以下試驗(yàn)是在FAdV-4感染24 h后收集LMH細(xì)胞進(jìn)行,同時(shí)設(shè)立pEF1α-HA-X與pEF1α-HA不添加病毒刺激組。添加病毒刺激組分別標(biāo)記為pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+,不加病毒刺激分別標(biāo)記為pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。

1.2.5 pX重組蛋白Western-blotting和間接免疫熒光驗(yàn)證 Western-blotting方法:收集細(xì)胞后用RIPA裂解液裂解,獲得蛋白混合液樣品,重組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜,用4%脫脂乳室溫封閉4 h,棄除封閉液,加入HA標(biāo)記小鼠源單克隆抗體(1∶2000),于4 ℃孵育過(guò)夜,次日用PBST洗膜4次,再加入按HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(1∶2000),室溫孵育1 h,用PBST洗膜4次,用DAB試劑顯色拍照。

間接免疫熒光方法:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞48 h后,棄除培養(yǎng)基,依次使用4%多聚甲醛固定15 min,通透液(Triton X-100)孵育15 min,封閉液封閉1 h。棄除封閉液,按500 μL/孔加入HA標(biāo)記小鼠源單克隆抗體(1∶500),4 ℃孵育過(guò)夜。棄除一抗,PBS洗3遍。按500 μL/孔加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1∶1000),室溫孵育1 h。棄除二抗,PBS洗3遍,用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.6 LMH細(xì)胞RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄 收集細(xì)胞,參照Gene JET RNA Purification Kit抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA抽提,超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度,進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL:5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,無(wú)核酸酶水補(bǔ)至20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定 得到的cDNA稀釋10倍后作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,反應(yīng)體系為20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free水6 μL。反應(yīng)程序:50 ℃激活2 min,95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,60 ℃延伸1 min,共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。以β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)為內(nèi)參基因,檢測(cè)chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21、IFN-α、INF-β、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-15的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,引物信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 將獲得的試驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因及β-actin的Ct值,代入2-ΔΔCt公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,計(jì)算公示為:

△Ct(試驗(yàn)組)=Ct(試驗(yàn)組目的基因)-Ct(試驗(yàn)組內(nèi)參基因);

△Ct(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因);

△△Ct=△Ct(試驗(yàn)組)-△Ct(對(duì)照組)。

添加病毒刺激組與未加病毒刺激組分別計(jì)算結(jié)果,表達(dá)量的差異倍數(shù)使用2-ΔΔCt。最后利用IBM SPSS statistics 2.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Studentt差異性分析,P<0.05判斷為差異顯著,用*標(biāo)注,P<0.01判斷為差異極顯著,用**標(biāo)注。采用Prism 8制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 X基因編碼區(qū)序列PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定

以病毒基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離可獲得大小約為540 bp的條帶(圖1),與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序分析顯示,FAdV-4的X基因開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)540 bp,共編碼179個(gè)氨基酸殘基,與本實(shí)驗(yàn)室上傳到GenBank的血清4型禽腺病毒X基因(登錄號(hào)MN577984.1)核苷酸序列相似性為100%。

2.2 pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后得到540 bp片段,說(shuō)明X基因目的片段已經(jīng)正確插入pEF1α-HA載體(圖2)。經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測(cè)序,結(jié)果顯示插入的X基因大小、位置、ORF均正確,表明pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 pX重組蛋白Western-blotting和間接免疫熒光驗(yàn)證結(jié)果

pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒(試驗(yàn)組)和pEF1α-HA空質(zhì)粒(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞48 h后,Western-blotting結(jié)果顯示,試驗(yàn)組裂解出來(lái)的蛋白與HA標(biāo)記小鼠源單克隆抗體特異性反應(yīng),在27 kD處有一特異條帶,而對(duì)照組在此處沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖3)。間接免疫熒光結(jié)果顯示,試驗(yàn)組的細(xì)胞可見大量綠色熒光,而對(duì)照組沒(méi)有綠色熒光(圖4)。說(shuō)明pX重組蛋白在LMH細(xì)胞中正確表達(dá)。

M: Trans 2K DNA標(biāo)記;1～4: X基因擴(kuò)增產(chǎn)物。M:Trans 2K DNA Marker; 1-4: X gene PCR amplification products.

M:Trans 8K DNA標(biāo)記;1～4:pEF1α-HA-X雙酶切產(chǎn)物。M: Trans 8K DNA Marker; 1-4:Double enzyme digestion of pEF1α-HA-X products.

2.4 FAdV-4 pX對(duì)LMH細(xì)胞Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞48 h后,所檢測(cè)的10 種chTLRs表達(dá)量與相應(yīng)的對(duì)照組相比出現(xiàn)不同程度上調(diào)(圖5)。與pEF1α-HA-組相比,pEF1α-HA-X-組chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P<0.01,下同),分別為pEF1α-HA-組的9.76和12.34倍;chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05,下同),chTLR3和chTLR4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá),但差異不顯著(P>0.05,下同)。與pEF1α-HA+組相比,pEF1α-HA-X+組chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a和chTLR2b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào),分別為pEF1α-HA+組的3.78、4.10、6.70和5.57倍;chTLR3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),為pEF1α-HA+組的3.09倍;而chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與pEF1α-HA+組差異不顯著。與pEF1α-HA-X-組相比,pEF1α-HA-X+組chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào),分別下調(diào)60.0%和66.7%;chTLR2a、chTLR2b和chTLR3轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)2.91、2.01和1.47倍,其他chTLRs的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),但差異不顯著。FAdV-4感染pX過(guò)表達(dá)LMH細(xì)胞24 h后,pX能促進(jìn)chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),并抑制其他chTLRs的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

M:蛋白標(biāo)記(11～180 kD);1:pEF1α-HA-X質(zhì)粒; 2:pEF1α-HA空質(zhì)粒。M: Protein Marker(11-180 kD);1: pEF1α-HA-X plamid;2:PEF1α-HA empty plamid.

圖4 pX重組蛋白的間接免疫熒光驗(yàn)證結(jié)果(100×)Fig.4 Indirects immunoflurescence identification result of pX recombinant protein (100×)

2.5 FAdV-4 pX對(duì)LMH細(xì)胞效應(yīng)因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

細(xì)胞效應(yīng)因子檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示,未添加FAdV-4感染時(shí),與pEF1α-HA-組相比較,pEF1α-HA-X-組IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-15的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高;IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著提高,為pEF1α-HA-組的11.6倍;IFN-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),但差異不顯著。添加FAdV-4感染24 h后,與pEF1α-HA+組相比,pEF1α-HA-X+組干擾素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-1β和IL-8)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著提高,分別為pEF1α-HA+組的2.90、2.77、3.10和3.3倍;IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,為對(duì)照組的2.54倍(P<0.05);IL-15的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與pEF1α-HA+組差異不顯著。與pEF1α-HA-X-組相比,pEF1α-HA-X+組IFN-α、IFN-β和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,分別提高2.03、1.05和1.55倍;而IL-6、IL-8和IL-15表達(dá)量下調(diào),其中IL-8極顯著下調(diào)71.29%。上述結(jié)果說(shuō)明,pX在LMH細(xì)胞過(guò)表達(dá)后,受到病毒感染時(shí),能促進(jìn)或抑制細(xì)胞效應(yīng)因子表達(dá),說(shuō)明pX對(duì)宿主細(xì)胞的天然免疫有激活作用,也有自己逃逸天然免疫的策略。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同。 * indicates significant differences(P<0.05), and ** indicate extremely significant differences(P<0.01).The same as below.

圖6 FAdV-4 pX對(duì)效應(yīng)因子mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of FAdV-4 pX on the mRNA expressions of the cytokines

3 討 論

本研究中,pEF1α-HA-X重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞后,無(wú)論是否被病毒感染,所檢測(cè)的10 種chTLRs受體與相應(yīng)對(duì)照組相比都有不同程度地上調(diào)表達(dá)。其中,chTLR1a和chTLR1b轉(zhuǎn)錄水平在2種情況下均極顯著上調(diào),與廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)室課題組前期研究FAdV-4感染LMH細(xì)胞 24 h后,chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高一致。病毒刺激后,chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平反而下降,推測(cè)是因?yàn)閜X在LMH細(xì)胞過(guò)表達(dá)后,pX具有一定毒性,宿主細(xì)胞的免疫系統(tǒng)被激活,而在病毒感染后,病毒編碼的蛋白抑制chTLR1a和chTLR1b轉(zhuǎn)錄表達(dá),幫助病毒逃逸宿主天然免疫系統(tǒng)的攻擊。pX重組蛋白在LMH細(xì)胞過(guò)表達(dá)后,pEF1α-HA-X-組的chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比pEF1α-HA-組顯著上調(diào),說(shuō)明pX蛋白過(guò)表達(dá)后能促進(jìn)上述受體的表達(dá),激活宿主天然免疫系統(tǒng)。值得注意的是,chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在FAdV-4刺激后反而下降,原因可能是病毒與宿主相互作用過(guò)程中,宿主啟動(dòng)的天然免疫系統(tǒng)對(duì)受體的選擇有偏好性,同時(shí)病毒也有可能通過(guò)其他途徑抑制上述受體表達(dá)來(lái)逃逸宿主天然免疫的攻擊,順利完成復(fù)制和生存。pX蛋白在LMH細(xì)胞過(guò)表達(dá)并添加FAdV-4感染后,與pEF1α-HA-X-組相比,pEF1α-HA-X+組chTLR2a和chTLR2b的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào),chTLR3的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),說(shuō)明chTLR2a、chTLR2b和chTLR3參與調(diào)控宿主天然免疫應(yīng)答過(guò)程,可作為研究宿主識(shí)別FAdV-4感染的模式識(shí)別受體。chTLR1a和chTLR1b,chTLR2a和chTLR2b分別由TLR1、TLR2分化而來(lái),當(dāng)TLR1和TLR2結(jié)合后能識(shí)別細(xì)菌脂多糖[23]。本研究發(fā)現(xiàn),在同等情況下,chTLR1a和chTLR1b,chTLR2a和chTLR2b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比其他受體轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)更明顯,可能在LMH細(xì)胞抗FAdV-4感染過(guò)程中,TLR1和TLR2聯(lián)合發(fā)揮作用。病毒感染后,chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),chTLR2a和chTLR2b的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),推測(cè)是由于兩者在抑制病毒復(fù)制的分工不同。TLR3是核內(nèi)保守性較強(qiáng)的功能蛋白,在抗病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可以識(shí)別病毒和雙鏈RNA[24]。TLR3是唯一完全依賴于β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)的核糖核酸傳感器,介導(dǎo)I型干擾素、促炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo),從而共同建立宿主的抗病毒反應(yīng)[25]。本研究結(jié)果顯示,與pEF1α-HA-X-組相比較,pEF1α-HA-X+組chTLR3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,推測(cè)chTLR3除了可以識(shí)別病毒RNA外,也可以識(shí)別FAdV-4基因組DNA在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的RNA中間體,從而抑制病毒復(fù)制。

此外,病毒攻擊宿主后,宿主天然免疫系統(tǒng)被激活,PRRs識(shí)別病毒后,宿主主要依賴Ⅰ型干擾素和促炎性因子抵御病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pX在LMH細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后,無(wú)論是否被病毒感染,所檢測(cè)干擾素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15)mRNA轉(zhuǎn)錄水平與相應(yīng)對(duì)照組相比均有所提高。pX在LMH細(xì)胞中過(guò)表達(dá)并被病毒感染后,pEF1α-HA-X+與pEF1α-HA-X-組相比,IFN-α、IFN-β和IL-1β轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。IFN-α和IFN-β的功能主要是抑制病毒復(fù)制,IFN-β轉(zhuǎn)錄水平升高與chTLR3轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)這一結(jié)果相呼應(yīng),說(shuō)明本研究結(jié)果可靠,同時(shí)也說(shuō)明pX通過(guò)激活宿主的天然系統(tǒng),提高干擾素轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平來(lái)抑制病毒表達(dá)。IL-1β、IL-6和IL-8屬于炎癥因子,炎癥因子積累有抑制病毒的作用,過(guò)多積累可能導(dǎo)致宿主炎癥損傷和急性死亡,這與Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)pX是誘導(dǎo)LMH壞死的主要因子對(duì)應(yīng),同時(shí)與Li等[26]通過(guò)FAdV-4感染SPF雞檢測(cè)到IL-8表達(dá)水平升高結(jié)果相似,同時(shí)與廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)室課題組前期FAdV-4感染CEF細(xì)胞后,SPF雞的IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18表達(dá)上調(diào)結(jié)果[22]相似。炎癥因子的積累導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡,可能是由于宿主在抑制病毒復(fù)制,也可能是病毒利用宿主細(xì)胞的凋亡來(lái)逃逸天然免疫的攻擊使病毒得于繼續(xù)復(fù)制。這些結(jié)果表明pX在FAdV-4感染過(guò)程激活宿主天然免疫信號(hào)通路起到積極作用。

4 結(jié) 論

在LMH細(xì)胞過(guò)表達(dá)pX并添加FAdV-4感染后,pX能激活宿主免疫應(yīng)答系統(tǒng),Toll樣受體(chTLR2a、chTLR2b和chTLR3)和其效應(yīng)因子(IFN-α、IFN-β和IL-1β)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)以抑制病毒復(fù)制,說(shuō)明pX具備激活宿主細(xì)胞天然免疫系統(tǒng)的功能。